橡膠樹‘熱研7-33-97’和‘PR107’膠乳和樹皮中蔗糖代謝相關(guān)的酶活與基因表達(dá)研究

劉曉東，王藝瑋，肖小虎，朱芳玉，劉星，莫春演，方永軍，唐朝榮

摘? 要：對(duì)2個(gè)產(chǎn)膠水平差異明顯的橡膠樹品種（‘熱研7-33-97和‘PR107）產(chǎn)膠旺季時(shí)2個(gè)與產(chǎn)膠直接相關(guān)的碳庫（膠乳和莖干樹皮）中蔗糖代謝相關(guān)的酶活、基因表達(dá)以及膠乳生理參數(shù)、樹皮非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（NSC）含量進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：‘PR107干膠產(chǎn)量的季節(jié)性變動(dòng)明顯大于‘熱研7-33-97，但均在9月底出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)膠高峰;2個(gè)品種膠乳的總固形物、無機(jī)磷和蔗糖含量差異不明顯，但‘熱研7-33-97的干膠含量顯著高于‘PR107;樹皮NSC的主要成分為可溶性糖（占80%以上），但品種間的NSC及其相關(guān)組分（淀粉、可溶性糖和還原性糖）的差異均不顯著;膠乳中，蔗糖合成酶（Sus）主要催化蔗糖合成，品種間的中堿性轉(zhuǎn)化酶（NIN）和Sus酶活差異均不顯著;樹皮中，‘熱研7-33-97的NIN酶活顯著大于‘PR107，而其他蔗糖代謝相關(guān)酶活品種間的差異不顯著;在膠乳中，HbSWEET10a基因的表達(dá)量高，并且‘熱研7-33-97>‘PR107，還是唯一在品種間表達(dá)顯著差異的蔗糖代謝相關(guān)基因;在樹皮中，‘PR107的HbSus3和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因HbCIN2的表達(dá)顯著高于‘熱研7-33-97，HbSUT5顯著低于‘熱研7-33-97，而其他4個(gè)蔗糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)在品種間差異不顯著。本研究結(jié)果為深入探究蔗糖代謝調(diào)控與膠乳再生的互作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹;產(chǎn)膠;蔗糖代謝;酶活;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S794.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Enzymatic Activity and Gene Expression of Sucrose-Metabolizing Enzymes in Latex and Bark of Two Hevea Varieties （‘Reyan7-33-97 and ‘PR107）

LIU Xiaodong1， WANG Yiwei1， XIAO Xiaohu2， ZHU Fangyu1， LIU Xing1， MO Chunyan1， FANG Yongjun2， TANG Chaorong1*

1. Natural Rubber Cooperative Innovation Center of Hainan Province & Ministry of Education， China / College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： In this paper， the activity of sucrose-metabolizing enzymes and expression of relevant genes in two carbon sinks （latex and trunk bark） that are directly involved in rubber production， as well as latex physiological parameters and bark n on-structural carbohydrate （NSC）， were investigated in two Hevea varieties （‘Reyan7-33-97 and ‘PR107） of different rubber productivity during their peak yielding season. Seasonal dynamic change in dry rubber yield was larger in ‘PR107 than in ‘Reyan7-33-97， but both varieties exhibited a peak at late Sept. Latex total solid content， inorganic phosphorus and sucrose were not significantly different between the two varieties， but dry rubber content was significantly higher in ‘Reyan7-33-97 than in ‘PR107. Soluble sugar accounted for more than 80% of the NSC in trunk bark， and the differences in NSC and its component sugars （starch， soluble sugar and reducing sugar） were not significant between the two varieties. In the latex， sucrose synthase （Sus） catalyzed the reaction towards sucrose synthesis， and the activity of alkaline/neutral invertase （NIN） and Sus was not significantly different between the two varieties. In trunk bark， ‘Reyan7-33-97 showed significantly higher NIN activity than ‘PR107， but not significant between the two varieties for the other sucrose-metabolizing enzymes. In the latex， HbSWEET10a was abundantly expressed， and out of the eight sucrose-metabolizing genes examined， it was the only displaying significant differences in expression between the two varieties， with a higher expression in ‘Reyan7-33-97. In trunk bark， of the seven sucrose-metabolizing genes examined， the expressions of HbSus3 and HbCIN2 were significantly higher in ‘PR107 than in ‘Reyan7-33-97， but HbSUT5 expression was lower in ‘PR107. These results obtained here laid a foundation for further exploring the molecular interaction between the regulation of sucrose metabolism and latex regeneration.

