昆蟲幾丁質(zhì)酶功能研究、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究進(jìn)展

李 妍 李家磊 師獻(xiàn)雪 張俊麗 胡 淼

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453000）

0 引言

幾丁質(zhì)是由多個(gè)N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）經(jīng)由β-1，4糖苷鍵相互連接而成的一種長鏈多聚物，是目前世界上含量?jī)H次于纖維素的生物聚合物[1]。主要有以下三種類型的存在，分別為α-幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)和γ-幾丁質(zhì)，在其組裝和極化方面各有差異[2]。幾丁質(zhì)是具有保護(hù)功能的，存在于真菌的細(xì)胞壁、線蟲的卵殼及昆蟲的外骨骼、腸道、圍食膜和氣管等[3，4]。

幾丁質(zhì)的合成和降解是昆蟲整個(gè)生命周期中重要的生理過程，其中幾丁質(zhì)的降解是由β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶和幾丁質(zhì)酶協(xié)同完成[5]。在昆蟲生長發(fā)育過程中幾丁質(zhì)酶主要參與了其新舊表皮的更替，特別是在幼蟲蛻皮、胚后細(xì)胞發(fā)育、化蛹階段和羽化階段[6]。如果在昆蟲生長發(fā)育期間出現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的過量表達(dá)或嚴(yán)重缺失，都會(huì)嚴(yán)重影響昆蟲的正常生長發(fā)育，所以幾丁質(zhì)酶可以應(yīng)用到害蟲的防治方面，對(duì)人類和環(huán)境來說是安全有效的生物防治方法和策略[7]。

1.1 昆蟲幾丁質(zhì)酶的生理功能

昆蟲幾丁質(zhì)酶可廣泛存在于昆蟲的各個(gè)器官或組織當(dāng)中，貫穿昆蟲的整個(gè)生命周期，其主要存在于蛻皮腺、中腸中，參與昆蟲新舊表皮的更替。昆蟲蛻皮是昆蟲發(fā)育變態(tài)過程中的重要生命過程，在這一過程中相關(guān)酶類的表達(dá)也發(fā)生重大變化。幾丁質(zhì)與表皮蛋白為結(jié)合狀態(tài)，因此幾丁質(zhì)的代謝也是昆蟲蛻皮過程的重要組成部分。在體壁中表達(dá)的幾丁質(zhì)酶主要與昆蟲蛻皮和卵的孵化相關(guān)。中腸的幾丁質(zhì)酶可以消化圍食膜（PM）、腸壁和外骨骼中的幾丁質(zhì)，表明幾丁質(zhì)酶具有應(yīng)用到昆蟲防治方面的潛力。

1.2 昆蟲幾丁質(zhì)酶的分類及功能研究

在昆蟲幾丁質(zhì)酶的分類當(dāng)中，昆蟲幾丁質(zhì)酶大多數(shù)屬18家族糖苷水解酶，其余少數(shù)幾丁質(zhì)酶屬48家族糖苷水解酶[8]，根據(jù)幾丁質(zhì)酶作用位點(diǎn)不同分為外切幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶兩大類[9]，且昆蟲幾丁質(zhì)酶多數(shù)是內(nèi)切酶，可將昆蟲表皮分解為殼寡糖，然后再由外切酶進(jìn)行水解而生成β-N-乙酰葡萄糖胺，在昆蟲生長發(fā)育中形成新的表皮[1]。

近年來，隨著基因組學(xué)和序列分析測(cè)序工作的快速發(fā)展，廣泛利用生物信息學(xué)和基因系統(tǒng)進(jìn)化樹等先進(jìn)技術(shù)和新方法深入分析昆蟲幾丁質(zhì)酶基因，越來越多的昆蟲幾丁質(zhì)酶基因得到廣泛認(rèn)可，如鱗翅目昆蟲、雙翅目昆蟲、膜翅目和半翅目等都有文獻(xiàn)相繼報(bào)道。

RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）是內(nèi)源或外源的雙鏈RNA特異性引起靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的現(xiàn)象。因其特異性和穩(wěn)定性，目前被廣泛應(yīng)用到昆蟲基因功能的研究當(dāng)中。

根據(jù)昆蟲幾丁質(zhì)酶催化區(qū)蛋白氨基酸序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，分為8種類型：Ⅰ型幾丁質(zhì)酶包含1個(gè)信號(hào)肽區(qū)（signal peptide）、1個(gè)催化區(qū)（Catalyticdomain）、1個(gè)糖基化和磷酸化連接區(qū)（linker）和1個(gè)幾丁質(zhì)酶結(jié)合區(qū)（chitin-binding domain，CBD）。RNA干擾沉默赤擬谷盜Ⅰ（Tribolium castaneum）幾丁質(zhì)酶基因TcCHT5（GroupⅠ）導(dǎo)致赤擬谷盜不能蛻去其表面的外殼，褐飛虱（Nilaparvata lugens）中NICht5導(dǎo)致幼蟲死亡和蛻皮異常；在果蠅中DmCht5導(dǎo)致幼蟲蛻皮異常[11]。RNAi試驗(yàn)結(jié)果表明Ⅰ型幾丁質(zhì)酶的作用主要是昆蟲化蛹后水解消化舊的表皮。

