藏族人群G蛋白偶聯(lián)受體激酶4基因多態(tài)性及其與鹽敏感性共同對(duì)高血壓的影響研究

曹靜，劉希波，王云，王淑霞，李明陽，胡繼宏，2*

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

目前關(guān)于少數(shù)民族GRK4基因與高血壓的研究資料比較缺乏，且在藏族人群中尚未發(fā)現(xiàn)GRK4基因多態(tài)性與鹽敏感性交互作用的研究。本文通過調(diào)查藏族人群中GRK4基因、鹽敏感性及其交互作用與高血壓的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GRK4基因與藏族人群的高血壓有關(guān)，并且不同基因位點(diǎn)基因型的作用受到鹽敏感性的影響不同。

局限性：

（1）本研究僅局限在甘南藏族人群中進(jìn)行研究，結(jié)果的外推受到一定的限制；（2）現(xiàn)有的研究是對(duì)基因位點(diǎn)選點(diǎn)檢測(cè)的，并沒有進(jìn)行基因組全掃描。

高血壓不僅是心血管疾病，也是心血管疾病最主要的危險(xiǎn)因素之一［1］。腦卒中和冠心病都與高血壓有關(guān)［2］。2012—2015年中國高血壓抽樣調(diào)查顯示，我國高血壓患病率為27.9%，且呈上升趨勢(shì)［3］。大量研究表明，鹽敏感性與高血壓有關(guān)，且藏族鹽敏感性檢出率高于我國一般人群［4］。有學(xué)者認(rèn)為，G蛋白偶聯(lián)受體激酶4（GRK4）基因變異與鹽敏感性有關(guān)［5］，既往研究報(bào)道GRK4基因突變可通過引起鈉潴留從而導(dǎo)致血壓升高［6］。進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)，GRK4基因多態(tài)性與高血壓的關(guān)系存在種族差異［7］。在我國，藏族高血壓患病率最高［8］，而目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于藏族人群GRK4基因多態(tài)性與高血壓關(guān)系的研究報(bào)道，也未發(fā)現(xiàn)關(guān)于GRK4基因多態(tài)性與鹽敏感性在高血壓中共同作用的研究。因此，本研究通過分析GRK4基因的6個(gè)SNP基因分型，探討藏族人群GRK4基因多態(tài)性及其與鹽敏感性的交互作用對(duì)高血壓的影響，為進(jìn)一步尋找和確定高血壓的遺傳因素提供研究基礎(chǔ)，為高血壓的防治工作提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 調(diào)查對(duì)象 運(yùn)用OpenEpi軟件計(jì)算樣本量，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，檢驗(yàn)效能1-β=0.80，高血壓組鹽敏感性暴露率為33.8%，對(duì)照組鹽敏感性暴露率為26.0%［9-10］，在考慮到10%的應(yīng)答率后，計(jì)算樣本量至少為1 144例，包括572例原發(fā)性高血壓病患者和572例血壓正常者。2013年8月—2014年11月采用多階段隨機(jī)抽樣的方法，在甘南藏族自治州的8個(gè)市縣中隨機(jī)選取夏河縣和合作市；從夏河縣和合作市中隨機(jī)抽取各5個(gè)村莊/社區(qū)；每個(gè)村莊/社區(qū)根據(jù)提供的名單隨機(jī)抽取自愿參加的藏族成年人（年齡≥18歲）進(jìn)行調(diào)查。本研究共納入1 473例調(diào)查對(duì)象，其中原發(fā)性高血壓病患者799例（病例組）、血壓正常者674例（對(duì)照組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲；（2）病例組為明確診斷為高血壓〔在未使用降壓藥物的情況下，非同日3次測(cè)量診室血壓，收縮壓（SBP）≥ 140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和 /或舒張壓（DBP）≥ 90 mm Hg［2］〕的患者，對(duì)照組為血壓正常人群；（3）祖孫三代（即祖父母、父母及調(diào)查對(duì)象）均為藏族。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）繼發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心?。ǎ?個(gè)月）和腦卒中（＜3個(gè)月）急性期患者；（2）有急、慢性炎癥者；（3）肝腎功能異常者；（4）甲狀腺功能異常者；（5）腫瘤患者；（6）不易配合者（智力、聽力、肢體活動(dòng)明顯障礙）；（7）個(gè)人不愿意參加者；（8）妊娠期和哺乳期婦女。本研究通過了甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（NO：2013-02），調(diào)查對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 問卷調(diào)查 采用項(xiàng)目組統(tǒng)一設(shè)計(jì)的調(diào)查表，對(duì)調(diào)查對(duì)象進(jìn)行“一對(duì)一、面對(duì)面”調(diào)查，內(nèi)容包括性別、年齡、職業(yè)、文化程度、生活行為方式（吸煙、飲酒、體育鍛煉）等。生活行為方式的判斷標(biāo)準(zhǔn)：吸煙，指現(xiàn)在至少1支/d，持續(xù)時(shí)間≥6個(gè)月；戒煙，指調(diào)查對(duì)象以前至少1支/d，現(xiàn)在不吸煙，持續(xù)時(shí)間≥6個(gè)月［11］。飲酒，指飲酒次數(shù)≥1次/周并連續(xù)≥1年；戒酒，指調(diào)查對(duì)象以前飲酒次數(shù)≥1次/周，現(xiàn)在不飲酒并連續(xù)≥1年［12］。體育鍛煉，指每周鍛煉≥3 d，且至少30 min/次［13］。

