不同沉淀劑對(duì)酚抽法提取植物蛋白質(zhì)效果比較分析

霍玉鑫，甘番露，王玉晶，張雪妍，王旭初，謝全亮

摘? 要：酚抽法已經(jīng)逐漸成為植物蛋白質(zhì)組研究中通用的蛋白質(zhì)提取方法，但在各種改進(jìn)酚抽法中，應(yīng)用到的沉淀試劑各不相同，致使蛋白沉淀得率、純度和沉淀時(shí)間也各異，本研究以熱帶植物橡膠樹葉片、膠乳和海馬齒葉片為研究材料，在過飽和硫酸銨甲醇溶液、醋酸氨甲醇溶液和丙酮溶液沉淀劑下對(duì)比蛋白提取的效果，通過單向電泳檢測、膠圖質(zhì)量分析、質(zhì)譜鑒定、蛋白沉淀時(shí)間和得率比較，發(fā)現(xiàn)3種沉淀劑提取的蛋白樣品1-DE圖譜顯示的蛋白條帶數(shù)量均較多，但醋酸銨沉淀法提取蛋白圖譜有條紋不清晰現(xiàn)象。得出結(jié)論：丙酮沉淀法對(duì)橡膠樹葉片和膠乳蛋白質(zhì)的提取率較高，硫酸銨沉淀法對(duì)海馬齒葉片蛋白質(zhì)提取率較高。過飽和硫酸銨甲醇溶液和丙酮沉淀劑提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量較高，所得蛋白圖譜背景清晰，質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)信息量大。研究結(jié)果可優(yōu)化提取高質(zhì)量植物蛋白質(zhì)的方法，并有望為頑拗類植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：蛋白提取;橡膠樹;海馬齒;沉淀劑;聚丙烯凝膠電泳;質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：TQ936? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Comparative Analysis of the Effects of Different Precipitation Agents on Extraction of Plant Protein by Phenol Extract

HUO Yuxin1， GAN Panlu1， WANG Yujing1， ZHANG Xueyan1， WANG Xuchu1，2*， XIE Quanliang1，2*

1. Hainan Normal University / Key Laboratory of Tropical Island Ecology， Ministry of Education， College of Life Sciences， Haikou， Hainan 571158， China; 2. College of Life Science and Agricultural， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832003， China

Abstract： The borax/PVPP/phenol （BPP） protocol is a widespread protein extraction method in plant proteome research. However， BPP extraction of plant protein， combined with different precipitation agents， the precipitation time， yield and purity of extracted protein is strikingly different. In this study， Sesuvium portulacastrum and Para-rubber tree leaves， and rubber latex were used as the research materials. The plant protein was extracted and analyzed with precipitating agents of supersaturated potassium ammonium sulfate alcohol solution， ammonium acetate methanol solution and acetone solution. Using the methods of SDS-PAGE， gel electrophoresis image quality， mass spectrum identification， settling duration and comparative analysis of protein yield， it was showed that the protein bands extracted by the ammonium acetate precipitation method were not evident. Hevea leaves and latex showed a higher yield of protein in acetone solution. S. portulacastrum leaves had a higher yield of protein in supersaturated potassium ammonium sulfate alcohol solution. The clear background of gel electrophoresis figures was found for the supersaturated potassium ammonium sulfate ethanol solution and acetone solution. The comprehensive protein sequence information identified by mass spectrometry had a higher quality of precipitated protein. The research results can optimize the method of extracting high-quality plant protein， and it will be expected to provide references for recalcitrant plant taxa proteomics research in the future.

