井岡霉素A在玉米幼苗中的吸收機(jī)理初探

張洪珍，樊 娟，趙 微，胡安龍

(1.貴州大學(xué) 作物保護(hù)研究所，貴陽 550025；2貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025)

井岡霉素屬于氨基糖苷類抗生素，是我國科研人員于20世紀(jì)70年代在井岡山地區(qū)分離到的一種吸水鏈霉菌產(chǎn)生的物質(zhì)[1]；含 8種主要活性成分，農(nóng)用井岡霉素中成分 A 的含量最高約占 60%[2]。Gams和VanLaar[3]發(fā)現(xiàn)了井岡霉素能夠抑制62種常見真菌，對植物真菌病害防治具有很好的應(yīng)用前景，尤其是對立枯絲核菌的抗菌活性強(qiáng)，所以井岡霉素自研發(fā)以來常被用于防治由立枯絲核菌造成的農(nóng)作物病害，如水稻紋枯病、玉米紋枯病和棉花立枯病等。據(jù) Asano[4]等和Shigemoto等[5]報(bào)道，井岡霉素A在紋枯病病菌胞內(nèi)會被水解產(chǎn)生井岡羥胺A，井岡羥胺A能抑制真菌內(nèi)海藻糖酶的活性，進(jìn)而影響紋枯病菌的能量代謝活動(dòng)，阻礙病菌從菌絲基部向菌絲頂端運(yùn)送葡萄糖，最終抑制菌絲的生長。

前人研究表明氨基糖苷類抗生素春雷霉素在煙草、玉米中能通過葉片輸導(dǎo)至根部[6]。細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素的攝取是需氧耗能的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，如大腸桿菌對鏈霉素的吸收[7]。目前對氨基糖苷類抗生素的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)研究主要集中在動(dòng)物細(xì)胞及細(xì)菌的吸收，對植物吸收研究很少。關(guān)于井岡霉素的研究主要集中在生物合成[8]、作用機(jī)制[9]、田間防效[10]、殘留[11]等方面，對于井岡霉素A在植株體內(nèi)的內(nèi)吸特性目前尚無相關(guān)研究報(bào)道?；诰畬顾谹與春雷霉素類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，筆者推測它們在植物體內(nèi)具有類似吸收特性，因此以玉米幼苗為研究對象，模擬田間噴霧法，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)探究了玉米幼苗對井岡霉素A的吸收特性及機(jī)理，以期探明該藥劑在玉米中的吸收方式和初步判斷其轉(zhuǎn)運(yùn)基團(tuán)，為田間科學(xué)合理用藥，及為以此基團(tuán)介導(dǎo)的導(dǎo)向農(nóng)藥研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290型高效液相色譜儀、 6470型質(zhì)譜儀(美國Agilent )；ST16RThermo型冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技)；XW-80A 型渦旋混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；CPA225D型電子天平(德國賽多利斯股份公司)。

玉米種子(貴州大學(xué)作物遺傳所贈(zèng)送)；井岡霉素A原藥(98%，阿拉丁試劑有限公司)；氰化羰基間氯苯腙(CCCP)(98%，天津希恩思生化科技有限公司)；二硝基酚(DNP)(98%，麥卡希試劑有限公司)；D-葡萄糖、根皮苷(98%，阿拉丁試劑有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)(98%，天津希恩思生化科技有限公司)均為市售國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；超純水，采用 Millipore Milli-Q (美國密立波公司)系統(tǒng)制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米培養(yǎng)方法

精選適量飽滿的種子(金優(yōu)785)，于28℃條件下用無菌水浸種催芽24 h，然后將種子均勻撒播在土壤表面，覆土，用噴壺灑水浸濕土壤。室內(nèi)培養(yǎng)(光照/黑暗：16 h/8 h)，室溫(25±2) ℃，用加濕器使室內(nèi)濕度保持在85%左右。以培養(yǎng)3周左右的玉米幼苗為供試材料。