Ⅱ型幾丁質(zhì)酶氨基酸序列明顯比Ⅰ型大，在各物種中有一個(gè)代表基因就是CHT10，包含了至少4個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和4～7個(gè)幾丁質(zhì)酶結(jié)合區(qū)。RNA干擾赤擬谷盜中TcCht1的蟲體無明顯表型[11]；在褐飛虱中NICht1則導(dǎo)致幼蟲死亡和蛻皮異常，沉默NICht3則無明顯形態(tài)和存活率改變；在二化螟（Chilo suppressalis）中CsCht1則影響幼蟲化蛹、羽化延遲，沉默CsCht3則導(dǎo)致幼蟲不能化蛹[12]；在中華稻蝗（Oxya chinensis）中沉默OcCht10導(dǎo)致中華稻蝗無法完成蛻皮而死亡[13]；赤擬谷盜中沉默TcCHT10導(dǎo)致幼蟲的蛻皮及化蛹異常；在褐飛虱中沉默NICht10導(dǎo)致幼蟲死亡和蛻皮異常[14]；飛蝗（Locusta migratoria）LmCht10導(dǎo)致飛蝗無法蛻皮而死亡；舞毒蛾（Lymantria dispar）LdCht10導(dǎo)致蟲體無法蛻皮而死亡[15]。

Ⅲ型幾丁質(zhì)酶是由一個(gè)N端跨膜螺旋、兩個(gè)相鄰的催化區(qū)和一個(gè)幾丁質(zhì)酶結(jié)合區(qū)構(gòu)成，推測(cè)是昆蟲化蛹后腹部收縮和翼/鞘擴(kuò)張所必需的。RNA干擾赤擬谷盜中TcCht7則影響翅的發(fā)育；在褐飛虱中NICht7中導(dǎo)致幼蟲死亡和蛻皮異常；在赤擬谷盜中TcCht7則影響翅的發(fā)育；在果蠅中DmCht7導(dǎo)致幼蟲蛻皮異常[16]。

Ⅳ型幾丁質(zhì)酶是由1個(gè)N端信號(hào)肽區(qū)和1個(gè)單一的催化區(qū)組成的，大多數(shù)缺乏CBD，在大多數(shù)昆蟲中，主要在幼蟲時(shí)期表達(dá)。在褐飛虱中NICht4、NICht6無明顯形態(tài)和存活率改變；在二化螟中CsCht4則導(dǎo)致幼蟲死亡[12]；赤擬谷盜的TcCHT6蟲體無表型改變；在果蠅中DmCht6影響蛻皮及干擾成蟲正常的機(jī)翼伸展；褐飛虱NICht8無明顯形態(tài)和存活率改變；赤擬谷盜的TcCHT8則蟲體無表型改變；褐飛虱NICht9導(dǎo)致幼蟲死亡和蛻皮異常；在果蠅中，RNA干擾DmCht9導(dǎo)致了蛻皮異常死亡，DmCht8導(dǎo)致幼蟲蛻皮異常[16]。

Ⅴ型幾丁質(zhì)酶屬于幾丁質(zhì)酶類似蛋白，通常有1個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和1個(gè)N端信號(hào)肽區(qū)，沒有CBD區(qū)，如成蟲盤生長因子（IDGFs）推測(cè)它可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增值與分化。

Ⅵ型昆蟲幾丁質(zhì)酶與Ⅰ型幾丁質(zhì)酶具有類似結(jié)構(gòu)，一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)催化區(qū)和一個(gè)CBD，但是與Ⅰ型不同的是，Ⅵ型幾丁質(zhì)酶C-端CBD后含有一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸殘基富含區(qū)域高度糖基化修飾，推測(cè)有抗蛋白酶功能。

Ⅶ型昆蟲幾丁質(zhì)酶包含一個(gè)催化區(qū)和一個(gè)N端信號(hào)肽，無CBD。RNAi實(shí)驗(yàn)中，在褐飛虱中NICht2無明顯形態(tài)和存活率的改變；在二化螟中CsCht2則導(dǎo)致幼蟲死亡；在果蠅中DmCht2蛻皮異常。在不同昆蟲中，表現(xiàn)出不同的功能，具體原因需進(jìn)一步研究。