Keywords： Hevea; rubber yield; sucrose metabolism; enzyme activity; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.014

天然橡膠（順式-1， 4-聚異戊二烯，橡膠烴）是一種重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，主要來自橡膠樹，其優(yōu)良的綜合性能迄今仍無法被合成橡膠完全替代[1]。在橡膠樹中，橡膠烴的生物合成是以蔗糖為原料，在特化的乳管（細(xì)胞）中合成的，乳管蔗糖代謝調(diào)控是影響橡膠產(chǎn)量形成的一個(gè)關(guān)鍵因素[2]。橡膠樹生產(chǎn)上的收獲產(chǎn)品（膠乳）系乳管的細(xì)胞質(zhì)，其主要成分是橡膠烴，主要采自莖干部的樹皮;膠乳中的蔗糖來自橡膠樹葉片，經(jīng)過韌皮部介導(dǎo)的長距離運(yùn)輸?shù)竭_(dá)莖干部樹皮，再通過韌皮部的卸載和跨膜運(yùn)輸后進(jìn)入乳管[3]。橡膠樹莖干部樹皮作為膠乳中蔗糖來源的直接庫，研究其非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的含量變化和調(diào)控，有助于深入探索蔗糖代謝調(diào)控與橡膠產(chǎn)量形成的關(guān)系。

橡膠樹中有關(guān)糖代謝的研究較多，特別是乳管蔗糖代謝調(diào)控研究。Tup?等[2-5]發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)膠乳中蔗糖降解的酶是一種中堿性轉(zhuǎn)化酶，該酶活性調(diào)控是影響乳管蔗糖代謝和產(chǎn)量形成的一個(gè)關(guān)鍵酶。此外，他們發(fā)現(xiàn)膠乳蔗糖降解還受蔗糖合成酶的負(fù)調(diào)控，乙烯刺激后轉(zhuǎn)化酶活性提高而蔗糖合成酶活性降低，加速了乳管蔗糖利用，增加了膠乳產(chǎn)量[6]。筆者團(tuán)隊(duì)先后分離鑒定了決定乳管蔗糖吸收和降解的關(guān)鍵基因HbSUT3[7]和HbNIN2[8]，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)水平（或酶活）與橡膠產(chǎn)量形成密切相關(guān)，膠乳中的主要蔗糖合成酶基因HbSus2和HbSus3在乙烯處理后表達(dá)量顯著下降[9]，與前人[6]發(fā)現(xiàn)蔗糖合成酶活性受乙烯抑制的結(jié)果一致;初步研究了橡膠樹蔗糖代謝相關(guān)基因家族，包括中堿性和酸性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合成酶、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWEET等的組織表達(dá)特性，鑒定了在膠乳和莖干樹皮中高表達(dá)的家族基因[9-11]。橡膠樹莖干樹皮和木質(zhì)部中的貯藏糖類（主要為淀粉和蔗糖）隨采膠強(qiáng)度的增強(qiáng)而含量增加，表明這些貯藏糖類不是一個(gè)被動(dòng)的臨時(shí)碳庫，而是一個(gè)與膠乳再生競爭的碳庫[12-13]。

‘PR107和熱研‘7-33-97是我國植膠區(qū)種植面積較大的2個(gè)橡膠樹品種，關(guān)于其品種特性的研究較多[14]?！甈R107是印度尼西亞在1923年選育出的初生代橡膠樹無性系，割膠初期產(chǎn)量低，但其干膠含量高、抗逆性強(qiáng)、耐高頻割膠和乙烯刺激，割膠后期產(chǎn)量不斷增加[15]。我國1950年引入該品種，曾是我國各植膠區(qū)的主栽品種之一，目前在海南和云南仍有較大的種植面積?！疅嵫?-33-97是我國育種工作者以‘RRIM600和‘PR107為親本選育出的橡膠樹優(yōu)良品種，該品種在割膠初期就表現(xiàn)出較高的產(chǎn)量，對(duì)風(fēng)寒病等逆境的綜合抗性較好[16]，目前是海南植膠區(qū)種植面積最大的品種。

本研究在測定‘PR107和‘熱研7-33-97產(chǎn)膠水平、代謝類型明顯差異橡膠樹品種膠乳產(chǎn)量季節(jié)性變化的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)比較研究了它們在產(chǎn)膠旺季時(shí)膠乳和莖干樹皮中蔗糖代謝相關(guān)酶的活性和基因表達(dá)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

