基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析GPR84基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達與臨床意義

洪麗萍 趙強 張婧

摘要：目的：利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析G蛋白偶聯(lián)受體蛋白GPR84基因表達水平與腦膠質(zhì)瘤的分級、預后等關(guān)系。方法：通過TCGA數(shù)據(jù)庫分別篩選LGG與GBM信息，通過生物信息學分析將GPR84基因mRNA水平表達在腦膠質(zhì)不同瘤病理分級中的表達情況，以及GPR84的表達與患者臨床信息、預后的關(guān)系。結(jié)果：（1）GPR84在GBM中的表達顯著高于LGG（p<0.001）;（2）GPR84的高表達與腦膠質(zhì)瘤高年齡組相關(guān)（p<0.001），在LGG、GBM中均具有統(tǒng)計學意義（LGG中 p<0.001，GBM 中p<0.05）;（3）GPR84高表達的腦膠質(zhì)瘤患者總生存期更低（p<0.001）。GPR84高表達與腦膠質(zhì)瘤總生存期較低的關(guān)系獨立于其與腦膠質(zhì)瘤的病理分級的相關(guān)性，LGG與GBM中均存在GPR84高表達與預后不良相關(guān)（LGG中 p<0.001，GBM 中p<0.05）。結(jié)論：GPR84基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達與病理分級相關(guān)，且GPR84在腦膠質(zhì)瘤中的高表達提示預后不良。

關(guān)鍵詞：GPR84，腦膠質(zhì)瘤，低級別腦膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)母細胞瘤，TCGA數(shù)據(jù)庫

Abstract：Objective： To analyze GPR84 mRNA level changes in patients with gliomas and the clinical significance based on TCGA database. Methods： LGG and GBM information were screened through the TCGA database，and after the data were standardized through bioinformatics analysis，the two groups of data with different pathological grades of gliomas were classified according to their grades，and then combined for analysis. To analyze the expression of GPR84 mRNA level in different pathological grades of glioma，and the relationship between the expression of GPR84 and clinical information and prognosis. Result： The expression of GPR84 was significantly increasing in GBM compare with LGG （p<0.001）. The high expression of GPR84 was correlated with the high-age group of glioma （p<0.001）. And the correlation between GPR84 expression and age was statistically significant in LGG and GBM，respectively （p<0.001 in LGG，p<0.05 in GBM）. Patients with brain glioma with high expression of GPR84 had a lower overall survival，and the difference was statistically significant （p<0.001）. The relationship between high expression of GPR84 and low overall survival of glioma was independent of its correlation with pathological grade of glioma. There was a significant correlation between high expression of GPR84 and low survival in LGG and GBM，respectively （p<0.001 in LGG，p<0.05 in GBM）. Conclusion： The expression of GPR84 gene in glioma is correlated with pathological grade，and the high expression of GPR84 in glioma may indicate poor prognosis.

Key words： GPR84，Glioma，LGG，GBM，TCGA Database

【中圖分類號】R4?【文獻標識碼】A?【文章編號】1673-9026（2021）13-03

1前言

1.1G蛋白偶聯(lián)受體84

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）家族，是由一系列對外界光、氣味，以及對多肽、核苷酸、神經(jīng)遞質(zhì)和激素等刺激敏感的細胞表面受體組成[1]。研究表明，一部分GPCRs可以被游離脂肪酸（y free fatty acids ，F(xiàn)FAs）激活[1]。G蛋白偶聯(lián)受體84（G-protein-coupled receptor 84，GPR84），是2001年Yousefi等人，從人類外周血中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)的GPCRs家族一員。它可以被中鏈脂肪酸（medium-chain fatty acid，MCFA）激活，是FFAs受體[2-3]。

研究發(fā)現(xiàn)，GPR84主要表達于免疫系統(tǒng)的多種細胞中、神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，同時也表達于脂肪細胞[4]。研究表明，GPR84在免疫代謝中發(fā)揮重要的作用，可作為TNF-α、IL-1等促炎因子受體發(fā)揮重要作用[4]。

目前，GPR84參與疾病發(fā)生發(fā)展的病理機制研究較少，主要在大腦神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、惡性血液病中的病理機制初步得到揭示[6]。在白血病干細胞中，GPR84可以維持異常的β-catenin信號處于持續(xù)活化狀態(tài)，在ALL和MLL的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[6]。

1.2GPR84與腦膠質(zhì)瘤

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外胚層衍化而來的膠質(zhì)細胞發(fā)生的腫瘤，是顱內(nèi)腫瘤最常見的一種，根據(jù)惡性程度的不同分為不同的級別。低級別膠質(zhì)瘤（Low-grade gliomas，LGG）是指WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，I、II級的膠質(zhì)瘤。低級別膠質(zhì)瘤發(fā)展緩慢，預后較好。高級別膠質(zhì)瘤進展快，術(shù)后復發(fā)率極高，預后差，而其中，膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma，GBM）是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤[11]。