Ⅷ型昆蟲幾丁質(zhì)酶有一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，推測(cè)為膜相關(guān)蛋白。

綜上所述，通過注射特異的雙鏈RNA，致使幾丁質(zhì)酶基因沉默，在不同的昆蟲當(dāng)中，相同類型的幾丁質(zhì)酶，產(chǎn)生的效應(yīng)和表型也存在差別。但幾丁質(zhì)酶Cht10基因，在多數(shù)昆蟲中如褐飛虱、赤擬谷盜、飛蝗和舞毒蛾中都影響了幼蟲的蛻皮而致其死亡。

2 昆蟲幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.1 昆蟲幾丁質(zhì)酶的基本性質(zhì)

昆蟲幾丁質(zhì)酶的分子量多數(shù)在40～85 kDa，酶活性的最適pH值一般在4～8之間，最適反應(yīng)溫度在40～60℃，幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性良好，一般在4～60℃較為穩(wěn)定，pI多數(shù)在4～8之間，重金屬對(duì)幾丁質(zhì)酶活性具有不同程度的影響，大多數(shù)重金屬抑制幾丁質(zhì)酶活性。

2.2 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定方法

幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定技術(shù)一般分為兩種類型：定性分析和定量分析。定性分析方法主要利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，添加幾丁質(zhì)為底物，利用幾丁質(zhì)酶可以分解幾丁質(zhì)，在電泳結(jié)束后看凝膠上產(chǎn)生的條帶以此定性分析幾丁質(zhì)酶活性，或者用樣本（含幾丁質(zhì)酶）直接和膠狀幾丁質(zhì)培養(yǎng)基反應(yīng)，觀察出現(xiàn)透明圈大小和清晰程度，以此判斷幾丁質(zhì)酶活性。定量分析目前有很多方法，原理主要是通過測(cè)定底物（幾丁質(zhì)）與酶（幾丁質(zhì)酶）發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物的量，如用DNS法測(cè)產(chǎn)物的還原糖[17]，F(xiàn)olin-酚法測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖量。另外還有一種方法應(yīng)用比較廣泛，利用幾丁質(zhì)酶水解人工合成的寡聚物4MU-（GlcNAc）n，測(cè)定反應(yīng)中產(chǎn)物的量反映幾丁質(zhì)酶的活性，如以4MU-（GlcNAc）3為底物被幾丁質(zhì)酶水解后可以釋放具有熒光的4MU，而底物本身不具有熒光值，在特定的波長范圍內(nèi)測(cè)定產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，可反映幾丁質(zhì)酶的活性[18]，因熒光分析靈敏度較高，所以現(xiàn)在多采用此方法分析幾丁質(zhì)酶的活性。

3 昆蟲幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用

幾丁質(zhì)雖然是世界上含量?jī)H次于纖維素的生物聚合物，但在高等生物體內(nèi)并不存在幾丁質(zhì)，所以人們可以利用幾丁質(zhì)酶防治害蟲而對(duì)環(huán)境和人類不產(chǎn)生危害。目前昆蟲幾丁質(zhì)酶已經(jīng)應(yīng)用到多個(gè)方面，如可作為轉(zhuǎn)基因作物、病毒增效、生物殺蟲或殺菌劑以及幾丁質(zhì)廢物利用等。