‘熱研7-33-97和‘PR107橡膠樹來自海南天然橡膠產(chǎn)業(yè)集團(tuán)澄邁紅光農(nóng)場東嶺隊(duì)的2個(gè)相鄰林段（19°50′11″N，109°55′22″E），每品種選15株健康樹，按樹圍和長勢分為3組，每組5棵樹為1個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)?！疅嵫?-33-97于2011年定植，2018年開割;‘PR107于2009年定植，2016開割，采用1/2樹圍1刀/3 d（S/2 d3）不刺激割制。試驗(yàn)時(shí)間為2019年，4月末開始割膠，12月25日割最后1刀，割膠周期為8個(gè)月，每月下旬選取1刀測產(chǎn)，并采集膠乳和樹皮樣品進(jìn)行相關(guān)分析。采樣的具體日期為：5月24日、6月27日、8月6日（受臺(tái)風(fēng)韋帕的影響，原定7月下旬的采樣推遲至此）、8月27日、9月25日、10月25日、11月23日和12月25日，共采樣8次。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品采集與處理? 凌晨5：00割膠，棄前20滴膠乳，然后用置于冰浴中的50 mL離心管（DEPC水預(yù)先處理）收集膠乳樣品30 mL，其后的膠乳滴入膠杯，直至流膠停止，測定膠乳產(chǎn)量。在250 mL三角瓶中混合來自同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)5棵樹的膠乳樣品（共約150 mL），放置冰上帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行如下處理：取6 mL用于測定膠乳干膠和總固形物含量;取7 mL用于提取膠乳RNA;取1 mL膠乳，加入9 mL 2.5%（w/V）三氯乙酸，混勻后4 ℃ 12 000 ×g離心10 min，上清液用于蔗糖和無機(jī)磷含量測定;取35 mL膠乳，在4 ℃下40 000 ×g離心2 h，取中層澄清的C-乳清，用于轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶的活性測定。割膠前撕去割面膠線，收集新割下的樹皮，同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)5棵樹的樹皮裝入一個(gè)凍存管，液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.2? 膠乳生理參數(shù)測定? 利用差重法測定膠乳的總固形物含量（TSC），乙酸凝固法測定膠乳的干膠含量（DRC）[17]，鉬酸銨比色法測定無機(jī)磷含量[18]，蒽酮試劑法測定蔗糖含量[19]。

1.2.3? 樹皮中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測定? 非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（non-structural carbohydrates， NSC）主要包括可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖、果糖等）和淀粉。樹皮中可溶性糖的提取和測定方法參照前人的方法[12， 20]，并加以改進(jìn)：樹皮經(jīng)液氮研磨、烘干后取200 mg，加入5 mL 80%乙醇于80 ℃浸提40 min，期間渦旋振蕩4次，15 000 ×g離心10 min收集上清，殘?jiān)? mL 80%乙醇重提1次，合并上清，加蒸餾水定容至10 mL，取1 mL加入活性炭15 mg，40 ℃脫色30 min，15 000 ×g離心5 min，上清即為樹皮可溶性糖提取樣品;取100 μL樣品，加入5 mL硫酸-蒽酮試劑，煮沸10 min，冷卻至室溫后626 nm處測定光吸收。

還原糖能與3， 5-二硝基水楊酸（DNS）在高溫下反應(yīng)產(chǎn)生棕紅色物質(zhì)，在520 nm處有最大吸收峰。具體參考前人的測定方法[21]，取100 μL樣品加入400 μL DNS溶液，煮沸5 min，冷卻至室溫后14 000 ×g離心3 min，取200 μL上清液液加入酶標(biāo)板中，520 nm處測取吸光值。橡膠樹樹皮中的淀粉含量測定使用索萊寶（Solarbio）公司的淀粉含量檢測試劑盒，操作步驟按照說明書進(jìn)行。非結(jié)構(gòu)性碳水化合物單位以1 g干重（dry weight，DW）樹皮樣品中含有糖的質(zhì)量（mg）表示，記為mg/g。

1.2.4? 膠乳蔗糖代謝相關(guān)酶活性測定? 在膠乳中，中堿性轉(zhuǎn)化酶（NIN）和蔗糖合成酶（Sus）是決定蔗糖降解的關(guān)鍵酶[8-9]，酶活性測定方法參照前人的方法[4， 22]。