Keywords： protein extraction; Hevea brasiliensis; Sesuvium portulacastrum; precipitant; polypropylene gel electrophoresis; mass spectrometry

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.035

從植物組織中制備高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，而蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)發(fā)展成為研究植物蛋白功能的重要技術(shù)手段[1-2]，是一種檢測植物基因在轉(zhuǎn)錄后是否被翻譯和修飾等較新穎且有效的研究植物蛋白的方法，從而填補(bǔ)了從轉(zhuǎn)錄組到代謝組的中間空缺[3-5]。目前，蛋白組學(xué)的研究技術(shù)方法有很多，例如2-DE[6]、MALDI[7]、Label-free[8]和iTRAQ/TMT[9]等技術(shù)，被廣泛用于研究某種特定生理環(huán)境下動(dòng)植物的全蛋白、差異表達(dá)水平以及互作分析等。但由于植物各種組織細(xì)胞中含有特定的物質(zhì)能夠降低提取蛋白的質(zhì)量及產(chǎn)率，所以無法提取固定得率的蛋白質(zhì)，需要針對(duì)特定的材料采取特定的提取處理方法[10-11]，從而提高提取植物蛋白質(zhì)的質(zhì)量，這也是決定蛋白質(zhì)組學(xué)后續(xù)比較分析的關(guān)鍵因素。

由于植物組織的特殊特性，通常因堅(jiān)固的細(xì)胞壁、蛋白酶、大的液泡、高濃度的有機(jī)酸和次級(jí)代謝產(chǎn)物（酚類化合物和色素）等物質(zhì)，嚴(yán)重干擾蛋白質(zhì)的提取、分離和鑒定，致使從植物各組織中分離蛋白質(zhì)組分具有很大的挑戰(zhàn)性，也是影響植物蛋白組學(xué)研究最關(guān)鍵因素[12-14]。利用酚抽法可用于頑拗類植物組織中蛋白質(zhì)提取[15]，但提取蛋白的得率還需進(jìn)一步提升。針對(duì)木本植物橡樹、松樹和楊樹的次生木質(zhì)部總蛋白提取，發(fā)現(xiàn)使用優(yōu)化的TCA-丙酮方法，提取蛋白質(zhì)效果最佳[16]。在挪威針云杉和歐洲山毛櫸的葉和根中分離蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在包含7 mol/L尿素和2 mol/L硫脲的分離液劑下提取和分離蛋白質(zhì)最佳[17]，但提取方法中并未涉及沉淀劑的深入討論。在谷物種子中用不同緩沖液可以分離出種子內(nèi)不同蛋白質(zhì)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究[18]，其在沉淀劑選擇上并未改進(jìn)。以三氯乙酸、丙酮沉淀和苯酚提取黃連木的雄性和雌性植物蛋白質(zhì)比較研究，詳細(xì)描述了這3種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用，使研究者能為特定的物種、組織或細(xì)胞類型選擇合適的方法[19]，但是在沉淀劑的選擇方面也未深入研究。在模式植物擬南芥中提取總蛋白時(shí)，可用常規(guī)溶解劑就能溶解一系列蛋白質(zhì)，并實(shí)現(xiàn)其高效定量的回收，使用這種方法可用于試劑盒直接定量[20]，但并非綠色植物都可以使用該方法。隨后，F(xiàn)lengsrud[21]在大麥葉、馬鈴薯葉和云杉針葉組織中提取蛋白質(zhì)，克服了綠色植物中固有的蛋白質(zhì)組學(xué)分析障礙，但在蛋白質(zhì)的產(chǎn)率和純化方面還有待優(yōu)化。綜上所述，在植物蛋白提取方法不斷更新過程中，蛋白得率和質(zhì)量是影響蛋白組學(xué)深入研究的主要因素，針對(duì)這方面的困難應(yīng)著眼于在提取不同植物組織蛋白質(zhì)過程中，如何選取最佳沉淀劑，從而獲得純度較高的蛋白質(zhì)。