1.2.2 施藥方法

98%井岡霉素A以超純水稀釋配制質(zhì)量濃度為0.1 mmol/L的溶液，于玉米幼苗2~3葉時(shí)采用葉面均勻噴霧。以在葉面剛好形成一層藥膜而不流下為宜，噴霧前用保鮮膜包裹根莖部，防止根莖部接觸藥劑。每個(gè)處理重復(fù)3次，以超純水處理玉米為對照，于相同條件溫室培養(yǎng)。在噴藥后12 h，取基部莖于－20 ℃保存，備用。

1.2.3 樣品前處理

稱取2.00 g (精確到0.01 g)已勻質(zhì)化的玉米莖樣品于10 mL離心管中，加入4 mL提取溶液(甲醇∶水為9∶1)，渦旋振蕩提取2~3 min；加入1 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min，于4 000 r/min下離心5 min；取1 mL上清液至2 mL離心管中，加入30 mg PSA，渦旋振蕩30 s，于12 000 r/min下離心5 min；取上層凈化液1 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待HPLC-MS/MS檢測。

1.2.4 不同pH、溫度以及底物濃度對玉米吸收井岡霉素A的影響

⑴ 用檸檬酸和氫氧化鉀將井岡霉素A藥液pH調(diào)至4、5、6、7、8、9 (井岡霉素A藥液最終濃度為0.1 mmol/L)，將上述不同pH的井岡霉素A溶液按照1.2.2節(jié)的方法噴施在玉米幼苗葉片上，12 h后取莖部進(jìn)行測定。

⑵ 將井岡霉素A配制成濃度為0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 mmol/L 6個(gè)濃度梯度(pH=5)，均勻噴于長勢良好的玉米葉片，12 h后取莖部進(jìn)行測定。

⑶ 將井岡霉素A溶液配制成濃度為0.1 mmol/L(pH=5)，于24 ℃與4 ℃環(huán)境條件下噴施在玉米葉片，12、15、18 h后分別取莖部進(jìn)行測定。

1.2.5 能量抑制劑對玉米吸收井岡霉素的影響

分別將含有0.3、0.5、0.7 mmol/L的CCCP和0.1、0.15、0.25 mmol/L的 DNP溶液以及 3、6、9 mmol/L的D-葡萄糖和0.25、0.5、1 mmol/L的根皮苷分別噴于玉米葉片1 h后，再將濃度為0.1 mmol/L井岡霉素A溶液(pH=5)均勻噴于其葉片，室內(nèi)培養(yǎng)12 h后取莖部進(jìn)行測定；探究不同能量抑制劑及競爭性底物對玉米吸收井岡霉素A的影響。

1.3 井岡霉素A的色譜測定條件

液相色譜條件：流速0.15 mL/min，柱溫350 ℃，進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A：0.1%的甲酸水(70%)；B：乙晴(30%)；運(yùn)行時(shí)間5 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧(ESI)離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；碎裂電壓155 V；碰撞能量(CE)：對于 178.1、336.1兩個(gè)子離子分別設(shè)定為25 V、20 V；定性離子對：m/z498.2/178.1、m/z498.2/336.1；定量離子對：m/z498.2/178.1[12]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及添加回收試驗(yàn)

98%井岡霉素A用超純水溶解，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L母液，用超純水稀釋成濃度為0.01、0.625、1.25、2.5、5 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按 1.3節(jié)色譜測定條件測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。空白玉米莖部樣品中加入一定量井岡霉素A 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其添加質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.5 mg/kg，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。按1.2.3節(jié)的方法進(jìn)行樣品前處理，按 1.3節(jié)色譜條件測定，計(jì)算玉米莖部添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5 數(shù)據(jù)處理

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算如下：1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax，式中：V為酶促反應(yīng)速率(mmol/L/h)；Km為米氏常數(shù) (mmol/L)；Vmax為最大酶促反應(yīng)速率(mmol/L/h )；[S]為底物濃度 (mmol/L)。所有試驗(yàn)進(jìn)行多次驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)結(jié)果，每組處理玉米數(shù)為10株，重復(fù)3次。使用DPS10.0，Duncan法對試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。95%的置信區(qū)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義*p＜0.05 和**p＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性、精密度和準(zhǔn)確度

