咖啡因與光照誘導斑馬魚睡眠剝奪模型行為學研究

冉思邈，譚愛華，石和元，王 平

（湖北中醫(yī)藥大學老年醫(yī)學研究所，湖北武漢 430065）

斑馬魚容易大規(guī)模飼養(yǎng)，3 個月可性成熟，雌魚每周可產(chǎn)卵1 次，每次產(chǎn)卵約為200～300枚，受精在體外完成，透明可見，便于觀察。由于斑馬魚與人類基因同源性高，可作為多種實驗動物模型的斑馬魚備受科研工作者的青睞。目前斑馬魚睡眠剝奪的方式主要有光照、咖啡因、持續(xù)流動水流、感官刺激、電刺激、物理搖晃等方式［1-4］。其中持續(xù)流動水流、感官刺激和電刺激需要專用的儀器與設備，而作為誘導睡眠剝奪方便快捷方式的光照與咖啡因對實驗室要求較低，運用較多。但使用光照與咖啡因進行睡眠剝奪后，兩者對斑馬魚行為學影響有何差異未見報道，本研究對兩種方式誘導斑馬魚睡眠剝奪模型后表型和行為學改變進行了比較。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物采用野生型AB 系斑馬魚，購自中國科學院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學老年醫(yī)學研究所斑馬魚實驗室。斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進行，斑馬魚幼魚生長到5 dpf 時神經(jīng)系統(tǒng)與器官已基本發(fā)育成熟，故本次實驗采用5 dpf 的幼魚進行。飼養(yǎng)條件如下：魚房溫度為（28.5±1）℃，光暗條件為14∶10 h 循環(huán)交替，養(yǎng)魚水pH 值為7.0～8.0，在此期間斑馬魚可從自身卵黃囊中獲取營養(yǎng)，無需喂食。

1.2 主要試劑及儀器

咖啡因（CAS. NO. 58-08-2），體視顯微鏡（PXS-1020，上海蔡康光學儀器有限公司），斑馬魚行為分析系統(tǒng)（Videotrack Track 3.5，法國View Point Life Sciences），96 孔板（Nest Biotech，批號：701001）。

1.3 方法

1.3.1 藥 物 制 備 配 置 濃 度 為200 μ mol/L［5］的咖啡因養(yǎng)魚水溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 動物分組及造模方法 將72 尾5 dpf 斑馬魚幼魚隨機分為3 組，每組24 尾，即空白對照組、咖啡因組、光照組。造模條件：空白對照組斑馬魚正常飼養(yǎng)24 h，咖啡因組斑馬魚在空白對照組基礎上持續(xù)暴露在咖啡因濃度為200 μmol/L 的養(yǎng)魚水中24 h，光照組斑馬魚在空白對照組基礎上予200 lux［6］的光照條件刺激24 h，重復3 次實驗。3 組幼魚均飼養(yǎng)于直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中總溶液量均為10 mL。

1.3.3 觀察指標 （1）模型評價：造模結束后用斑馬魚行為學分析系統(tǒng)追蹤各組斑馬魚運動時間，檢測時間為1 h；（2）光鏡下觀察各組斑馬魚表型的變化；（3）用斑馬魚行為學分析系統(tǒng)追蹤各組斑馬魚的運動時間及距離，設置追蹤參數(shù)小運動為＜4 mm/s，中運動為4～20 mm/s，大運動為＞20 mm/s，計算各組魚的運動、靜息時間以及運動距離，檢測時間為1 h。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)運用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以（±s）表示，采用多組間單因素方差分析方法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 咖啡因與光照誘導斑馬魚睡眠剝奪模型評價

造模結束后用斑馬魚行為學分析系統(tǒng)追蹤斑馬魚的運動情況，3 組斑馬魚均存在大、中、小運動，其中軌跡圖中黑色軌跡代表小運動，綠色軌跡代表中運動，紅色軌跡代表大運動。光照組斑馬魚活動時間較空白對照組明顯增多（P＜0.01），咖啡因組斑馬魚活動時間較空白對照組增多（P＜0.05），光照組與咖啡因組斑馬魚活動時間未見明顯差異（P＞0.05）。具體見圖1及表1。

表1 各組斑馬魚運動時間（±s）Tab 1 Activity time of zebrafish in each group（±s）

表1 各組斑馬魚運動時間（±s）Tab 1 Activity time of zebrafish in each group（±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.01,#P＜0.05。

運動時間（s）221.19±127.40 472.15±276.68*373.56±289.34#6.52 0.003組別空白對照組光照組咖啡因組n 24 24 24 FP

圖1 各組斑馬魚運動行為軌跡Fig 1 Behavioral trajectories of zebrafish in each group

2.2 各組斑馬魚表型的比較

用光鏡觀察3 組斑馬魚，空白對照組斑馬魚頭部色素發(fā)育較光照組和咖啡因組深（圖中綠色箭頭所指），光照組與咖啡因組卵黃囊出現(xiàn)水腫（圖中紅色箭頭所指），具體見圖2。