目前，尚未有GPR84表達在腦膠質(zhì)瘤中的研究，但是已有研究發(fā)現(xiàn)，GPR84在腦膠質(zhì)細胞中表達，并在阿茲海默癥模型小鼠中的小膠質(zhì)細胞中表達上調(diào)[5]，但GPR84在小膠質(zhì)細胞中上調(diào)表達不僅受到內(nèi)毒素等影響，還與其他因素相關(guān)。

1.3?TCGA中的腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)

癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫，整合了大量高質(zhì)量的的研究文獻及芯片數(shù)據(jù)，是當前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)。TCGA數(shù)據(jù)庫（http：//www.cancergenome.nih.gov/）是國家癌癥研究所（National Cancer Institute）和美國人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute）共同監(jiān)督的一個項目，旨在應用高通量的基因組分析研究提高對于癌癥的預防、診斷和治療能力。數(shù)據(jù)庫中整合了大量的腦膠質(zhì)瘤的基因表達、測序和臨床信息數(shù)據(jù)。我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的“TCGA-GBM”和“TCGA-LGG”項目中的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，分析GPR84在腦膠質(zhì)瘤中的表達情況以及其與腦膠質(zhì)瘤的病理分級、預后的關(guān)系。

2材料與方法

2.1TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選膠質(zhì)瘤不同分級GBM和LGG轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

GBM轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選 TCGA數(shù)據(jù)庫中收錄了GBM病例共有617例，本研究通過如下設(shè)定進一步篩選數(shù)據(jù)：本研究通過如下設(shè)定進一步篩選數(shù)據(jù)：（1）Primary size： Brain;（2）Project： TCGA-GBM;（3）Disease Type： Gliomas;（4）Vital status： dead，alive，下載轉(zhuǎn)錄組HTSeq-Counts文件和臨床信息文件。

LGG轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選 TCGA數(shù)據(jù)庫中收錄了LGG病例共有516例，進一步篩選：將上述GBM篩選過程中“Project： TCGA-GBM”設(shè)定為“Project： TCGA-LGG”，其余同GBM轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選。

在RStudio軟件中，將GBM和LGG兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)HTSeq-Counts進行標準化、整理、合并臨床信息，并進行兩組數(shù)據(jù)合并。最終，得到包含GPR84基因mRNA表達數(shù)據(jù)GBM共 159例，LGG共 510例。

2.2TCGA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中GPR84的mRNA表達量與臨床特征分析

以標準化后的數(shù)據(jù)進行分析，分析GPR84的mRNA表達量與患者年齡、性別、膠質(zhì)瘤病理分級的關(guān)系。

2.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0（SPSS，Chicago，IL，USA） 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示。生存分析數(shù)據(jù)采用Mantel-Cox 回歸進行生存分析。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

3.1GPR84在mRNA水平的表達與膠質(zhì)瘤病理分級的關(guān)系

分析TCGA數(shù)據(jù)庫中符合基本信息明確、病理分級明確，且包含GPR84的mRNA表達量的腦膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)共669例，其中低級別膠質(zhì)瘤510例（LGG=510），膠質(zhì)母細胞瘤159例（GBM=159）。通過分析發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細胞瘤中GPR84的mRNA表達量顯著高于低級別膠質(zhì)瘤，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）（Fig.3.1.1）

Fig.3.1.1 GPR84基因在不同病理分級的腦膠質(zhì)瘤中的mRNA表達情況?低級別膠質(zhì)瘤 LGG=510，膠質(zhì)母細胞瘤GBM=159，t（227.155）=15.069，95%置信區(qū)間 CI[-1.560，-1.174]，P<0.001。GPR84的mRNA水平在GBM中顯著高于LGG，在GBM平均表達量7.832，在LGG平均表達量6.608。

3.2GPR84基因與腦膠質(zhì)瘤患者臨床信息的關(guān)系

分析腦膠質(zhì)瘤患者中GPR84的mRNA表達水平與患者的年齡、性別的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)GPR84的mRNA表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者的年齡存在相關(guān)性，年齡≥40的患者GPR84的表達水平顯著高于年齡<40的患者（p<0.001）（Fig.3.2.1.A）。GPR84的mRNA表達水平與患者的性別無關(guān)（Fig.3.2.1.B）。

Fig.3.2.1 GPR84基因mRNA表達情況與腦膠質(zhì)瘤患者年齡、性別的關(guān)系?A.GPR84基因mRNA表達與腦膠質(zhì)瘤患者年齡的關(guān)系 其中年齡<40歲患者253例，年齡≥40歲患者416例，t（634.019）=-4.079，95%置信區(qū)間 CI[-0.462，-0.147]，P<0.001。B.GPR84基因mRNA表達與腦膠質(zhì)瘤患者性別的關(guān)系 其中女性患者284例，男性患者385例，P=0.253。