1.2.2 體格檢查 測(cè)量調(diào)查對(duì)象的血壓、身高、體質(zhì)量，并計(jì)算其體質(zhì)指數(shù)（BMI）〔BMI=體質(zhì)量（kg）/身高（m）2〕。采用電子血壓計(jì)（Microlife 3BTO-A）進(jìn)行血壓測(cè)量，調(diào)查對(duì)象進(jìn)入房間靜坐5 min后開始測(cè)量血壓，每次均測(cè)量兩遍，時(shí)間間隔為30 s，取兩次測(cè)量的平均值進(jìn)行記錄。

1.2.3 鹽敏感性檢測(cè) 采用我國改良后的急性鹽負(fù)荷試驗(yàn)方法［10］，調(diào)查對(duì)象早晨空腹8 h，測(cè)量血壓2次，取其平均值；然后口服1%氯化鈉溶液1 000 ml，30 min內(nèi)飲完，在服用1% 氯化鈉溶液后2 h測(cè)量血壓2次，取其平均值；隨后服用呋塞米40 mg，30、60、120 min后分別測(cè)血壓2次，取其平均值；鹽負(fù)荷2 h的平均動(dòng)脈壓（平均動(dòng)脈壓=1/3收縮壓+2/3舒張壓）與基礎(chǔ)血壓的增幅≥5 mm Hg或服用呋塞米后2 h末平均動(dòng)脈壓與基礎(chǔ)血壓的減幅≥10 mm Hg為有鹽敏感性，否則判為不具有鹽敏感性。