圖2 各組斑馬魚表型圖（×20）Fig 2 Phenotypic image of zebrafish in each group（×20）

2.3 各組斑馬魚靜息、運動時間比較

在1 h 的行為追蹤過程中，各組斑馬魚均以靜息狀態(tài)為主，光照組與咖啡因組斑馬魚靜息時間均較空白對照組減少（P＜0.05～0.01），光照組與咖啡因組斑馬魚靜息時間未見明顯差異（P＞0.05）；光照組小運動時間較空白對照組與咖啡因組均明顯增多（P＜0.01）；咖啡因組斑馬魚中運動時間多于空白對照組（P＜0.01）；3 組斑馬魚大運動時間未見明顯差異（P＞0.05）。具體見表2。

表2 各組斑馬魚靜息、運動時間對比（n=24，s，±s）Tab 2 Comparison of resting and activity time of zebrafish in each group（n=24，s，-x±s）

表2 各組斑馬魚靜息、運動時間對比（n=24，s，±s）Tab 2 Comparison of resting and activity time of zebrafish in each group（n=24，s，-x±s）

注：光照組與空白對照組相比，*P＜0.01，與咖啡因組相比，△P＜0.01。咖啡因組與空白對照組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

大運動時間2.11±4.91 2.60±6.52 2.08±7.06 0.05 0.947 6組別空白對照組光照組咖啡因組FP靜息時間3 378.81±127.40 3 127.85±276.68*3 226.45±289.34#6.52 0.002 5小運動時間101.91±43.50 264.43±179.85*△79.58±51.94 19.84 0.000 0中運動時間117.16±123.04 206.22±239.35 291.90±294.53##3.45 0.037 2

2.4 各組斑馬魚運動距離的比較

在1 h 的行為追蹤過程中，3 組斑馬魚大小運動距離均未見明顯差異（P＞0.05）。 具體見表3。

表3 各組斑馬魚運動距離比較（n=24，mm，±s）Tab 3 Comparison of movement distance of zebrafish in each group（n=24，mm，±s）

表3 各組斑馬魚運動距離比較（n=24，mm，±s）Tab 3 Comparison of movement distance of zebrafish in each group（n=24，mm，±s）

組別大運動距離小運動距離空白對照組光照組咖啡因組FP 29.64±10.28 30.18±10.50 7.80±2.37 1.39 0.255 6 341.25±150.52 390.38±258.29 380.48±209.35 0.37 0.695 5

3 討論

失眠是常見的睡眠問題，以頻繁而持續(xù)的入睡困難和睡眠維持困難并導致睡眠感不滿意為主要表現(xiàn)。在成年人之間，有10%～15%的人群符合失眠的診斷標準，2006 年中國睡眠研究會在我國6 個城市的調查報告顯示有57%的人群具有失眠的癥狀。失眠嚴重影響了患者的身心健康，影響了患者的生活、工作質量，甚至因為長期不能獲得正常睡眠導致精神狀態(tài)不佳而出現(xiàn)交通事故等意外，嚴重危及了個人和社會公共安全。有研究顯示，失眠伴有明顯功能損害的患者每年的財政負擔約為5 010美元/人，因此長期的失眠對個人和社會均造成了嚴重的負擔［7］。研究失眠的發(fā)病機制以及尋找行之有效的防治辦法有十分重要的醫(yī)學價值和社會意義。目前對于失眠的機制研究主要仍依靠動物進行，主要包括大鼠、小鼠、斑馬魚、貓、果蠅等動物。對于如何造成動物失眠，人為地進行睡眠剝奪是造成動物失眠的有效方式。而目前針對不同的動物具有不同方式進行睡眠剝奪，應激、特殊環(huán)境、藥物是三大最常見的睡眠剝奪方式［8］。其中應激方式包括心理、陌生環(huán)境、創(chuàng)傷、水面平臺、慢性不可預知應激因素；特殊環(huán)境方式則包括噪音、低氧、低壓環(huán)境；藥物主要包括咖啡因、對氯苯丙氨酸、酒精等。

斑馬魚作為一種新型模式生物，具有體積小、繁殖快、成本低等優(yōu)勢，且體外受精，胚胎透明可見，方便觀察其生長發(fā)育過程，目前已經(jīng)成為各個領域備受青睞的生物模型。斑馬魚生活在熱帶淡水中，具有明顯的晝夜節(jié)律，與人類基因同源性高，斯坦福大學團隊［9］對幼年斑馬魚的睡眠進行了研究，發(fā)現(xiàn)了其與人類慢波睡眠和快速眼動睡眠相似的慢爆發(fā)睡眠和傳播波睡眠，所以選擇斑馬魚作為失眠動物模型具有良好的優(yōu)勢。但關于斑馬魚的睡眠功能目前尚不十分明確，目前研究方法的不足制約了其睡眠研究及其理論的發(fā)展。睡眠剝奪是一種較有效的構建動物失眠模型的方法，目前關于斑馬魚的睡眠睡眠剝奪方式主要有光照、咖啡因、持續(xù)流動水流、感官刺激、電刺激、物理搖晃等方式，持續(xù)流動水流、感官刺激、電刺激均需要專業(yè)的設備，且電刺激和物理搖晃可直接傷害魚本身。光照和咖啡因作為其中最簡單易行且快捷經(jīng)濟的方式，在普通的實驗室均能進行。