中堿性轉(zhuǎn)化酶（NIN）：將3 μL C-乳清、92 μL反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L HEPES、5 mmol/L Mg2+和1 mmol/L EDTA，pH 7.6）和5 μL底物（2 mol/L蔗糖）分別加入到冰浴上放置的1.5 mL離心管中，混勻后45 ℃水浴1 h（對(duì)照組置于冰浴上）。

Sus分解活性：將3 μL C-乳清、90 μL反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L HEPES、5 mmol/L Mg2+和1 mmol/L EDTA，pH 6.5）和7 μL底物（5 μL 2 mol/L蔗糖、2 μL 0.5 mol/L二磷酸尿苷）分別加入到冰浴上放置的1.5 mL離心管，混勻后50 ℃水浴1 h（對(duì)照組不加二磷酸尿苷），立即加入900 μL DNS溶液，混勻后沸水浴5 min，按照文獻(xiàn)[22]的方法測定反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的還原糖含量。NIN和Sus分解活性均以1 mg C-乳清蛋白在1 h內(nèi)降解蔗糖產(chǎn)生的還原糖μmol數(shù)（U）表示，記為μmol/（mg·h）。

Sus合成活性：將3 μL C-乳清、91 μL反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L HEPES、5 mmol/L Mg2+和1 mmol/L EDTA，pH8.5）和6 μL底物（4 μL 1 mol/L蔗糖、2 μL 0.5 mol/L尿苷二磷酸葡萄糖）分別加入到冰浴上放置的1.5 mL離心管，混勻后60 ℃水浴1 h（對(duì)照組不加尿苷二磷酸葡萄糖），立即加入100 μL 1 mol/L NaOH，沸水浴10 min終止反應(yīng)（同時(shí)水解未反應(yīng)的單糖），冰水上冷卻，加入250 ?L 0.1% （w/V）間苯二酚（用95%乙醇配置）和750 μL濃HCl，混勻后80 ℃水浴10 min，按照文獻(xiàn)[22]的方法測定反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的蔗糖含量。酶活性以1 mg C-乳清蛋白在1 h內(nèi)合成的蔗糖μmol數(shù)（U）表示。

橡膠樹不同蔗糖代謝酶的酶活性受溫度影響大[23]，以上測定均是在相應(yīng)酶的最適酶活溫度[8， 23]下測定的。同時(shí)，根據(jù)9月份試驗(yàn)地橡膠樹莖干樹皮部位的溫度測定結(jié)果，測定30 ℃的相關(guān)酶活作為生理溫度酶活。

1.2.5? 樹皮中蔗糖代謝相關(guān)酶的提取與活性測定? 在樹皮中，中堿性轉(zhuǎn)化酶（NIN）、液泡轉(zhuǎn)化酶（VIN）和蔗糖合成酶（Sus）是蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶[23-24]。粗酶液提取及測定方法參照前人的方法[22， 24-26]，并加以改進(jìn)。稱取1 g樹皮，加液氮研磨后，加入4 mL提前預(yù)冷的可溶性酶提取液（50 mmol/L HEPES-NaOH、1 mmol/L EDTA、5 mmol/L Mg2+和10 mmol/L β-巰基乙醇，pH 7.0），冰上提取40 min，期間振蕩3～5次，15 000 ×g 4 ℃離心15 min取上清，0.45 ?m過濾器過濾，Sephadex G25柱脫糖，即為用于酶活測定的粗酶液。

NIN活性測定：取30 μL粗酶液、65 μL反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L HEPES、5 mmol/L Mg2+和1 mmol/L EDTA，pH 8.0）和5 μL底物（2 mol/L蔗糖）分別加入到冰浴上放置的1.5 mL離心管，混勻后45 ℃或30 ℃水浴1 h（對(duì)照組置于冰浴上）。

VIN活性測定：取30 μL粗酶液、65 μL反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L HEPES、5 mmol/L Mg2+和1 mmol/L EDTA，pH 4.5）和5 μL底物（2 mol/L蔗糖）分別加入到冰浴上放置的1.5 mL離心管，混勻后65 ℃或30 ℃水浴1 h（對(duì)照組置于冰浴上）。

Sus分解活性測定：將30 μL粗酶液、63 μL反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L HEPES、5 mmol/L Mg2+和1 mmol/L EDTA，pH 6.5）和7 μL底物（5 μL 2 mol/L蔗糖、2 μL 0.5 mol/L二磷酸尿苷）分別加入1.5 mL離心管，混勻后50 ℃或30 ℃水浴1 h（對(duì)照組不加二磷酸尿苷）。