在筆者前期的研究中，發(fā)現(xiàn)利用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)酚抽法（Borax/PVPP/Phenol，BPP）提取橡膠樹以及海馬齒組織蛋白的得率以及質(zhì)譜鑒定結(jié)果相差都非常大，難以進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究。因此，為了克服上述困難，我們選擇了巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）的葉片和膠乳（含多糖多酚類物質(zhì)）以及高含鹽海岸植物海馬齒（Sesuvium portulacastrum L.）的葉片材料特殊性，提供了一種輔助蛋白質(zhì)提取方法，首次針對(duì)這3種材料在BPP提取緩沖液結(jié)合過飽和硫酸銨甲醇溶液、醋酸銨溶液和丙酮溶液3種沉淀劑展開了蛋白提取方法的研究，在蛋白得率、凝膠圖譜和質(zhì)譜鑒定等方面系統(tǒng)分析。通過實(shí)驗(yàn)表明，針對(duì)不同植物材料選擇不同沉淀劑的方法，確實(shí)對(duì)植物蛋白質(zhì)提取很有效，并且同時(shí)適用于聚丙烯凝膠電泳及質(zhì)譜分析的2種蛋白組學(xué)分析手段。為采用BPP法提取不同植物蛋白時(shí)選擇合適的沉淀劑提供理論支持，也為今后植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)田內(nèi)橡膠樹（‘熱研73-3-97）新鮮葉片（Hevea leaves，HL）、橡膠樹新鮮膠乳（latex，LA）以及番杏科多年生匍匐草本植物海馬齒新鮮葉片（Sesuvium leaves，SL）為實(shí)驗(yàn)材料。橡膠樹切割先讓膠乳流25滴以上，流盡樹皮表面的雜質(zhì)后開始取樣，取樣用的割刀需要高溫灼燒消毒滅菌后使用，以免引起H. brasiliensis死皮病。用植物蛋白質(zhì)BPP法（Borax/PVPP/Phenol）提取蛋白。BPP蛋白提取緩沖液配置：100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris， 50 mmol/L維生素C，50 mmol/L硼砂，1%（V/V）Triton X-100，1 g（W/V）PVPP，30%（W/V）蔗糖和2%（V/V）β-巰基乙醇，pH 8.0;蛋白裂解液：1%（V/V）IPG buffer，2 mol/L硫脲，2%（W/V）CHAPS，7 mol/L尿素，13 mmol/L DTT;標(biāo)準(zhǔn)Laemmli buffer：0.001%（W/V）溴酚藍(lán)，2%（W/V）SDS，5%（V/V）β-巰基乙醇，10%甘油，62.5 mmol/L Tris-HCl;膠條平衡液：0.002%（W/V）溴酚藍(lán)，2%（W/V）SDS，30%（V/V）甘油，50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L尿素;GAP凝膠染色液：0.125%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250，5%（V/V）磷酸，10% （W/V）硫酸銨，10%（V/V）甲醇，30%（V/V）乙醇;凝膠脫色液：5%（V/V）乙酸，30%（V/V）乙醇;胰蛋白酶緩沖液;25 mmol/L碳酸氫銨，1 mmol/L氯化鈣，pH 8.5。

1.2? 方法

1.2.1? 植物蛋白的提取? 采集植物組織后，立即浸入液氮預(yù)冷研缽中速凍，并加入1% PVPP粉末防止氧化，充分研磨成干粉后，稱取3 g植物組織粉末，加入盛有10 mL預(yù)冷BPP提取緩沖液50 mL離心管中，室溫渦旋震蕩10 min。加入等體積Tris飽和酚，室溫渦旋震蕩10 min。用BPP提取緩沖液配平，4 ℃，16 000 ×g，離心15 min。吸取上清液于新的50 mL離心管中，再次加入等體積BPP提取緩沖液，4 ℃渦旋震蕩5 min。再次加入BPP提取緩沖液配平，4 ℃，16 000 ×g，離心15 min。取上清液1 mL，分裝入含有5 mL不同沉淀劑的10 mL離心管中，不同沉淀劑為：（1）預(yù)冷的過飽和硫酸銨甲醇溶液（supersaturated ammonium sulfate methanol，SAM）可使蛋白質(zhì)溶解性變小產(chǎn)生物理沉淀，稱為蛋白質(zhì)“鹽析”現(xiàn)象。（2）丙酮溶液（acetone solution， AS）通過有機(jī)溶劑丙酮溶液破壞蛋白質(zhì)的水化層，降低介電常數(shù)，從而增強(qiáng)帶電蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，促進(jìn)蛋白顆粒聚集沉淀。為避免蛋白變性，丙酮溶液需要低溫且操作時(shí)間盡量縮短;（3）預(yù)冷0.1 mm/L的乙酸銨溶液（ammonium acetate solution，AA）中性鹽減少蛋白質(zhì)變性，但可破壞蛋白質(zhì)的水化膜，暴露出憎水區(qū)域，使蛋白質(zhì)聚集沉淀，憎水區(qū)的多少?zèng)Q定沉淀量。沉淀劑均為上清液體積的5倍即：蛋白提取上清液/沉淀劑= 1/5，置于?20 ℃過夜沉淀。