1.2.4 基因檢測(cè) 根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息，使用Assay Design 3.1軟件設(shè)計(jì)合成引物。模板提取和質(zhì)檢，在5 μl溶液中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，溶液內(nèi)包括：緩沖液0.5 μl、MgCl20.4 μl、dNTP 0.1μl、Hotstar 0.2 μl、F Primer/ R Primer 1.0 μl、DNA 1.0 μl、三蒸水（dddH2O）1.8 00μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 2 min，然后94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s擴(kuò)增 45 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。為除去PCR反應(yīng)中多余的dNTP，在PCR 產(chǎn)物中加入 2 μl SAP 酶 Mix（1.530 μl dddH2O，0.17 μl SAP buffer，0.3 μl SAP 酶）。反應(yīng)條件為：37 ℃40 min，85 ℃ 5 min。反應(yīng)完成后降至室溫并 25 ℃保存。隨后進(jìn)行單甲基延伸反應(yīng)，單甲基延伸反應(yīng)液包括：10*iplex buffer 0.2 μl、Terminator mix 0.2 μl、引物0.94 μl、單甲基延伸酶 0.041 μl、dddH2O 0.619 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 30 s，然后 94 ℃ 5 s、52 ℃ 5 s、80 ℃ 5 s（5 個(gè)循環(huán)）、72 ℃ 3 min 共 40 個(gè)循環(huán)，之后進(jìn)行樹脂純化，將處理后的樣品點(diǎn)在樣品靶上，最后使用MALDI-TOF-MS進(jìn)行質(zhì)譜分析，用Typer 4.0軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 質(zhì)量控制 調(diào)查員和實(shí)驗(yàn)室人員經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)、考核合格后對(duì)調(diào)查對(duì)象進(jìn)行調(diào)查和采樣。每日的調(diào)查表由專人檢查、專人保管，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)溝通處理。用EpiData 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)雙人雙錄入并進(jìn)行一致性檢驗(yàn)以保證錄入質(zhì)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，驗(yàn)證基因型分布是否符合H-W定律；采用多因素Logistic回歸分析GRK4基因與鹽敏感性及其交互作用對(duì)高血壓的影響。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組間性別、年齡、職業(yè)、文化程度、吸煙、飲酒、體育鍛煉、收縮壓、BMI、鹽敏感性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間舒張壓比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 GRK4基因多態(tài)性、等位基因分布及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 兩組間GRK4基因的rs2488815、rs12506119、rs1419043、rs1801058基因型和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組間GRK4基因的rs2471338、rs3733219基因型和等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。rs12506119、rs1419043、rs2471338、rs3733219基因型分布符合H-W定律，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；rs2488815和rs1801058基因型分布不符合H-W定律，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 GRK4基因與鹽敏感性及其交互作用對(duì)高血壓影響的多因素Logistic回歸分析 以高血壓（賦值：無=1，有=2）為因變量，以年齡（賦值：連續(xù)變量）、BMI（賦值：連續(xù)變量）、性別（賦值：女=1，男=2）、文化程度（賦值：未上學(xué)=1，小學(xué)=2，初中=3，高中及以上=4）、職業(yè)（賦值：其他=1，待業(yè)或退休=2，在職=3，農(nóng)民或牧民=4）、吸煙（賦值：不吸煙=0，戒煙=1，吸煙=2）、飲酒（賦值：不飲酒=0，戒酒=1，飲酒=2）、體育鍛煉（賦值：每周鍛煉＜3 d=0，每周鍛煉≥3 d=1），鹽敏感性（賦值：無鹽敏感性=0，有鹽敏感性=1），GRK4 基因位點(diǎn)rs12506119（賦值：GG=1，AA=2，GA=3），GRK4基因位點(diǎn)rs1419043（賦值：GG=1，CC=2，CG=3），GRK4 基因位點(diǎn)rs2471338（賦值：AA=1，CC=2，CA=3），GRK4基因位點(diǎn)rs3733219（賦值：TT=1，CC=2，CT=3）為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。在校正了年齡、性別、文化程度、職業(yè)、吸煙、飲酒、體育鍛煉和BMI等混雜因素后，結(jié)果顯示，鹽敏感性是高血壓的危險(xiǎn)因素，rs1419043的CG基因型是高血壓的保護(hù)因素（P＜0.05，見表3）。

表1 兩組一般資料比較Table 1 Comparison of basic characteristics of two groups

表2 GRK4基因多態(tài)性、等位基因分布及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)〔n（%）〕Table 2 Polymorphism，allelic distribution and testing results of Hardy-Weinberg equilibrium of GRK4 gene

基因與鹽敏感性的交互作用分析后結(jié)果顯示，在無鹽敏感性的基礎(chǔ)上，rs12506119的GA基因型、rs1419043的CG基因型是高血壓的保護(hù)因素（P＜0.05）；在鹽敏感性的基礎(chǔ)上，rs12506119的GG基因型、rs1419043的GG基因型、rs2471338的AA基因型、rs3733219的TT基因型及CT基因型是高血壓的危險(xiǎn)因素（P＜0.05，見表4）。

表3 GRK4基因與鹽敏感性對(duì)高血壓影響的多因素Logistic回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of the influence of GRK4 gene and salt sensitivity on hypertension

3 討論

高血壓作為慢性非傳染性疾病，同時(shí)受到遺傳和環(huán)境的影響。本研究發(fā)現(xiàn)鹽敏感性是高血壓的危險(xiǎn)因素。鹽作為高血壓重要的環(huán)境因子之一，其攝入量與血壓呈正相關(guān)［14］。鹽敏感作為連接鹽和高血壓的遺傳基礎(chǔ)，是高血壓的一種中間遺傳表型［15］，會(huì)影響高血壓的發(fā)生發(fā)展。不同人群鹽敏感性的檢出率不同［16］，本研究中高血壓人群和血壓正常人群的鹽敏感性檢出率均高于我國北方人群［17］。

目前關(guān)于GRK4基因與高血壓的研究，主要集中在3種變異體（A142V、A486V及R65L），且在意大利人，澳大利亞白種人和日本人中均發(fā)現(xiàn)與血壓密切相關(guān)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)立于鹽敏感性，GRK4基因rs1419043的CG基因型降低了高血壓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)GRK4基因與高血壓的關(guān)系在不同種族、不同地區(qū)存在著差異，GRK4基因位點(diǎn)A486V多態(tài)性與歐洲人群高血壓呈正相關(guān)，而與東亞人群呈負(fù)相關(guān)［7］。現(xiàn)有的研究均是對(duì)基因位點(diǎn)選點(diǎn)檢測(cè)的，因此GRK4基因與高血壓的關(guān)系還需利用基因組掃描等技術(shù)進(jìn)行全面研究。