Sus合成活性測定：將30 μL粗酶液、64 μL反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L HEPES、5 mmol/L Mg2+和1 mmol/L EDTA，pH 8.5）和6 μL底物（4 μL 1 mol/L蔗糖、2 μL 0.5 mol/L尿苷二磷酸葡萄糖）分別加入1.5 mL離心管，混勻后60 ℃或30 ℃水浴1 h（對(duì)照組不加尿苷二磷酸葡萄糖）;反應(yīng)產(chǎn)物測定及酶活計(jì)算方法均與膠乳中相應(yīng)酶活測定相同。

1.2.6? 蔗糖代謝關(guān)鍵基因的實(shí)時(shí)定量RT-PCR表達(dá)分析? 橡膠樹膠乳RNA提取方法參照前人的方法[27];樹皮RNA提取利用百泰克（BioTeke）的通用植物總RNA快速提取試劑盒。cDNA第一條鏈合成使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒。通過檢索中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所建立的橡膠樹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（Hevea DB），獲得目的基因包含完整讀碼框的cDNA全長序列，利用Primer Premier 5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，根據(jù)Li等[28]的研究選用YLS8基因作為膠乳組織基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，UBC2a基因作為樹皮組織基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因。目的基因及內(nèi)參基因的熒光定量分析引物見表1。

1.3? 氣象因子觀測記錄

實(shí)驗(yàn)地區(qū)的溫度、濕度、降水量等氣象因子通過中國天氣網(wǎng)公布數(shù)據(jù)查詢。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算、分析和作圖。本研究中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，利用Pearson相關(guān)分析法計(jì)算其相關(guān)性;利用單因素變量方差分析（ANOVA）計(jì)算其差異性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 干膠產(chǎn)量的季節(jié)變化

‘熱研7-33-97和‘PR107品種的株次（單株單次割膠）干膠產(chǎn)量均呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性變動(dòng)（圖1A），變異系數(shù)分別為21%和33%，表明‘PR107產(chǎn)量的季節(jié)性變化明顯更大一些。本試驗(yàn)中‘熱研7-33-97品種的樹齡和割齡均比‘PR107晚2年，但其年均株次干膠產(chǎn)量（43 g）仍高于后者（36 g）;2個(gè)品種均在6月末出現(xiàn)第1個(gè)產(chǎn)膠低谷，這與橡膠樹此時(shí)正處于第2蓬葉的抽葉旺盛期、膠乳再生受抑制有關(guān);‘熱研7-33-97的產(chǎn)量峰值出現(xiàn)在9月25日（64 g），而‘PR107先后在8月6日（53 g）和9月25日（52 g）出現(xiàn)2個(gè)產(chǎn)膠高峰，9月25日之后2個(gè)品種的橡膠產(chǎn)量均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，在12月25日出現(xiàn)第2個(gè)產(chǎn)膠低谷。以下研究均以9月25日采集的膠乳和樹皮為材料，相關(guān)結(jié)果可反映這2個(gè)橡膠樹品種在產(chǎn)膠旺季時(shí)相關(guān)組織蔗糖代謝的生理生化與分子差異。

試驗(yàn)地2019年的年總降雨量為1721 mm，受7號(hào)臺(tái)風(fēng)韋帕（Wipha）影響，7月末到8月初的降雨量占全年降雨量的22%，其中8月1日1天的降水量就達(dá)到284 mm，‘PR107第1個(gè)產(chǎn)膠高峰就出現(xiàn)在臺(tái)風(fēng)過后的第1次割膠（8月6日）。但是，臺(tái)風(fēng)不僅造成試驗(yàn)地區(qū)的大量降水，同時(shí)也造成橡膠樹斷枝受傷和較長時(shí)間的停割休養(yǎng)，因此‘PR107這個(gè)產(chǎn)量高峰可能是短期外界氣候條件突變所致，而非橡膠樹進(jìn)入產(chǎn)膠旺季（圖1B～圖1C）。

2.2? 膠乳生理參數(shù)及樹皮非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量

從圖2A可見，在產(chǎn)膠高峰期，‘熱研7-33-97的TSC（45.9%）低于‘PR107的（46.8%），但其DRC（40.0%）卻顯著高于后者（36.4%），表明‘熱研7-33-97的橡膠烴合成能力強(qiáng)于‘PR107。

