基于生物信息學(xué)的人P2X7R 結(jié)構(gòu)分析及功能預(yù)測

張云芳，羅淑萍，李明萱，彭效祥，趙榮蘭

（濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，山東濰坊 261053）

核苷酸是核酸分子中的關(guān)鍵亞基，為細(xì)胞代謝提供能量，同時又可釋放至胞外，生理上充當(dāng)胞外信使或在病理情況下充當(dāng)危險信號［1，2］。胞外核苷酸可通過激活嘌呤受體P2 發(fā)揮作用。P2 受體分為G 蛋白耦聯(lián)型P2Y 受體和離子型P2X 受體。目前，P2X 受 體 可 以 分 成P2X1-7 七 種 亞 型［3］。其 中，P2X7R 是細(xì)胞外ATP 門控的非選擇性陽離子通道受體，允許K+、Ca2+、Na+3 種陽離子通過［4，5］。該受體廣泛表達(dá)于多種造血系細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞中小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞表面也存在P2X7R 的表達(dá)［6-8］。P2X7R 分布廣泛，可通過多種信號通路參與調(diào)節(jié)組織及細(xì)胞的生理功能，影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。

研究證明，P2X7R 的激活可引起多種細(xì)胞反應(yīng)，例如質(zhì)膜成分和形態(tài)的改變，胞外區(qū)脫落，脂肪酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子的激活，以及細(xì)胞因子的釋放［9］。Baricordi 等［10］將P2X7R 轉(zhuǎn)染至LG14 和K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P2X7R 可增強(qiáng)細(xì)胞增殖。P2X7R 參與腫瘤及炎癥的發(fā)生發(fā)展，炎癥與腫瘤相關(guān)，惡性腫瘤可在慢性炎癥發(fā)生的部位發(fā)展，且炎癥可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生；而腫瘤細(xì)胞釋放的ATP 可作為P2X7R 的天然激動劑，通過激活P2X7R 參與炎癥過程［11-13］。P2X7R 也可參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤，及侵襲等［14-16］。因此，針對P2X7R 的靶向治療可能成為抗腫瘤的新途徑，同時也可為P2X7R 相關(guān)的炎癥性疾病提供新的治療手段。目前，雖然對人P2X7 受體蛋白的研究逐漸深入，但對人P2X7R 蛋白結(jié)構(gòu)及功能的生物信息學(xué)分析研究的報道較少。本研究用生物信息學(xué)方法對P2X7R 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，為研究及開發(fā)其功能提供資料，為疾病的臨床診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

登錄NCBI 主頁獲取人和其他物種P2X7R 的氨基酸序列，包括人（CAA73360.1）、小家鼠（CAA08853.1）、褐家鼠（CAA65131.1）、錫金小鼠（XP_021042566.1）、倭黑猩猩（XP_003832417.1）、獼猴（XP_001092531.2）。

1.2 方法

以從NCBI 獲得的氨基酸序列為材料，登錄ProtParam 網(wǎng)站分析蛋白序列的氨基酸數(shù)，分子量理論等電點（PI）、半衰期、穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族指數(shù)和總平均親水性。利用TMHMM、ProtScale 及SignalP 5.0 Server 分別分析蛋白跨膜區(qū)域、親水/疏水性和信號肽。利用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)由Sopma、Swiss-Model 和Structural Analysis 和Verification Server 進(jìn)行預(yù)測。利用String 分析蛋白質(zhì)的相互作用。利用ABCpred預(yù)測人P2X7R 蛋白可能的B 細(xì)胞抗原表位。利用ProPred 軟件預(yù)測候選Th 抗原表位。利用CTLPred 預(yù) 測 人P2X7R 蛋 白 的CTL 細(xì) 胞 抗 原 表 位，算法基于支持向量機(jī)法（Support vector machine，SVM）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法（Artificial neural network，ANN），兩種方法聯(lián)合預(yù)測具有較高的靈敏度和特異性。

2 結(jié)果

2.1 人P2X7R 蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測

利用ProtParam 對人P2X7R 蛋白進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)該受體蛋白由595 個氨基酸組成，負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為62，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為75。其中，含量最多的氨基酸是亮氨酸，占8.1%，其次是絲氨酸、纈氨酸及精氨酸，分別占6.7%、6.6%及6.6%，甲硫氨酸的含量最少，僅占1.3%，吡咯賴氨酸及硒半胱氨酸含量均為0，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 人P2X7R 蛋白氨基酸種類及含量Fig 1 Type and content of amino acid of human P2X7R

