腺相關(guān)病毒載體優(yōu)化的研究進(jìn)展

翟貫星（綜述） 傅衛(wèi)輝 徐建青 張曉燕（審校）

（復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心 上海 201508）

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是感染人和一些其他靈長類動物的小型（20 nm）復(fù)制缺陷的非包膜病毒，屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）。AAV 依賴與其他病毒（主要是腺病毒）共同感染進(jìn)行復(fù)制，最初在腺病毒制劑的污染物中被發(fā)現(xiàn)，并因此得名[1-2］。 AAV 有9 種常見血清型（AAV 1～9），還 存 在AAV10、AAV-DJ、AAV-DJ/8 等血清型。AAV 基因組包含兩個(gè)開放閱讀框：Rep 與Cap（圖1）。AAV 病毒缺乏明顯的致病性，目前尚不清楚AAV 是否會引起疾病，但會引起非常溫和的免疫反應(yīng)。

圖1 AAV 基因組Fig 1 Viral genome of AAV

AAV 能夠同時(shí)感染分裂和靜止期的細(xì)胞。AAV 載體基因組可以作為附加體存在于細(xì)胞內(nèi)，在各種實(shí)驗(yàn)環(huán)境中也觀察到了載體整合。某些情況下，整合對于AAV 載體的治療或?qū)嶒?yàn)效果至關(guān)重要[3］，AAV 具有在人類19 號染色體上特定位點(diǎn)（稱為AAVS1）穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中的能力[4-5］。AAV 穩(wěn)定整合的特點(diǎn)使其比逆轉(zhuǎn)錄病毒更具可預(yù)測性。不同血清型的AAV 病毒也具有不同的組織親和性[6］。AAV 作為基因治療載體，通過在載體上移除Rep與Cap消除其整合能力，所需基因與啟動子一起插入反向末端重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR）之間，該序列有助于單鏈載體DNA 被宿主細(xì)胞DNA 聚合酶復(fù)合物轉(zhuǎn)化為雙鏈后在細(xì)胞核中形成串聯(lián)體[7］。在未分裂細(xì)胞中，這些串聯(lián)體在宿主細(xì)胞生命周期中保持完整；在分裂細(xì)胞中，游離DNA 不隨宿主細(xì)胞DNA 復(fù)制，AAV 的DNA通過細(xì)胞分裂而丟失[8］。AAV 的DNA 隨 機(jī)整合到基因組的發(fā)生頻率很低[8］。AAV 具有非常低的免疫原性，僅限于中和抗體的產(chǎn)生，而不會誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)[9-11］。較低的免疫原性和感染靜止細(xì)胞的能力，使AAV 非常適合作為人類基因治療的載體。

AAV 作為載體具有廣泛的應(yīng)用前景，既可以用于腫瘤的治療（如黑色素瘤）[12］，也可作為載體構(gòu)建疫苗（如HIV 疫苗）[13］，還可以作為免疫治療載體用于慢性感染疾病的治療（如乙型肝炎）[14］。AAV 在流感預(yù)防方面也有一定的應(yīng)用，AAV 介導(dǎo)的抗體表達(dá)能夠保護(hù)老年和免疫缺陷小鼠免受流感病毒的損 傷[15］。 目前已有Glybera （AAV1）、Luxturna（AAV2）和Zolgensma（AAV9） 3 種基于野生型AAV 的基因治療產(chǎn)品上市[16］。許多AAV產(chǎn)品已經(jīng)用于臨床Ⅰ期、Ⅱ期與Ⅲ期試驗(yàn)。其中，有Ⅰ期臨床試驗(yàn)采用AAV2 作為載體，用正常基因替換芳香族L-胺基酸類脫羧基酶（aromatic L-amino acid decarboxylase ADCC）缺乏癥患者的缺陷基因，主要靶 向 于腦部[17］。AveXis 公司用AAV9 研究 開 發(fā)的基因治療產(chǎn)品SMN，主要作用于脊髓，能夠治療脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）患者，目前已經(jīng)處于臨床Ⅲ期階段[17］。AAV 用于基因治療，不僅可以替換原有缺陷基因，也可以沉默、編輯缺陷基因，還能夠增加新的基因[18］。