從圖2B可見，在產(chǎn)膠高峰期，‘熱研7-33-97和‘PR107的蔗糖含量分別為4.2 mmol/L和5.2 mmol/L，差異不顯著;整體而言，2個(gè)品種的膠乳蔗糖含量較低，且研究結(jié)果顯示（表2），膠乳中蔗糖含量與干膠產(chǎn)量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明在產(chǎn)膠旺季膠乳再生導(dǎo)致蔗糖消耗量增大。

從圖2C可見，在產(chǎn)量高峰期，‘熱研7-33-97膠乳的無機(jī)磷含量（22.6 mmol/L）顯著低于‘PR107（24.7 mmol/L）。

從圖3A可見，‘熱研7-33-97樹皮NSC含量（32.2 mg/g）與‘PR107的（33.2 mg/g）相近，主要成分均為可溶性糖（其中約1/3為還原性糖），占82%～83%，其余為淀粉（占17%～18%）;?統(tǒng)計(jì)分析顯示，2個(gè)品種間的NSC、淀粉、可溶性糖和還原性糖含量均無顯著差異（P>0.05）。

2.3? 膠乳和樹皮蔗糖代謝相關(guān)酶的活性

從圖2D～圖2F可知，不管在最適溫度或是生理溫度下，2個(gè)品種膠乳中的NIN酶活都比SSC和SSS高。在最適溫度下膠乳NIN的酶活與膠乳蔗糖含量呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)R=–0.303），與干膠產(chǎn)量呈正相關(guān)（R=0.761），而SSC的酶活與膠乳蔗糖含量呈正相關(guān)（R=0.257），但相關(guān)性均未達(dá)顯著水平。在最適溫度下，2個(gè)品種Sus的蔗糖分解活性均大于其合成活性，但生理溫度下的蔗糖分解活性卻顯著低于合成活性，說明在產(chǎn)膠旺季膠乳中Sus催化活性主要朝著蔗糖合成方向。統(tǒng)計(jì)分析顯示，膠乳中蔗糖代謝途徑同種類型酶的酶活，不論在最適溫度或是生理溫度下在2個(gè)品種間的差異均不顯著。

從圖3B～圖3C可知，在樹皮中除‘熱研7-33- 97的SSS外，其他蔗糖代謝酶在最適溫度下的酶活均顯著高于其生理溫度酶活，其中VIN最適溫度酶活為生理溫度的10倍以上;在最適溫度下，樹皮中VIN酶活顯著高于其他類型的蔗糖代謝酶，但在生理溫度下不同類型蔗糖代謝酶的活性相近。統(tǒng)計(jì)分析顯示，僅NIN的生理溫度酶活性（‘熱研7-33-97>‘PR107）和SSC的最適溫度酶活性（‘PR107>‘熱研7-33-97）在2個(gè)品種間存在顯著差異（P<0.05）。

2.4? 膠乳和樹皮蔗糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)

從圖4A可見，膠乳中HbNIN2表達(dá)量顯著高于其他2個(gè)NIN（HbNIN3與HbNIN5）及1個(gè)Sus（HbSus3）基因，同時(shí)HbNIN2的表達(dá)量與膠乳NIN酶活呈正相關(guān)（R=0.363），而HbNIN3和HbNIN5的表達(dá)量與膠乳NIN酶活呈負(fù)相關(guān)（R分別為–0.125和–0.288）。決定乳管蔗糖吸收的主要基因HbSUT3的表達(dá)量顯著高于定位于液泡（膠乳中為黃色體）的HbSUT5基因，而膠乳中特異表達(dá)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HbSWEET10a的表達(dá)量更高，并且HbSUT3和HbSWEET10a的表達(dá)量都與膠乳產(chǎn)量呈正相關(guān)（R分別為0.695和0.662），??而另一個(gè)膠乳特異表達(dá)SWEET基因HbSWEET16b的表達(dá)量較低，與膠乳產(chǎn)量的相關(guān)性也較低（R= 0.280）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，在所比較的8個(gè)乳管蔗糖代謝相關(guān)基因中，只有HbSWEET10a在膠乳中的表達(dá)在2個(gè)橡膠樹品種間存在顯著差異，并且表達(dá)水平與品種的產(chǎn)膠水平一致（‘熱研7-33-97> ‘PR107）。