光照作為一種物理睡眠剝奪方式，能夠有效的對大鼠、果蠅、斑馬魚等動物進行睡眠剝奪。持續(xù)光照或在正常睡眠時間進行光照刺激，會直接對生物體進行睡眠剝奪，其已經(jīng)成為對生物體睡眠剝奪相關實驗的研究方法。有研究表明，許多神經(jīng)元對光照有明顯的反饋作用，對持續(xù)的光照、適當?shù)墓鈴姸群痛罅咳狈σ暰W(wǎng)膜定位的感受野具有一定的電生理反應。光照可以引起覺醒-睡眠時相發(fā)生位移，從而引起睡眠和覺醒之間的轉換，光照條件發(fā)生改變會引起生物體睡眠節(jié)律的改變，這可能是松果體中褪黑素的合成量在黑暗環(huán)境中比光照時多，而褪黑素對于夜行動物來說具有增加覺醒的作用。異常光照會影響大鼠睡眠-覺醒周期以及晝夜節(jié)律的紊亂，并會導致大鼠抑郁癥和空間記憶能力下降［10］。光照周期的長短會影響小鼠背側中縫核中5 羥色胺神經(jīng)元功能，包括放電頻率、對去甲腎上腺素刺激的反應及電位變化等，這些因素均與睡眠-覺醒有著密切聯(lián)系［11］。果 蠅 的 光 照 環(huán) 境 為12 h 光 照12 h 黑 暗，在黑暗的12 h 中給予持續(xù)光照刺激以進行睡眠剝 奪［12，13］，成 功 建 立 失 眠 模 型。呂 冬 俊［14］對 斑馬魚進行了24 h 持續(xù)光照的睡眠剝奪，結果發(fā)現(xiàn)相比正常組，睡眠剝奪之后的斑馬魚記憶損傷及焦慮樣行為均加重。完全睡眠剝奪24 h 后斑馬魚出現(xiàn)認知損害，這與人類失眠后的臨床癥狀相符。光照可以明顯地抑制斑馬魚的睡眠，當斑馬魚在生物夜晚的最后6 h 暴露于150 lux 光線下，睡眠時間減少90% 以上，將斑馬魚釋放到黑暗中時，睡眠并沒有出現(xiàn)反彈，但斑馬魚在長時間恒定150 lux 光照條件下，1～2 周內睡眠逐漸恢復［15］。說明通過運用單純的光照誘導斑馬魚睡眠剝奪模型來研究失眠是有效且方便的。

咖啡因是腺苷受體拮抗劑，通過結合腺苷A2A受體抑制睡眠，增強覺醒。腺苷是腦內重要的抑制性神經(jīng)遞質，腺苷的積累是睡眠壓力形成的主要原因。海灣戰(zhàn)爭期間，美國海軍給予飛行員使用咖啡因片作為促醒措施。所以在實驗中運用咖啡因對動物進行睡眠剝奪，能夠增強動物的覺醒，有效地減少動物的睡眠時間，運用咖啡因誘導斑馬魚睡眠剝奪模型亦切實可行。

本實驗結果顯示光照與咖啡因均能誘導斑馬魚睡眠剝奪模型、減少頭部色素沉著、導致斑馬魚幼魚卵黃囊水腫。兩者在增加斑馬魚幼魚活動時間上未見明顯差異，光鏡下觀察卵黃囊水腫程度及頭部色素沉著亦未見明顯差異，故兩種造模方式在模型成功與否和對斑馬魚表型的影響并無明顯差異。然而，兩種方式誘導的睡眠剝奪模型在運動形式上存在差異，光照組斑馬魚以小運動為主，咖啡因組斑馬魚以中運動為主，由此造成差異的相關機制需進一步探討。

而針對斑馬魚睡眠剝奪的方法，在科研實驗中可根據(jù)實驗目的而選擇不同的造模方式，如在進行晝夜節(jié)律相關性失眠的研究時選用光照進行睡眠剝奪則優(yōu)于咖啡因，因睡眠作為一種行為模式，表現(xiàn)出規(guī)律的晝夜節(jié)律變化，光暗周期被認為能夠影響晝夜節(jié)律，光照信號則是最主要的授時因子，重復的光刺激是睡眠剝奪 的 一 種 方 式［16，17］，因 此，此 類 實 驗 研 究 更 加傾向于光照造模，且光照對斑馬魚進行睡眠剝奪結束后未見斑馬魚有補償性睡眠，而要探討藥物對睡眠的影響，就可選擇咖啡因進行睡眠剝奪造模。光照與咖啡因兩種方式誘導斑馬魚睡眠剝奪模型均有效、方便、可操作性強，從經(jīng)濟角度考慮，光照方式似乎比咖啡因更加有優(yōu)勢，減少了藥品的使用，節(jié)約了實驗經(jīng)費。

作者貢獻度說明：

冉思邈、譚愛華：負責實驗的實施和論文的撰寫；石和元、王平：對課題進行指導和提供經(jīng)費支持。