3.1 幾丁質(zhì)酶在生物防治方面的應(yīng)用

因幾丁質(zhì)酶單獨(dú)作用的殺蟲效果并不顯著，但是把幾丁質(zhì)酶添加在殺蟲劑和抗真菌劑中卻具有增效作用，同時(shí)能夠減少使用劑量達(dá)到同等效用，在病原生物控制劑研究方面可以聯(lián)合用藥，防止過量化學(xué)藥劑破壞環(huán)境和對(duì)人體健康造成危害[19]。多種幾丁質(zhì)酶的協(xié)同作用高于一種幾丁質(zhì)酶的作用，可以研究幾丁質(zhì)酶和蛋白酶之間的聯(lián)合應(yīng)用以提高實(shí)際殺蟲效果，如Kunert等將純化的幾丁質(zhì)酶CH143與其他3種蛋白酶結(jié)合處理根結(jié)線蟲（Globbodera pallida）的蟲卵表面，使蟲卵出現(xiàn)傷痕和破損，寄生在卵上的真菌會(huì)迅速侵染蟲卵導(dǎo)致線蟲死亡，達(dá)到控制害蟲的目的[20]。同時(shí)，幾丁質(zhì)酶也可以防止果蔬采摘后病原微生物引發(fā)的腐爛，防止在貯藏和運(yùn)輸過程中造成經(jīng)濟(jì)損失及危害人體健康，具有經(jīng)濟(jì)效益[21]。此外，應(yīng)用重組技術(shù)開發(fā)昆蟲病原體為害蟲生物防治提供了潛在的新方法。昆蟲專一性的病原微生物（如桿狀病毒）也是生物防治的重要載體，具有宿主范圍窄、對(duì)脊椎動(dòng)物無毒和環(huán)境友好等特征，將昆蟲幾丁質(zhì)酶與桿狀病毒聯(lián)合應(yīng)用，可增強(qiáng)桿狀病毒的殺蟲活性。Gopalakrishnan等人在苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）加入了煙草天蛾幾丁質(zhì)酶合成重組病毒，將重組病毒注射入蟲體，調(diào)節(jié)煙草天蛾幼蟲中的幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組死亡率明顯高于對(duì)照組[22]。范曉軍等用東亞鉗蝠昆蟲神經(jīng)毒素基因和煙草天蛾幾丁質(zhì)酶基因，以AcMNPV為載體，合成重組病毒注射于中國棉鈴蟲中，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組殺蟲率升高，而將重組病毒感染小鼠，小鼠生理指標(biāo)均正常，此類殺蟲劑對(duì)哺乳類動(dòng)物安全。由此可見，昆蟲幾丁質(zhì)酶和昆蟲病原病毒聯(lián)用是具有發(fā)展成為新型生物殺蟲劑的巨大潛力[23]。

3.2 昆蟲幾丁質(zhì)酶在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用

有研究表明，植物幾丁質(zhì)酶基因或細(xì)菌幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因作物，可以使植物獲得對(duì)病原體的抗性，昆蟲幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因植物也獲得了良好的昆蟲防治效果。Masoud和Ding等將來源不同的四種幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因用到煙草中，實(shí)驗(yàn)研究表明，用細(xì)菌或植物幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因的煙草喂食蟲體對(duì)蟲體無任何影響，而用昆蟲幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因的煙草喂食的幼蟲則出現(xiàn)死亡[24]，結(jié)果表明，昆蟲幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因植物具有良好的抗蟲效果。張志云和張虎生等將煙草天峨的幾丁質(zhì)酶和東亞鉗蝠昆蟲的神經(jīng)毒素轉(zhuǎn)基因到棉花中，明顯提高了棉花對(duì)棉鈴蟲的抗性[25]。Gatehous等將昆蟲幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因到馬鈴薯中，提高了植物對(duì)蚜蟲的抗性[26]。Gamal等將棉貪夜蛾的幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因到玉米中，用轉(zhuǎn)基因玉米植物飼養(yǎng)玉米蛀蟲，50%昆蟲則出現(xiàn)死亡，且轉(zhuǎn)基因玉米植物還具有較強(qiáng)的抗鏈球菌抗性[27]。

昆蟲幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因作物雖然有明顯的效果，但是昆蟲幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因的植物作為一種口入殺蟲劑對(duì)抗害蟲，其抗蟲害的效用與害蟲的圍食膜或害蟲的圍食膜厚度有著密切關(guān)系，如果害蟲圍食膜過厚或根本沒有圍食膜的生理結(jié)構(gòu)，則達(dá)不到理想的殺蟲效果，同時(shí)在轉(zhuǎn)基因植物中昆蟲幾丁質(zhì)酶的表達(dá)易被降解，導(dǎo)致其殺傷效果不顯著，在實(shí)際應(yīng)用上仍存在許多難題，但隨著科技的進(jìn)步和研究的深入，昆蟲幾丁質(zhì)酶基因?qū)?huì)得到越來越多的應(yīng)用。

4 結(jié)語與展望

幾丁質(zhì)酶是昆蟲發(fā)育過程中蛻皮和圍食膜降解的關(guān)鍵酶，是昆蟲發(fā)育研究和探索害蟲控制新策略的重要途徑之一。幾丁質(zhì)酶過量或者缺失的表達(dá)都會(huì)對(duì)昆蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，而在高等動(dòng)植物中本身不含有幾丁質(zhì)，所以幾丁質(zhì)酶對(duì)其他高等動(dòng)植物來說不具有損害，相對(duì)于環(huán)境和人體來說都比較安全。轉(zhuǎn)基因植物能提高農(nóng)作物對(duì)害蟲的抗性，利用桿狀病毒專一性殺害害蟲等，可見昆蟲幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用前景極為廣泛。

RNA干擾技術(shù)已是公認(rèn)的研究昆蟲基因功能的重要方法，用來篩選防治有害醫(yī)學(xué)昆蟲的藥物靶標(biāo)，有助于加快新型生物農(nóng)藥的研制，在有害昆蟲的防治方面將受到越來越多的重視。