從圖4B可見，樹皮中細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因HbCIN2和蔗糖合成酶基因HbSus3和HbSus4的表達(dá)量顯著高于中堿性轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN2和酸性轉(zhuǎn)化酶基因HbVIN2，并且相關(guān)性分析顯示HbCIN2在樹皮中的表達(dá)量與樹皮中還原性糖含量呈顯著正相關(guān)（R=0.911，P<0.05），表明細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶可能是樹皮中負(fù)責(zé)蔗糖降解的關(guān)鍵酶。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HbSWEET1a表達(dá)量顯著高于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HbSUT5，表明HbSWEET1a基因可能是參與樹皮蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)的重要基因。統(tǒng)計(jì)分析顯示，僅有3個(gè)基因（HbCIN2、HbSus3和HbSUT5）的表達(dá)在2個(gè)橡膠樹品種間存在顯著差異，其中HbCIN2和HbSus3在‘PR107中的表達(dá)高于‘熱研7-33-97，而HbSUT5在‘熱研7-33-97中的表達(dá)高于‘PR107。

3? 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)橡膠樹品種（‘熱研7-33-97和‘PR107）的干膠產(chǎn)量呈現(xiàn)相似的季節(jié)性變化趨勢，分別在6月末和12月末出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)膠低谷，在9月末出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)膠高峰，但‘熱研7-33-97全年僅有這一個(gè)產(chǎn)膠高峰，而‘PR107在8月初出現(xiàn)另一個(gè)產(chǎn)膠高峰，可能是短期外界氣候條件影響所致。除7、11、12月份外，‘熱研7-33-97的干膠產(chǎn)量都高于‘PR107，并且‘熱研7-33-97的樹齡和割齡還較‘PR107晚2年，顯示‘熱研7-33-97的產(chǎn)膠能力明顯優(yōu)于‘PR107，反映了品種間的產(chǎn)膠水平差異[16， 29-30]，這與本課題組前期的結(jié)果一致[29， 31]。結(jié)合試驗(yàn)地區(qū)2019年的氣象因子（氣溫和降水）記錄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降水量對(duì)2個(gè)品種膠乳產(chǎn)量的季節(jié)性變動(dòng)影響要大于氣溫，其中‘PR107受影響尤為明顯，可能與其TSC較高排膠相對(duì)困難有關(guān)。膠乳生理參數(shù)反映橡膠樹乳管系統(tǒng)的代謝狀況和產(chǎn)膠潛力[31-33]，TSC能反映膠乳粘性和膠乳再生能力，過高或過低都會(huì)影響膠乳產(chǎn)量[33]。蔗糖是橡膠烴生物合成的原料，膠乳中蔗糖供給能力是影響橡膠產(chǎn)量和膠乳再生的重要因素[32]。在正常割膠的健康橡膠樹中，膠乳中蔗糖含量高意味著蔗糖供應(yīng)充足且橡膠樹的產(chǎn)膠潛力較高[33]。橡膠樹樹皮中的NSC是膠乳再生最直接的碳庫[13， 34]，其中可溶性糖為隨時(shí)可被利用的碳源，而淀粉則作為一種局部緩沖用碳水化合物。通過對(duì)產(chǎn)膠旺季的膠乳生理參數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)PR107膠乳的蔗糖含量、TSC和無機(jī)磷含量高于‘熱研7-33-97，但‘熱研7-33-97的DRC和干膠產(chǎn)量卻要高于‘PR107，進(jìn)一步說明‘熱研7-33-97的膠乳再生能力優(yōu)于‘PR107。膠乳再生消耗的大量碳水化合物主要來自最近的碳庫（樹皮）[35]，但‘熱研7-33-97樹皮中的NSC及其相關(guān)糖類含量與‘PR107相比均無顯著差異，可能反映2個(gè)品種樹皮具有相近的NSC代謝能力。本研究測定的膠乳蔗糖含量顯著低于我們前期的研究結(jié)果[31， 36]，推測可能與試驗(yàn)地區(qū)的植膠環(huán)境欠佳（接近海南最北端，逆境脅迫較為嚴(yán)重）及膠園管理不足有關(guān)。