1.2.2? 蛋白定量? 采用Bradford方法蛋白定量，Bradford定量液：0.05 g CBB G-250，95%乙醇25 mL，50 mL 85%磷酸，超純水定容至500 mL，濾紙過濾使用。在測定樣品濃度前，先制作標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品要置于冰上保持低溫，準(zhǔn)備牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白（bull serum albumin，BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，裂解液lysis buffer（LB），紫外分光度儀器設(shè)定測樣品蛋白OD595，測定每個(gè)樣品至少重復(fù)3次。

1.2.3? SDS-PAGE凝膠電泳染色和圖像采集? 使用不連續(xù)膠聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法根據(jù)分子量大小對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%。25 μL蛋白質(zhì)樣品上樣體積：20 μL（V樣品+VLB）+5 μL蛋白loading buffer，marker：10 μL，蛋白質(zhì)量約為30 μg，與Laemmli buffer混勻后上樣。電泳在16 ℃恒溫水浴下進(jìn)行，電泳程序設(shè)定：10 W、40 min，20 W、1.2 h。

凝膠染色：考馬斯亮藍(lán)G-250染色液按照標(biāo)準(zhǔn)化配方提前一天配制。漂洗后的凝膠轉(zhuǎn)入染色液中，搖床低速30 r/min染色過夜。

脫色：脫色液標(biāo)準(zhǔn)化配方現(xiàn)用現(xiàn)配。取出染色好的凝膠放入蒸餾水漂洗5 min，轉(zhuǎn)入脫色液中，按照標(biāo)準(zhǔn)化試劑配方中的方法進(jìn)行脫色過程。

凝膠分析：脫色后的凝膠用ImageScanner Ⅲ掃描儀（GE Healthcare）進(jìn)行掃描和圖像采集掃描凝膠，掃描時(shí)保證圖片分辨率，并保存。利用ImageMaster 5.0軟件分析蛋白電泳圖譜條帶數(shù)。

1.2.4? 凝膠膠內(nèi)蛋白酶解? 選取目標(biāo)差異蛋白，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，胰蛋白酶液與含有蛋白的凝膠?；旌虾螅?7 ℃恒溫水浴，酶解15 h。酶解后收集酶解上清液直接用于質(zhì)譜鑒定。

1.2.5? 質(zhì)譜鑒定及蛋白數(shù)據(jù)庫搜索? 將上述酶解產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，采用的是布魯克公司基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（5800 MALDI- TOF Bruker），進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分析。所獲得的蛋白數(shù)據(jù)通過Mascot Distiller軟件分析肽的指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF）得出結(jié)果，再利用Matrix Science網(wǎng)站（http：//www. matrixscience.com）進(jìn)行蛋白肽段匹配和數(shù)據(jù)庫搜索鑒定。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 橡膠樹葉片、膠乳和海馬齒葉片的總蛋白提取

酚抽法是植物蛋白提取的常用方法，而BPP法是本實(shí)驗(yàn)室在此法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化改良的一種高效蛋白提取方法，既適于從多糖多酚類及高鹽分含量的植物材料的蛋白質(zhì)提取，還可用于頑拗植物獲得較高產(chǎn)量蛋白。利用BPP法可在橡膠樹新鮮葉片、新鮮膠乳和海馬齒新鮮葉片中提取到3～10 mg/g不等的總蛋白，針對(duì)這3種材料，我們?cè)O(shè)計(jì)3種蛋白質(zhì)沉淀劑，蛋白質(zhì)提取過程（圖1）。