為了實(shí)現(xiàn)更低、更安全的載體劑量，需要提高AAV 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、逃逸中和抗體、提高細(xì)胞/組織特異性。對AAV 本身進(jìn)行改造，如對衣殼蛋白進(jìn)行改造，不僅可以提高AAV 的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和靶向性，還能減輕體液免疫和細(xì)胞免疫，從而降低重組蛋白的免疫原性。根據(jù)不同的組織親和性，選擇不同血清型AAV，并針對某個(gè)器官組織使用特定的啟動子。對AAV 應(yīng)用方面的改造有添加調(diào)控元件對AAV 表達(dá)進(jìn)行調(diào)控及通過AAV 作為載體進(jìn)行基因編輯等。本文將對AAV 載體改造及與應(yīng)用改造的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理。

AVV 載體的優(yōu)化策略

增強(qiáng)AAV 對宿主的感染效率 AAV 感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低[19］，天然存在的AAV 血清型不能很好地適應(yīng)臨床的需求，需進(jìn)一步改造和優(yōu)化。通過對AAV 的衣殼進(jìn)行修飾與突變，能夠篩選出感染效率高的AAV 突變體，有利于AAV 載體傳 遞目的基 因。2019年，Bertin 等[20］對AAV2 的衣殼進(jìn)行分子工程設(shè)計(jì)，通過對衣殼進(jìn)行糖基化修飾，在3 個(gè)細(xì)胞系（HeLa、Huh7 和ARPE-19）中轉(zhuǎn)基因表達(dá)增加了1.3～2.5 倍，糖基化位點(diǎn)修飾的AAV在B 型血友病小鼠模型中，肝基因轉(zhuǎn)移引起人凝血因子（F）Ⅸ水平增加2 倍，而其T/B 細(xì)胞免疫反應(yīng)并未改變。在玻璃體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移顯示綠色熒光蛋白表達(dá)增加約2～4 倍，并增強(qiáng)了整個(gè)視網(wǎng)膜的滲透，表明通過將衣殼蛋白糖基化能夠增強(qiáng)基因的傳遞，在肝和眼方面的基因治療中具有很好的翻譯潛力。Ran 等[21］也通過在rAAV-DJ 和rAAV-LK03 衣殼上對表面暴露的酪氨酸（Y）、絲氨酸（S）、天冬氨酸（D）和色氨酸（W）殘基進(jìn)行定點(diǎn)誘變，產(chǎn)生的突變AAV 載 體rAAV-DJ-S269T、 rAAV-LK03-Y705+731F 與野生型相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著增強(qiáng)，提示定點(diǎn)誘變策略適用于其他非天然AAV，促進(jìn)AAV 在人類基因治療中的應(yīng)用。

為檢測AAV 轉(zhuǎn)染效率，Hanlon 等[22］設(shè)計(jì)了一個(gè)AAV 文庫構(gòu)建體iTransduce，通過將AAV9 衣殼上的一個(gè)肽文庫與一個(gè)Cre 盒相結(jié)合，能夠靈敏地檢測轉(zhuǎn)基因表達(dá)。其中一種衣殼AAV-F 介導(dǎo)的大腦皮層轉(zhuǎn)基因表達(dá)比親代AAV9 高65 倍（星形細(xì)胞）和171 倍（神經(jīng)元），這種高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無性別依賴性，并且在兩種小鼠品系（C57BL/6 和BALB/c）中均能持續(xù)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)，使其成為小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有應(yīng)用前景的衣殼載體。

降低機(jī)體對AAV 載體的免疫反應(yīng) AAV 雖然免疫原性低，但是仍會引起人體的免疫反應(yīng)，40%～80% 的成人有過AAV 感染，因此可能會引起免疫排斥反應(yīng)。人體中存在的針對AAV 的中和抗體構(gòu)成了一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，限制了使用重組AAV 載體進(jìn)行基因治療的臨床試驗(yàn)，對AAV 衣殼進(jìn)行突變或修飾能夠有效避免中和抗體的作用。