表4 基因與鹽敏感性的交互作用對(duì)高血壓影響的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of the influence of gene and salt sensitivity interaction on hypertension

有學(xué)者認(rèn)為GRK4基因變異與鹽敏感性有關(guān)［5］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GRK4A142V轉(zhuǎn)基因小鼠在正常鹽飲食時(shí)會(huì)出現(xiàn)血壓升高，而GRK4A486V轉(zhuǎn)基因小鼠只有在高鹽飲食的情況下才會(huì)出現(xiàn)血壓升高［18］，提示GRK4 基因有可能通過鹽敏感性來影響血壓，而且不同的基因位點(diǎn)的作用不同。在日本原發(fā)性高血壓病患者中GRK4基因3個(gè)位點(diǎn)（R65L，A142V，A486V）的變異可以預(yù)測(cè)其鹽敏感性［19］。本研究發(fā)現(xiàn)在鹽敏感性的基礎(chǔ)上，rs12506119的GG基因型、rs1419043的GG基因型、rs2471338的AA基因型、rs3733219的TT基因型及CT基因型表現(xiàn)為高血壓的危險(xiǎn)因素；在沒有鹽敏感性的作用下，rs12506119的GA基因型表現(xiàn)為高血壓的保護(hù)因素。提示藏族人群GRK4基因?qū)ρ獕旱挠绊懣赡苤饕c鹽敏感性共同作用才能實(shí)現(xiàn)。GRK4基因可以通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)功能增強(qiáng)和腎多巴胺受體受損兩種途徑導(dǎo)致鈉潴留［6-7］，而鈉潴留增加是造成鹽敏感性和鹽不敏感性差異的原因［20］。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)可以維持血壓平衡和鈉穩(wěn)態(tài)［21］，在心血管疾病的發(fā)生中起著非常重要的作用。GRK4基因的變異體，能夠使血管緊張素受體表達(dá)增加，使腎素-血管緊張素系統(tǒng)的功能增強(qiáng)，腎臟的排鈉功能下降，導(dǎo)致過多的鈉潴留，從而引起血壓升高［22］。多巴胺受體位于腎臟，可以通過與腎近曲小管分泌的多巴胺結(jié)合調(diào)節(jié)鈉平衡，從而維持血壓的穩(wěn)定［23］。當(dāng)鹽攝入量增加時(shí)，多巴胺可以通過調(diào)節(jié)超過50%的腎鈉排泄來保持血壓的穩(wěn)定［24］。若腎內(nèi)多巴胺系統(tǒng)的功能失調(diào)將會(huì)導(dǎo)致鹽敏感性高血壓的發(fā)生［25］。既往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在高血壓時(shí)，GRK4 基因的表達(dá)及活性增強(qiáng)，其可以通過調(diào)控多巴胺受體尤其是 D1 樣受體的磷酸化，導(dǎo)致受體的功能受損，從而使腎臟的尿鈉排泄功能發(fā)生障礙［26］，最終形成水鈉潴留和血壓升高。

綜上所述，本研究通過對(duì)甘南藏族自治州藏族人群進(jìn)行GRK4基因多態(tài)性、鹽敏感性對(duì)高血壓影響的研究，首次發(fā)現(xiàn)GRK4基因與藏族人群高血壓有關(guān)，且不同基因位點(diǎn)基因型的作用受到鹽敏感性的影響不同。因?yàn)楸狙芯繘]有進(jìn)行全基因組掃描，不能全面分析GRK4基因的作用，從現(xiàn)有的結(jié)果看rs12506119、rs1419043、rs2471338和rs3733219四個(gè)基因位點(diǎn)分別與鹽敏感性共同影響高血壓，由于研究方法的限定，無法確定GRK4基因與鹽敏感性存在怎樣的關(guān)系，兩者是如何影響血壓的，還需進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn):曹靜、劉希波、王云、胡繼宏進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析；曹靜、劉希波、王淑霞、李明陽進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；曹靜、王云、王淑霞、李明陽進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；曹靜撰寫論文；胡繼宏進(jìn)行論文的修訂，負(fù)責(zé)文章質(zhì)量控制及審校以及對(duì)文章整體負(fù)責(zé)監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。