在不同沉淀劑下提取總蛋白得率結(jié)果顯示，每克材料的蛋白得率偏差比較大，其中HL在不同沉淀劑下的得率大小順序?yàn)椋篈S-HL（10.64± 0.06 mg/g）> SAM-HL（5.10±0.06 mg/g）>AA-HL（3.09±0.01 mg/g）;LA的總蛋白得率在不同沉淀劑下的大小順序?yàn)椋篈S-LA（5.35±0.02 mg/g）> AA-LA（4.43±0.02 mg/g）>SAM-LA（3.386± 0.08 mg/g）;SL總蛋白得率大小順序?yàn)椋篠AM-SL（6.385±0.06 mg/g）>AA-SL（5.371±0.04 mg/g）> AS-SL（1.959±0.04 mg/g）。比較結(jié)果顯示，HL總蛋白得率在AS得率最高;LA在AS沉淀時(shí)總蛋白得率最高，SL在SAM沉淀劑下蛋白得率最高（圖2）。

2.2? 聚丙烯酰氨凝膠電泳分析

從SDS-PAGE的結(jié)果可以看出，經(jīng)過除雜后的蛋白條帶邊界輪廓清晰，凝膠圖背景干凈，分離效果好，并未出現(xiàn)條帶拖尾和彌散不均的現(xiàn)象（圖3）。

在高分子量（>100 kDa）區(qū)域和較低分子量（<20 kDa）區(qū)域均可監(jiān)測到明顯的蛋白條帶。應(yīng)用ImageMaster 5.0軟件對(duì)1-DE圖譜進(jìn)行蛋白的條帶統(tǒng)計(jì)分析，不同沉淀劑下的結(jié)果檢測出不同數(shù)目的蛋白條帶（表1）。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)蛋白條帶結(jié)果顯示，SAM沉淀劑下的平均條帶較多（39±1.41），?其次，AS沉淀劑下的平均蛋白條帶（36±1.41），蛋白條帶最少的是AA的1-DE平均蛋白條帶較少（29±2.42）。而且橡膠樹葉片和海馬齒葉片組織的蛋白條帶具有相似的圖譜，在條帶數(shù)和個(gè)別條帶在豐度上出現(xiàn)一定的差異。

2.3? 蛋白膠內(nèi)酶解及MALDI TOF質(zhì)譜分析

挖取凝膠上各選取12個(gè)重復(fù)性好、分離性好、相對(duì)豐度較高且是已知具有代表性蛋白進(jìn)行膠內(nèi)酶解，其中包括二磷酸核酮糖羧化 （ribulose bisphosphate carboxylase，RubisCO）、小橡膠粒子（small rubber particle protein，SRPP）和橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF），利用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)后報(bào)道的蛋白酶解方法進(jìn)行膠內(nèi)酶解，隨后進(jìn)行MALDI TOF 5800質(zhì)譜儀進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜鑒定，經(jīng)鑒定獲得了較好的PFF和PMF質(zhì)譜圖譜（圖4）。鑒定到的蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)搜庫，由于熱帶植物海馬齒還未發(fā)表基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)專有的蛋白數(shù)據(jù)庫，因此將質(zhì)譜鑒定結(jié)果通過Mascot Distiller軟件分析，隨后用Matrix Science在NCBInr中的（NCBI-National center for biotechnology information non-redundant database）綠色植物蛋白總庫，利用在線引擎（http：//www.matrixscience.com/ search）進(jìn)行搜索，經(jīng)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜鑒定特定標(biāo)記性蛋白，共鑒定了36個(gè)蛋白質(zhì)，從所得的PMF一級(jí)質(zhì)譜圖譜上看，主要肽段質(zhì)譜離子峰集中范圍在800～ 2500 m/s之間，這說明在這個(gè)酶切片段更加有利于下一步二級(jí)質(zhì)譜分析。并說明提取蛋白中含雜質(zhì)少，無其他蛋白污染。這些特定蛋白的總肽段數(shù)在10～62左右，最高可達(dá)到62條（表2），并且Trypsin的自切峰強(qiáng)度較低，該方法中酶切充分，不易自切。由于熱帶典型海岸植物海馬齒沒有發(fā)表基因組及對(duì)應(yīng)的蛋白數(shù)據(jù)庫，因此，質(zhì)譜鑒定結(jié)果通過Mascot Distiller分析，鑒定后統(tǒng)計(jì)了蛋白理論等電點(diǎn)和分子量，蛋白實(shí)驗(yàn)等電點(diǎn)和分子量，匹配肽段的數(shù)量，覆蓋率和得分等情況。