由圖2可知，目標(biāo)檢測物的保留時(shí)間為0.796 min，且附近沒有其他干擾色譜峰。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=4.893 75x+41.548 78，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。由表1可知，在0.05、0.1、0.5 mg/kg添加水平下，井岡霉素A在玉米莖部的平均回收率為91%~93%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%~4.5%，低于10%。按信噪比為3 (S/N=3)計(jì)算檢出限，可得檢出限為0.003 μg/L，表明建立的方法適用于玉米幼苗樣品中井岡霉素 A的檢測。

圖2 井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖(左)及在玉米莖部提取液的典型色譜圖(右)

表1 井岡霉素A在玉米莖部的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2 玉米幼苗吸收井岡霉素A的時(shí)間曲線

為了探究井岡霉素A在玉米中吸收情況，將0.1 mmol/L井岡霉素A藥液按照1.2.2節(jié)的施藥方法，將其均勻噴在玉米葉片上，于3、6、9、12、15、18 h后取樣測定。結(jié)果如圖3所示，在3~12 h內(nèi)井岡霉素A吸收量不斷上升，在12 h達(dá)最大值461.85 μg/L后呈現(xiàn)出下降趨勢，施藥后12 h設(shè)為后期試驗(yàn)取樣時(shí)間。

圖3 玉米葉片吸收井岡霉素A的時(shí)間曲線

2.3 酸堿性對玉米幼苗吸收井岡霉素A影響

農(nóng)藥的吸收受很多因素影響，包括植物表層組織結(jié)構(gòu)、農(nóng)藥分子大小、水溶性離子性和親質(zhì)性及酸堿性。本試驗(yàn)用檸檬酸和KOH將井岡霉素A藥液pH調(diào)至4、5、6、7、8、9。將上述不同pH的井岡霉素A噴于玉米葉片12 h后取樣，以不同pH作為橫坐標(biāo)，井岡霉素A吸收量為縱坐標(biāo)繪圖，見圖4?？梢?，井岡霉素A吸收量隨著其溶液堿性增強(qiáng)而呈逐漸下降趨勢，pH=5時(shí)井岡霉素A的吸收量最大(468.75 μg/L)，后吸收量隨著pH升高而降低，特別是pH=9時(shí)下降到146.92 μg/L，與pH=5時(shí)相差幾乎3倍，說明玉米幼苗吸收井岡霉素A受酸堿性的影響。

圖4 pH對玉米葉片吸收井岡霉素A影響

2.4 溫度對玉米幼苗吸收井岡霉素A的影響

為了進(jìn)一步探明玉米幼苗對井岡霉素A的吸收方式，分別將藥液處理后的玉米置24 ℃和4 ℃下培養(yǎng)12、15、18 h后取樣，檢測玉米莖部井岡霉素A的含量，結(jié)果見圖5?？梢?，2種溫度處理下，井岡霉素A的吸收量都隨著時(shí)間的增加而顯著減少，且最大吸收量都出現(xiàn)在12 h，分別為453.47 μg/L和155.31 μg/L。低溫處理顯著比常溫處理下吸收量低，說明玉米幼苗對井岡霉素A的吸收受溫度影響。

圖5 溫度對玉米葉片吸收井岡霉素A的影響

2.5 濃度對玉米幼苗吸收井岡霉素A的影響

將質(zhì)量濃度分別為0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L的井岡霉素 A藥液噴于玉米12 h后，在玉米基部莖中均能檢測到井岡霉素A，見圖6?？梢姡衩子酌鐚Φ蜐舛?0.031 25~0.125 mmol/L)井岡霉素A吸收成近直線關(guān)系，隨著濃度的升高，吸收速率逐漸下降，0.25 mmol/L時(shí)吸收幾乎達(dá)到飽和。濃度大于0.25 mmol/L時(shí)，吸收曲線呈線性關(guān)系，說明玉米葉片對井岡霉素A的吸收具濃度依賴性，利用 Hill模型計(jì)算得出，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：Km=0.001 mmol/L、Vmax=0.04 mmol/(L/h)，說明玉米幼苗對井岡霉素A的吸收是在低濃度下主動(dòng)運(yùn)輸為主。