對6 個不同物種P2X7R 蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如表1，在這6 個不同物種中，P2X7R 基因編碼的氨基酸個數(shù)均為595，相對分子質(zhì)量非常接近，在68 300～68 700，各物種IP 8.30～8.90，說明P2X7R 蛋白是堿性蛋白；P2X7R 蛋白在6 種物種中的半衰期均為30 h，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，推斷這6 種物種中的P2X7R 蛋白是不穩(wěn)定蛋白；各物種的P2X7R 蛋白的脂肪族指數(shù)72.37～76.94，總平均親水性均為負(fù)值，說明這6 中物種P2X7R 蛋白均為親水蛋白質(zhì)。

表1 6 個不同物種P2X7R 蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測Tab 1 Prediction of physicochemical property of P2X7R protein of six different species

2.2 人P2X7R 蛋白跨膜域、親水性/ 疏水性、信號肽分析

利用TMHMM 軟件對人P2X7R 蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果如圖2 所示，人P2X7R 蛋白為兩次跨膜蛋白質(zhì)。登錄ProtScale 在線軟件分析人P2X7R蛋白親水性/疏水性，結(jié)果見圖3，得分最大處位于第39 個氨基酸，得分為2.600；最小位于第303 氨基酸處，得分為?2.600，且大部分氨基酸分值為負(fù)值，表明大部分氨基酸位點具有較強(qiáng)的親水性，推測該蛋白為親水性蛋白，這與ProtParam 結(jié)果一致。用SignalP 5.0 軟件對人P2X7R 蛋白進(jìn)行分析，顯示信號肽的可能性為0.0021，未發(fā)現(xiàn)信號肽區(qū)域，信號肽是分泌蛋白的標(biāo)志，故可推測該蛋白不屬于分泌蛋白，見圖4。

圖2 人P2X7R 蛋白跨膜區(qū)域分析Fig 2 Transmembrane domain analysis of human P2X7R protein

圖3 人P2X7R 蛋白的親水性/疏水性結(jié)果Fig 3 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of human P2X7R protein

圖4 人P2X7R 蛋白的信號肽區(qū)域分析Fig 4 Signal peptide analysis of human P2X7R protein

2.3 人P2X7R 蛋白的同源性預(yù)測和系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中分別下載人、小家鼠、褐家鼠、錫金小鼠、倭黑猩猩、獼猴的氨基酸序列，與人的氨基酸序列，利用ClustalW 程序?qū)π蛄羞M(jìn)行比對，并將比對結(jié)果進(jìn)行分析，使用MEGA-X 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5、6 顯示，6 個物種之間的氨基酸序列差別不大，且人與倭黑猩猩、獼猴的親緣關(guān)系較近。

圖5 P2X7R 氨基酸序列同源性分析Fig 5 Homology analysis of amino acid sequences of P2X7R

圖6 P2X7R 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig 6 Phylogenetic tree of P2X7R protein

2.4 人P2X7R 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

登錄在線軟件Sopma 對人P2X7R 蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖7。 人P2X7R 蛋白含26.39% α-螺旋、5.21% β-轉(zhuǎn)角和48.40%無規(guī)則卷曲、20.00%延伸鏈。α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角是比較有序的蛋白二級結(jié)構(gòu)，具有較高的穩(wěn)定性。P2X7R 蛋白中α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角的總含量為31.60%，可推測該蛋白二級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，且該蛋白無規(guī)則卷曲含量較高，可能存在抗原表位。

圖7 人P2X7R 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig 7 Secondary structure prediction of human P2X7R protein

2.5 人P2X7R 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能在一定程度上與其空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，能充分了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能之間的相關(guān)性。登錄Swiss-Model 在線預(yù)測軟件構(gòu)建人P2X7R 蛋白的三級結(jié)構(gòu)圖，結(jié)構(gòu)預(yù)測過程中所選用的蛋白質(zhì)模型與人P2X7R 的序列相似度80.34%，覆蓋率為100%，可靠性較高。對同源建模的相似性波形圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相似性波形圖整體預(yù)測值較高且較為穩(wěn)定，結(jié)果如圖8。