利用Matrix Science 搜索引擎對(duì)鑒定的蛋白及肽段搜庫匹配，36個(gè)蛋白點(diǎn)相關(guān)信息，統(tǒng)計(jì)可信蛋白理論等電點(diǎn)和蛋白分子量與實(shí)驗(yàn)測定的蛋白等電點(diǎn)和蛋白分子量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)測定值和理論值基本一致，有小部分蛋白的實(shí)驗(yàn)等電點(diǎn)與分子量和理論值有偏差，例如A4-1，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白的分子量有偏差，經(jīng)理論分析這些蛋白可能是某些蛋白的亞基結(jié)構(gòu)，在生物學(xué)功能的蛋白組成中，通常都是由多個(gè)亞基組合而成，這些蛋白主要參與翻譯后修飾無機(jī)離子和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，分子伴侶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝通路的作用產(chǎn)生了蛋白結(jié)構(gòu)變化。通過變性凝膠電泳將蛋白亞基結(jié)構(gòu)分離，因此，鑒定蛋白的實(shí)驗(yàn)等電點(diǎn)和分子量會(huì)出現(xiàn)一定范圍內(nèi)的偏移現(xiàn)象。根據(jù)蛋白搜庫結(jié)果顯示，HL和SL在SAM沉淀劑下肽段匹配數(shù)和覆蓋率質(zhì)量高于AA和AS沉淀劑的質(zhì)量;LA蛋白提取在AA沉淀劑下的蛋白質(zhì)量優(yōu)于SAM和AS沉淀劑提取的蛋白質(zhì)量。

3? 討論

幾十年來，已在許多植物物種中進(jìn)行了大量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但是植物蛋白質(zhì)提取的質(zhì)量高低仍然是影響蛋白質(zhì)組學(xué)研究最重要因素[19]。

聚丙烯凝膠電泳一直是一種最廣泛用于分離總蛋白的工具提取物以及從各種途徑獲得的蛋白質(zhì)級(jí)分預(yù)分餾程序[12]。為了獲得高質(zhì)量高純度的植物蛋白質(zhì)，我們基于BPP緩沖液結(jié)合3種沉淀劑，提取了橡膠樹和海馬齒等組織的蛋白質(zhì)，相比較兩者的蛋白得率和質(zhì)量差異較大，但是蛋白質(zhì)圖譜與前期橡膠樹和海馬齒蛋白圖譜非常不同。與前期研究中的凝膠圖譜相比[22-24]，我們的凝膠圖譜更清晰，并且包含更多的蛋白條帶。在鑒定代表性蛋白質(zhì)中，相同蛋白質(zhì)包含不同的蛋白質(zhì)同工型，在凝膠圖譜上也具有不同的實(shí)驗(yàn)Mr和pI值，分析原因可能是由于修飾蛋白質(zhì)變形后所致。