分別分析GPR84在LGG中mRNA水平與患者的發(fā)病年齡、性別的關(guān)系，及其在GBM中的上述相關(guān)性分析。GPR84的mRNA表達水平與LGG患者的年齡相關(guān)，高齡（年齡≥40）的患者GPR84的mRNA表達水平顯著高于低齡組患者（p<0.001）（Fig.3.2.2.A）。在GBM中，與上述同樣的年齡分組并不存在相關(guān)性（p=0.059）（Fig.3.2.2.C）。但年齡劃分為35歲時，GBM中同樣出現(xiàn)齡（年齡≥35）的患者GPR84的mRNA表達水平顯著高于低齡組患者（p<0.05）。在LGG和GBM，均顯示出GPR84的mRNA高表達與高年齡組相關(guān)。

Fig.3.2.2 GPR84基因mRNA表達情況分別于LGG、GBM患者年齡、性別的關(guān)系?A.GPR84基因mRNA表達與LGG年齡的關(guān)系 其中年齡<40歲患者240例，年齡≥40歲患者270例，t（496.647）=2.151，95%置信區(qū)間 CI[0.016，0.366]，P<0.05。B-C.GPR84基因mRNA表達與GBM年齡的關(guān)系其中年齡<35歲患者9例，年齡≥35歲患者150例，t（9.023）=-2.285，95%置信區(qū)間 CI[0.097，-1.464]，P<0.05。年齡<40歲患者13例，年齡≥40歲患者146例，P=0.059。

3.3GPR84與腦膠質(zhì)瘤預后的關(guān)系

利用TCGA數(shù)據(jù)庫信息，去除確診后存活期小于30天病例，對TCGA數(shù)據(jù)庫中GPR84 mRNA表達與腦膠質(zhì)瘤患者生存期關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)GPR84高表達組患者總生存時間顯著低于GPR84低表達組（p<0.0001），提示GPR84基因高表達與腦膠質(zhì)瘤預后不良相關(guān)（Fig.3.3.1.A）。繼而，我們分別在LGG與GBM中進行GPR84表達與腦膠質(zhì)瘤患者生存期關(guān)系分析，結(jié)果顯示，在LGG、GBM中GPR84高表達均提示預后不良。（LGG中p<0.01，GBM中p<0.05）。這表明，GPR84的高表達對腦膠質(zhì)瘤患者預后不良，且獨立于腦膠質(zhì)瘤的病理分級。

Fig.3.3.1 GPR84基因mRNA表達與腦膠質(zhì)瘤預后的關(guān)系?A.全部腦膠質(zhì)瘤病例GPR84基因mRNA高表達組317例，低表達組277例，GPR84基因mRNA高表達與腦膠質(zhì)瘤預后不良顯著相關(guān)（p<0.0001）。B. LGG病例中 GPR84基因mRNA高表達組286例，低表達組158例，GPR84基因mRNA高表達與LGG預后不良相關(guān)（p<0.01）。C. GBM中 GPR84基因mRNA高表達組30例，低表達組120例，GPR84基因mRNA高表達與GBM預后不良相關(guān)（p<0.05）。

3.4GPR84相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)

利用STRING數(shù)據(jù)庫分析GPR84蛋白的相關(guān)作用蛋白，以GPR84為中心，發(fā)現(xiàn)多個共表達蛋白（Fig.3.4.1.A）。進一步通過Kmeans聚類分析，通過將于GPR84相關(guān)蛋白分簇數(shù)設(shè)定為6，找到與GPR84可能與其最相關(guān)的共表達蛋白CLEC5A（SCORE 0.953）（Fig.3.4.1.B）

4討論

隨著對GPR84研究逐步深入，已知GPR84蛋白在多種代謝過程中發(fā)揮重要作用。GPR84作為免疫代謝受體，參與免疫代謝調(diào)控，可以調(diào)控多種免疫細胞發(fā)揮功能[8]。同時，有研究表明TNFα可提高脂肪細胞中GPR84的表達[9]。

GPR84在惡性腫瘤中的研究處于起步階段，通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，GPR84除了與血液淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤相關(guān)，還在膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、乳腺癌等腫瘤中高表達，其中與臨床意義密切相關(guān)的是GPR84在腦膠質(zhì)瘤中的表達，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病與先天遺傳基因存在高危因素相關(guān)，同時也與環(huán)境相關(guān)，腦膠質(zhì)瘤具有發(fā)病率高、復發(fā)率高及患者預后差等特點，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[10]。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫分析，我們發(fā)現(xiàn)GPR84與腦膠質(zhì)瘤的病理分級密切相關(guān)、與年齡相關(guān)，并且GPR84高表達可能對腦膠質(zhì)瘤的預后具有提示作用。但是，除了GPR84在MLL和ALL的病理機制初步被揭示之外，GPR84在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用的機制尚未明確。通過其蛋白相互關(guān)系分析，進一步發(fā)現(xiàn)CLEC5A、LILRB2等參與免疫調(diào)控的分子與GPR84共表達，進一步表明其主要通過免疫代謝調(diào)控的方式發(fā)揮作用。

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作者簡介：洪麗萍，第一作者，1988年出生，女，碩士，天津市腫瘤醫(yī)院空港醫(yī)院，從事腫瘤學與腫瘤臨床轉(zhuǎn)化方向研究。

本研究受以下基金資助：1.天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院?院級課題項目?編號：1809;2.天津市衛(wèi)生健康科技項目編號：RC20189