圖6 濃度對玉米葉片吸收井岡霉素A的影響

2.6 能量抑制劑對玉米幼苗吸收井岡霉素A的影響

CCCP和DNP作為氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，可抑制線粒體細(xì)胞產(chǎn)生能量(三磷酸腺苷，ATP)，是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能量抑制劑，可用作進(jìn)一步確認(rèn)玉米幼苗對井岡霉素A吸收是否為耗能主動(dòng)運(yùn)輸?shù)囊罁?jù)。試驗(yàn)結(jié)果見圖7，由圖7可知，加了能量抑制劑的兩組處理與未加的空白對照相比，處理12 h后，對照處理吸收量高達(dá)453.47 μg/L，而加入能量抑制劑的兩組處理最低吸收量分別為180.26 μg/L和294.16 μg/L。井岡霉素A的吸收量都受到了顯著抑制，最大濃度處理組抑制作用分別達(dá)60.25%、35.13%，說明玉米葉片吸收井岡霉素A是耗能過程。

圖7 能量抑制劑(CCCP、DNP)對玉米葉片吸收井岡霉素A的影響

2.7 競爭性底物對玉米葉片吸收井岡霉素A的影響

由圖8可知，加入D-葡萄糖處理與空白對照相比，井岡霉素A吸收量受到了明顯的抑制，從453.47 μg/L降低至378.01、330.97、261.85 μg/L，抑制率分別為16.64%、27.01%、42.26%。加入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的競爭性抑制劑根皮苷后，井岡霉素A吸收量也受到了顯著的抑制，分別降低至283.94、228.72、150.00 μg/L，抑制率分別為37.39%、49.56%、66.87%，說明玉米對井岡霉素A吸收有單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與。

圖8 競爭性底物(根皮苷、D-葡萄糖)對玉米葉片吸收井岡霉素A的影響

3 討論與結(jié)論

根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)原理，Vmax表示載體飽和時(shí)所能達(dá)到的最大吸收速率，其值愈大，表示其吸收離子的潛力愈大；Km為載體對吸收離子親和力的倒數(shù)，其值愈小表示植物對外源物質(zhì)的親和力就越大[13]。本研究結(jié)果表明玉米葉片對井岡霉素A的吸收在一定時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間增加呈先增后降，且具有濃度梯度依賴性，不同底物濃度呈現(xiàn)不同吸收速率。玉米葉片對低濃度(0.03125~0.125 mmol/L)井岡霉素A的吸收具有飽和性，0.25 mmol/L時(shí)幾乎達(dá)飽和，高濃度下(0.5~1.0 mmol/L)，吸收曲線呈線性關(guān)系，其吸收符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型，得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Km=0.001 mmol/L，Vmax=0.04 mmol/(L/h)。主動(dòng)吸收是一個(gè)耗能過程，需要電化學(xué)勢質(zhì)子梯度和ATP結(jié)合蛋白-載體，或是受H+-ATP泵驅(qū)動(dòng)的過程[14]。溫度是影響酶和載體活性的重要因素[15-16]，低溫通過降低合成ATP所需的線粒體ATPase和丙酮酸激酶的活性，而使腺苷酸，尤其是ATP水平明顯下降，從而導(dǎo)致代謝過程發(fā)生紊亂，使ATP的利用速度明顯超過合成速度。陸守昆等[17]發(fā)現(xiàn)低溫能抑制小麥對菲的主動(dòng)吸收。相關(guān)研究表明，作物在24 ℃下對農(nóng)藥的吸收量與4 ℃下的吸收量之比Q10值小于或大于2.0，可作為判斷作物對農(nóng)藥的吸收是與生物代謝有直接聯(lián)系還是屬于被動(dòng)物理過程的標(biāo)準(zhǔn)[18]。本研究結(jié)果顯示玉米葉片對井岡霉素A的吸收對溫度和pH都敏感，在4 ℃、24 ℃，井岡霉素A吸收量顯著不同，各處理組的Q10值均大于2，與前人研究結(jié)果一致，說明玉米葉片對井岡霉素A的吸收屬于主動(dòng)過程，可以判斷其吸收有轉(zhuǎn)運(yùn)載體的參與。沈靜等[19]研究得出不同 pH直接影響玉米細(xì)胞質(zhì)子泵基因表達(dá)，并間接影響到玉米對外源物吸收。Michelet等[20]研究發(fā)現(xiàn)植物質(zhì)膜ATPase活性存在一個(gè)最適pH。pH會導(dǎo)致質(zhì)子濃度發(fā)生改變，而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大多是質(zhì)子濃度驅(qū)動(dòng)型[21]。本研究發(fā)現(xiàn)pH的變化對作物吸收井岡霉素的影響較大，在pH=5時(shí)的吸收量468.75 μg/L是pH=9時(shí)的3倍，推測玉米葉片吸收井霉素A有單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與。