在過去的植物蛋白提取方法的研究中，針對(duì)提取緩沖液的改進(jìn)優(yōu)化研究較多，例如在植物葉片[13， 15-17， 20， 25-26]、種子[18， 21， 27]、根[28]以及花器官[12， 19]等，但是著眼于研究植物蛋白提取過程中沉淀劑的選擇方面涉及內(nèi)容較少。我們比較3種沉淀劑的蛋白得率和質(zhì)譜鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HL和SL在SAM沉淀劑提取蛋白質(zhì)量優(yōu)于其他2種沉淀劑;LA的蛋白提取在AA的蛋白質(zhì)量優(yōu)于其它兩個(gè)沉淀劑提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量。而通過硫酸銨和醋酸銨比例的優(yōu)化，可以限制蛋白變性并能提高蛋白質(zhì)提取的質(zhì)量[22]，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果保持一致，但該方法并未在高鹽生植物蛋白提取中應(yīng)用。聚丙烯酰胺凝膠電泳可比較3種沉淀劑提取蛋白質(zhì)的質(zhì)量[29-30]，雖然3種沉淀劑的蛋白質(zhì)圖譜在較高和較低的Mr區(qū)域均可觀察到了明顯的蛋白條帶，且大部分相似，但是標(biāo)記性蛋白條帶的清晰度和灰度有明顯的差異。李肖芳等[31]利用3種方法對(duì)鹽生植物鹽角草的蛋白提取，其中丙酮沉淀和三氯乙酸沉淀提取的蛋白雜質(zhì)較多，在蛋白凝膠圖中有嚴(yán)重拖尾或橫向紋理現(xiàn)象。而本研究的凝膠圖譜結(jié)果可見更清晰的蛋白條帶，說明選取合適的蛋白沉淀劑可以獲得更高純度的蛋白質(zhì)。從總體上看，BPP方法可以收集到低濃度的蛋白質(zhì)，并且獲得的蛋白質(zhì)可以成功用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。本研究結(jié)果也說明，BPP方法結(jié)合不同沉淀劑可獲得更多多糖多酚植物和高鹽鹽生植物高質(zhì)量的蛋白質(zhì)，保證能夠提取低濃度溶液中的蛋白質(zhì)。迄今為止，這3種沉淀劑之間蛋白得率及提取蛋白質(zhì)量進(jìn)行比較研究還尚未報(bào)道，本研究是首次提出BPP方法結(jié)合不同沉淀劑進(jìn)行蛋白提取分析的研究。

綜上所述，BPP方法結(jié)合3種沉淀劑的使用，具有被廣泛應(yīng)用的潛力，還可用于低蛋白濃度溶液的植物蛋白質(zhì)組學(xué)分析。學(xué)者可根據(jù)研究材料選擇最適沉淀劑提取蛋白，這對(duì)于不同植物提取高純度和高質(zhì)量的蛋白質(zhì)極其重要，也為植物蛋白組學(xué)獲取高質(zhì)量蛋白提供一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Thiellement H， Bahrman N， Damerval C， et al. Proteomics for genetic and physiological studies in plants[J]. Electrophoresis， 1999， 20： 2013-2026.

[2] Wang X. Protein and proteome atlas for plants under stresses： New highlights and ways for integrated omics in post-geno?m?ics era[J]. International Journal of Molecule Sciences， 2019， 20（20）： 5222.

[3] Parkhey S， Chandrakar V， Naithani S C， et al. Efficient extraction of proteins from recalcitrant plant tissue for subsequent analysis by two-dimensional gel electrophoresis[J]. Journal of Separation Science， 2015， 38： 3622-3628.

[4] Gallardo K， Job C， Groot S P， et al. Proteomic analysis of Arabidopsis seed germination and priming[J]. Plant Physiology， 2001， 126： 835-848.

[5] Hoa le T P， Nomura M， Kajiwara H， et al. Proteomic analysis on symbiotic differentiation of mitochondria in soybean nodules[J]. Plant Cell Physiology， 2020， 45： 300-308.

[6] Rabilloud T. How to use 2D gel electrophoresis in plant proteomics[J]. Methods Molecule Biology， 2014， 1072： 43-50.

[7] Yang H， Liu N， Liu S. Determination of peptide and protein disulfide linkages by MALDI mass spectrometry[J]. Topics in Current Chemistry， 2013， 331： 79-116.

[8] Nahnsen S， Bielow C， Reinert K， et al. Tools for label-free peptide quantification[J]. Molecular and Cellular Proteomics， 2013， 12： 549-556.

[9] Merrill A E， Coon J J. Quantifying proteomes and their post-translational modifications by stable isotope label-based mass spectrometry[J]. Current Opinion in Chemical Biology， 2013， 17： 779-786.

[10] Righetti P G， Boschetti E. Low-abundance plant protein enrichment with peptide libraries to enlarge proteome coverage and related applications[J]. Plant Science， 2020， 290： 110302.

[11] Potin F， Lubbers S， Husson F， et al. Hemp （Cannabis sativa L.） protein extraction conditions affect extraction yield and protein quality[J]. Journal of Food Science， 2019， 84（12）： 3682-3690.