圖8 人P2X7R 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及相似性波形圖Fig 8 Tertiary structure prediction and similarity waveform of human P2X7R protein

為了進(jìn)一步驗證模型的可靠性，用拉曼圖對模型氨基酸殘基的合理性進(jìn)行分析，使用網(wǎng)站Structural Analysis and Verification Server 對模型進(jìn)行拉曼圖分析，得到如圖9 結(jié)果。拉曼圖中90%以上氨基酸殘基落在支持區(qū)內(nèi)為高質(zhì)量模型，預(yù)測結(jié)果顯示，僅0.40%氨基酸殘基在不允許區(qū)域內(nèi)，90.90%氨基酸殘基落在支持區(qū)內(nèi)，這說明該預(yù)測模型中大部分氨基酸可形成合理的二面角，構(gòu)成的蛋白結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，合理性較高。因此，Swiss-Model 預(yù)測得到的人P2X7R 蛋白質(zhì)的模型較為穩(wěn)定可靠。

圖9 人P2X7R 蛋白拉曼圖分析Fig 9 Ramachandran plot analysis of human P2X7R protein

2.6 蛋白的相互作用分析

登錄String 網(wǎng)站對人P2X7R 蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測，結(jié)果見圖10。預(yù)測得到10 個與P2X7R 相互作用密切的蛋白及預(yù)測得分見表2。通過對與人P2X7R 蛋白相互作用最緊密的蛋白質(zhì)進(jìn)行得分分析可知，與人P2X7R 蛋白相互作用的蛋白主要為嘌呤受體、離子通道相關(guān)蛋白以及信號通路相關(guān)蛋白。研究顯示，P2X7R 作為一種嘌呤受體可被ATP 激活，在ATP 作用下可形成非選擇性離子通道，允許鈣離子、鈉離子流出以及鉀離子流入，從而激活下游的信號通路［17，18］。

表2 與人P2X7R 相互作用的蛋白質(zhì)Tab 2 Proteins interacting with the human P2X7R

圖10 人P2X7R 蛋白的相互作用預(yù)測Fig 10 Protein-protein interaction of human P2X7R protein

2.7 B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測

利用ABCpred 軟件預(yù)測人P2X7R 蛋白B 細(xì)胞抗原表位（長度：16 mer；閾值：0.9），經(jīng)篩選和得分結(jié)果如表3。結(jié)果顯示504～519，468～483，113～128，209～224 位氨基酸殘基存在優(yōu)勢B 細(xì)胞抗原表位。

表3 人P2X7R 蛋白B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測Tab 3 B cell epitope prediction of human P2X7R protein

2.8 Th、CTL 細(xì)胞抗原表位預(yù)測

使用ProPred 在線軟件對人P2X7R 蛋白Th 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析，選擇MHC-II 表型為HLADRB1*0101、*0301、*0401、*0701、*0801、*1101、*1301、*1501 七種中國人最常見的多肽類型進(jìn)行分析，經(jīng)篩選整合綜合分析后，結(jié)果如表4 所示，發(fā)現(xiàn)333～341 位的VVYIGSTLS 是七種多肽類型共有序列，因此，VVYIGSTLS 可成為人P2X7R 的候選表位。

表4 人P2X7R 蛋白Th 細(xì)胞抗原表位預(yù)測Tab 4 Prediction of Th cell epitope of human P2X7R protein

續(xù)表

使用CTLpred 在線軟件，采用結(jié)合ANN 和SVM 聯(lián)合的方法預(yù)測出人P2X7R 蛋白的潛在CTL表位并對其進(jìn)行打分（截斷值為ANN：0.51，SVM：0.36），結(jié)果如表5 所示，綜合得分最高的序列為270～278 位RPKYSFRRL，244～252 位DVAIQGGIM，288～296 位YPGYNFRYA。