在橡膠樹乳管中，蔗糖降解成單糖是其用于橡膠生物合成和膠乳再生的關(guān)鍵第一步。膠乳中蔗糖降解主要依賴中堿性轉(zhuǎn)化酶（NIN），而蔗糖合成酶（Sus）在膠乳生理pH范圍（6.5～7.3）內(nèi)主要表現(xiàn)為蔗糖合成活性[3， 6]。乳管中的蔗糖直接來自其周圍的樹皮組織[23]，但有關(guān)橡膠樹樹皮中蔗糖代謝相關(guān)酶的研究很少。本研究改進(jìn)形成了一套適于橡膠樹樹皮蛋白提取和蔗糖代謝相關(guān)酶活性測定的實(shí)驗(yàn)體系，在此基礎(chǔ)上首次系統(tǒng)比較了2個(gè)橡膠樹主栽品種產(chǎn)膠旺季時(shí)膠乳和莖干樹皮中蔗糖代謝相關(guān)的酶活和基因表達(dá)水平。研究不僅測定了相關(guān)酶的最適溫度活性（主要反映膠乳和樹皮中相關(guān)酶的相對(duì)含量），同時(shí)根據(jù)采樣地區(qū)環(huán)境溫度和橡膠樹莖干樹皮溫度的季節(jié)性變化，將30 ℃測定的酶活作為相關(guān)酶的生理溫度酶活。發(fā)現(xiàn)除樹皮中蔗糖合成酶的蔗糖合成活性（SSS）外，其他蔗糖代謝相關(guān)酶的生理溫度酶活性和最適溫度酶活性都存在顯著差異，說明溫度對(duì)酶活性影響較大，這與前期的研究結(jié)果[23]一致。建議今后在測定橡膠樹膠乳或樹皮相關(guān)酶活時(shí)應(yīng)以生理溫度下的測定為主，這反映在立地環(huán)境下相關(guān)酶的催化活性。在生理溫度下，‘熱研7-33-97樹皮中的中堿性轉(zhuǎn)化酶活性顯著高于‘PR107，但在膠乳中2個(gè)品種中堿性轉(zhuǎn)化酶活性的差異不顯著，這與我們以往的研究結(jié)果不同[8， 31]。

橡膠樹中有關(guān)SWEET基因家族的研究較少[11]，在膠乳中，比較了所有已報(bào)道的乳管蔗糖代謝相關(guān)基因在2個(gè)橡膠樹品種中的表達(dá)水平，這些基因包括參與乳管蔗糖降解的NIN基因HbNIN2、HbNIN3和HbNIN5[8， 10]以及蔗糖合成酶基因HbSus3[9]，參與乳管蔗糖吸收的SUT基因HbSUT3[7]和HbSUT5[37]以及SWEET基因HbSWEET10a和HbSWEET16a[11]。本研究發(fā)現(xiàn)膠乳特異高表達(dá)的HbSWEET10a基因在2個(gè)品種間的表達(dá)存在顯著差異（‘熱研7-33-97>‘PR107），并且是所分析的8個(gè)蔗糖代謝相關(guān)基因中唯一一個(gè)在品種間存在顯著差異的基因，說明SWEET基因可能在橡膠樹乳管蔗糖或糖的吸收調(diào)控上發(fā)揮重要作用，為今后相關(guān)領(lǐng)域研究提供了新方向。在樹皮中，所測定的7個(gè)蔗糖代謝相關(guān)基因中，有3個(gè)基因（HbCIN2、HbSus3和HbSUT5）的表達(dá)在2個(gè)品種間存在顯著差異，其中‘PR107品種HbCIN2基因的表達(dá)水平比‘熱研7-33-97高近10倍，值得深入研究。

本研究是在氣候因子、橡膠樹樹圍、割制、割膠技術(shù)和膠園管理水平基本一致的條件下，對(duì)2個(gè)橡膠樹品種膠乳和樹皮產(chǎn)膠相關(guān)生理生化參數(shù)、蔗糖代謝相關(guān)酶活性和關(guān)鍵基因表達(dá)的綜合研究，有助于深入了解膠乳再生過程中糖代謝相關(guān)的生理生化與分子機(jī)制，研究中新發(fā)現(xiàn)的品種間差異表達(dá)基因?yàn)榻窈笙鹉z樹高產(chǎn)分子育種和膠乳產(chǎn)量調(diào)控技術(shù)研發(fā)提供了新思路。需要指出的是，由于本研究中2個(gè)橡膠樹品種的樹齡與割齡都不同，實(shí)驗(yàn)樣本量較少，以及實(shí)驗(yàn)期間試驗(yàn)地區(qū)的氣候條件變化劇烈等原因，部分研究結(jié)果與以往的報(bào)道存在明顯差異[7-9， 29-31]，今后需要進(jìn)行更深入的研究，以期揭示這2個(gè)橡膠樹品種產(chǎn)膠能力季節(jié)性變化的規(guī)律及其內(nèi)在機(jī)制。

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