[12] Wang W， Tai F， Chen S. Optimizing protein extraction from plant tissues for enhanced proteomics analysis[J]. Journal of Separation Science， 2008， 31（11）： 2032-2039.

[13] Chapman B， Castellana N， Apffel A， et al. Plant proteogenomics： from protein extraction to improved gene predictions[J]. Methods in Molecular Biology， 2013， 1002： 267-294.

[14] Rode C， Winkelmann T， Braun H P， et al. DIGE analysis of plant tissue proteomes using a phenolic protein extraction method[J]. Methods in Molecular Biology， 2012， 854： 335-342.

[15] Wang W， Vignani R， Scali M， et al. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis[J]. Electrophoresis， 2006， 27（13）： 2782-2786.

[16] Plomion C， Lalanne C. Protein extraction from woody plants[J]. Methods in Molecular Biology， 2007， 355： 37-41.

[17] V?lcu C M， Schlink K. Efficient extraction of proteins from woody plant samples for two-dimensional electrophoresis[J]. Proteomics， 2006， 6（14）： 4166-4175.

[18] Branlard G， Bancel E. Protein extraction from cereal seeds[J]. Methods in Molecular Biology， 2007， 355：15-25.

[19] Wu X， Gong F， Wang W. Protein extraction from plant tissues for 2DE and its application in proteomic analysis[J]. Proteomics， 2014， 14（6）： 645-658.

[20] Conlon H E， Salter M G. Plant protein extraction[J]. Methods in Molecular Biology， 2007， 362： 379-383.

[21] Flengsrud R. Protein extraction from green plant tissue[J]. Methods in Molecular Biology， 2008， 425： 149-152.

[22] Wang X C， Shi M J， Lu X L， et al. A method for protein extraction from different subcellular fractions of laticifer latex in Hevea brasiliensis compatible with 2-DE and MS[J]. Proteome Science， 2010， 8（1）： 35.

[23] Wang D Y， Wang H Y， Han B， et al. Sodium instead of potassium and chloride is an important macronutrient to improve leaf succulence and shoot development for halophyte Sesuvium portulacastrum[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2012， 51（1）： 53-62.

[24] Yi X， Sun Y， Yang Q， et al. Quantitative proteomics of Sesuvium portulacastrum leaves revealed that ion transportation by V-ATPase and sugar accumulation in chloroplast played crucial roles in halophyte salt tolerance[J]. Journal of Proteomics， 2014， 99： 84-100.

[25] Wang W， Scali M， Vignani R， et al. Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf， a plant tissue containing high levels of interfering compounds[J]. Electrophoresis， 2003， 24（14）： 2369-2375.

[26] Jin X， Zhu L， Tao C， et al. An improved protein extraction method applied to cotton leaves is compatible with 2-DE and LC-MS[J]. BMC Genomics， 2019， 20（1）： 285.

[27] Delgado E， Valverde-Quiroz L， Lopez D， et al. Characterization of soluble glandless cottonseed meal proteins based on electrophoresis， functional properties， and microscopic structure[J]. Journal of Food Science， 2019， 84（10）： 2820-2830.

[28] Akyüz A， Ersus S. Optimization of enzyme assisted extraction of protein from the sugar beet （Beta vulgaris L.） leaves for alternative plant protein concentrate production[J]. Food Chemistry， 2021， 335： 127673.

[29] Wang X C， Chang L L， Wang B C， et al. Comparative proteomics of Thellungiella halophila leaves from plants subjected to salinity reveals the importance of chloroplastic starch and soluble sugars in halophyte salt tolerance[J]. Molecular and Cellular Proteomics， 2013， 12： 2174-2195.

[30] Aiello D， Siciliano C， Mazzotti F， et al. Protein extraction， enrichment and MALDI MS and MS/MS analysis from bitter orange leaves （Citrus aurantium）[J]. Molecules， 2020， 25（7）： 1485.

[31] 李肖芳， 韓和平， 王旭初， 等. 適用于鹽生植物的雙向電泳樣品制備方法[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 2006， 26（6）： 1848-1853.

責(zé)任編輯：崔麗虹