表5 人P2X7R 蛋白CTL 抗原表位預(yù)測Tab 5 CTL epitope prediction of human P2X7R protein

3 討論

P2X7R 是P2X 家族中最晚被克隆的，以ATP為配體，激活后可引起細(xì)胞膜發(fā)生去極化，形成非選擇性離子通道，影響離子跨膜梯度。研究表明，P2X7R 參與人體內(nèi)多種生理活動。Zhang 等［19］通過研究大腸癌患者，發(fā)現(xiàn)P2X7R 高表達(dá)的患者生存期會降低，且P2X7R 的表達(dá)與大腸癌轉(zhuǎn)移成正比。Xia 等［20］通 過 使 用 激 動 劑ATP 及BzATP 激 活P2X7R，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移；敲除P2X7R 后，癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移明顯受到抑制。因此，P2X7R 有可能會成為乳腺癌治療的一個潛在靶點。已有研究證明，胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞表達(dá)P2X7R，該受體調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、死亡、遷移和侵襲，可能成為治療胰腺導(dǎo)管腺癌的一個重要調(diào)控點，并為其它腫瘤的治療提供重要的思路［21］。P2X7R 不僅參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，還參與炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性干燥綜合征等均涉及NLRP3 炎癥體的活化［22-24］。研究證明P2X7R 和NLRP3 炎性體的激活在人類頭頸部鱗癌的生存和侵襲中起重要作用［25］，利用P2X7R 在疾病中的作用機(jī)制可以為治療疾病以及藥物的研發(fā)提供新的思路。生物信息學(xué)分析對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的闡明具有重要意義，可利用生物信息學(xué)分析軟件對蛋白質(zhì)之間的相互作用、調(diào)控及結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，能夠更好的使人們了解蛋白質(zhì)在體內(nèi)的作用，因此，對P2X7R 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析有助于進(jìn)一步了解其在疾病中發(fā)揮的作用。

本研究利用生物信息學(xué)對人P2X7R 蛋白的部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過Prot Param、TMHMM 軟件分析，闡明了人P2X7R 結(jié)構(gòu)的基本信息。理化性質(zhì)分析可知該蛋白的等電點8.62，且正電荷殘基數(shù)比負(fù)電荷殘基數(shù)要多，可以與某些帶有負(fù)電荷的基團(tuán)結(jié)合，從而發(fā)揮功能。P2X7R 蛋白氨基酸組成中，亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸及精氨酸所占比重較高，其中，亮氨酸可與纈氨酸可調(diào)節(jié)血糖濃度，而絲氨酸和精氨酸可參與免疫反應(yīng)，提示P2X7R 蛋白在某些免疫性疾病及血糖引起的疾病中可發(fā)揮一定的效應(yīng)。P2X7R 蛋白的半衰期長達(dá)30 h，提示該蛋白可作為抗原在體內(nèi)發(fā)揮長久作用，從而提高宿主的免疫功能。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及氨基酸親水性參數(shù)與抗原表位的形成有關(guān)，Hopp 等［26］提出親水性氨基酸殘基可對抗原表位進(jìn)行預(yù)測，且二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲多位于細(xì)胞表面，更易結(jié)合抗體，因此，更易形成抗原表位［27］。親疏水性分析P2X7R 蛋白是一種親水性蛋白，且二級結(jié)構(gòu)中主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈及β-轉(zhuǎn)角等組成，無規(guī)卷曲占比例較高，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定且有利于形成抗原表位；通過SignalP5.0、TMHMM 軟 件 分 析 表 明P2X7R 蛋 白 不 含信號肽，并具有2 個跨膜域，說明該蛋白質(zhì)是膜相關(guān)蛋白并非分泌蛋白。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型經(jīng)驗證也具有較高的穩(wěn)定性，可信度較高。通過分析蛋白互相作用顯示人P2X7R 與炎癥信號通路存在相關(guān)性。本研究中分別使用ABCpred、Propred、CTLpred 預(yù)測人P2X7R 蛋白的細(xì)胞抗原表位，最終獲得優(yōu)勢B細(xì)胞、Th 細(xì)胞及CTL 細(xì)胞抗原表位，細(xì)胞抗原表位的預(yù)測對研發(fā)P2X7R 蛋白表位疫苗具有重要意義。本研究通過生物信息學(xué)的方法得到的人P2X7R 蛋白的預(yù)測結(jié)果具有可靠性，對后期研究人P2X7R 蛋白參與的生理功能和機(jī)制研究具有指導(dǎo)意義。