CCCP是一種解偶聯(lián)劑，其是否能夠影響植株對某種化合物的吸收，作為判斷該吸收過程需要能量與否的標(biāo)志[22]。趙俊龍等[23]發(fā)現(xiàn)能量抑制劑CCCP對甘氨酸-氟蟲腈具有顯著抑制效果。胡安龍等[24]曾在煙草細(xì)胞吸收春雷霉素研究中使用了能量抑制劑(CCCP)，證明了煙草細(xì)胞吸收春雷霉素是耗能的過程。Hetherington等[25]的研究表明，玉米和大豆懸浮細(xì)胞對外界低濃度除草劑草甘膦的吸收屬于主動(dòng)吸收，該吸收過程受CCCP所抑制。氧化磷酸化抑制劑 2,4-二硝基苯酚(DNP)抑制了植物對碘酸鹽的吸收[26]，DNP對鉀和鈉離子的吸收敏感。DNP和CCCP能明顯抑制細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素的吸收，表明其吸收是耗能的主動(dòng)吸收[27]。本試驗(yàn)用氧化磷酸化抑制劑DNP和能量抑制劑CCCP對玉米處理后噴藥，結(jié)果與前人一致，玉米葉片對井岡霉素A的吸收都被抑制，表明玉米葉片吸收井岡霉素A需要能量。葡萄糖是動(dòng)植物等細(xì)胞所必需的代謝物質(zhì)，根皮苷是鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的競爭性抑制劑，能抑制糖的吸收，董華強(qiáng)等人研究發(fā)現(xiàn)根皮苷對糖尿病小鼠有顯著降血糖血脂效果，因?yàn)楦ぼ漳苡行У匾种破咸烟菂f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT1/SGLT2)對葡萄糖分子的運(yùn)輸[28]。所以采用根皮苷和D-葡萄糖處理后，再進(jìn)行井岡霉素A藥劑噴施，發(fā)現(xiàn)井岡霉素A的吸收量受到顯著抑制，由此推測D-葡萄糖的加入對玉米吸收井岡霉素A產(chǎn)生了競爭，可初步判斷這與井岡霉素A本身化學(xué)結(jié)構(gòu)中的D型葡萄糖基團(tuán)有關(guān)，且進(jìn)一步佐證此吸收過程有單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與。

井岡霉素A噴施于玉米葉面上后，具有向基傳導(dǎo)能力，且玉米葉片對藥劑的吸收受低溫、CCCP、DNP、pH、D-葡萄糖和根皮苷等的影響，且是一個(gè)由載體蛋白介導(dǎo)的主動(dòng)吸收過程。2004年有人提出農(nóng)藥有效活性成分與導(dǎo)向載體偶聯(lián)后能在植物體內(nèi)向定向累積的導(dǎo)向農(nóng)藥概念[29]，井岡霉素A化學(xué)結(jié)構(gòu)包含有效氧胺A基團(tuán)和D-葡萄糖基團(tuán)，井岡霉素能在D-葡萄糖基團(tuán)的介導(dǎo)下先進(jìn)入真菌細(xì)胞，而有效氧胺A基團(tuán)隨之進(jìn)入真菌細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[44]。本研究結(jié)果與之一致，可初步判斷D-葡萄糖基團(tuán)對玉米葉片吸收井岡霉素A起重要作用，這不僅為井岡霉素A防治作物根部病害提供科學(xué)依據(jù)，而且還可為植物中具有雙向輸導(dǎo)和靶向積累性、以D-葡萄糖為導(dǎo)向基團(tuán)的新農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)和合成提供理論支撐。