AAV 衣殼蛋白的定向進(jìn)化路徑尚未明確。Pei等[23］通過定向進(jìn)化的方法在活體內(nèi)分離出可轉(zhuǎn)導(dǎo)入人肝細(xì)胞并逃避中和抗體的AAV 突變體LP2-10。LP2-10 由AAV 2、6、8 和9 不同血清型的衣殼組成，VP3 亞基衍生自與AAV6 的261～272 殘基進(jìn)行交換的AAV8，LP2-10 既能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)入人類肝細(xì)胞，又表現(xiàn)出比其他血清型更強(qiáng)的逃避靜脈免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）和（大多數(shù)人）血清中和抗體的能力。Tse 等[24］通過結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的方法來進(jìn)化具有可變抗原的AAV 突變體，這種策略產(chǎn)生了高度分散的抗原，這種抗原在天然AAV分離株中不存在，因此無法被已存在的抗體識別。Selot 等[25］通過定點(diǎn)誘變篩選 出AAVrh.10 S671A突變體，不僅進(jìn)入細(xì)胞的能力增強(qiáng)，并且在體內(nèi)能夠迅速遷移到核周區(qū)域，進(jìn)一步提高其在肝中的基因轉(zhuǎn)移效率。更重要的是，突變的AAVrh.10S617A能夠規(guī)避預(yù)先免疫動物的中和抗體作用（27～64倍）。開發(fā)逃避宿主中和抗體的AAV 載體系統(tǒng)將大大拓寬人類基因治療應(yīng)用的范圍。

將AAV 衣殼進(jìn)行化學(xué)修飾能夠有效避免中和抗體的作用。Mével 等[26］將N-乙酰半乳糖胺配體耦聯(lián)到AAV 衣殼的表面，以去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)肝細(xì)胞的靶向遞送?；瘜W(xué)修飾的衣殼顯示出與中和抗體的相互作用減少，揭示通過化學(xué)耦聯(lián)AAV的方法可能降低載體免疫反應(yīng)。

AAV 通過外泌體包裹的形式降低AAV 的免疫反應(yīng)。 Meliani 等[27］使用外泌體相關(guān)的AAV（exosome-associated AAV，Exo-AAV）作為肝臟基因傳遞系統(tǒng)，在降低治療性載體劑量的同時(shí)，防止機(jī)體對衣殼的體液免疫。Exo-AAV 載體可提高肝臟定向基因轉(zhuǎn)移的安全性和有效性。

提高AAV 的靶向性 為了更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)治療基因和靶向特定的組織或細(xì)胞，需要對AAV 載體進(jìn)行改造以提高靶向性。

AAV 定向進(jìn)化能夠篩選出靶向性高的AAV衣殼結(jié)構(gòu)。 Davidsson 等[28］建立了BRAVE（barcoded rational AAV vector evolution）法對AAV進(jìn)行優(yōu)化。 通過BRAVE 方法，每個(gè)病毒顆粒在AAV 衣殼表面都具有已知功能的肽，并在包裝的基因組中具有獨(dú)特的分子條形碼，從單代篩選的RNA表達(dá)條形碼測序可以同時(shí)繪制數(shù)百種蛋白質(zhì)的推定結(jié)合序列，在體內(nèi)進(jìn)行一次篩選就可大規(guī)模選擇工程化AAV 衣殼結(jié)構(gòu)。使用BRAVE 方法和基于隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）統(tǒng)計(jì)的聚類，展示了25 種具有精細(xì)特性的合成衣殼變體，將此類病毒設(shè)計(jì)為在體內(nèi)靶向人多巴胺神經(jīng)元，并沿著大腦中的相連途徑運(yùn)輸，從而實(shí)現(xiàn)前所未有的治療準(zhǔn)確性。

AAV 啟動子和血清型是決定轉(zhuǎn)基因表達(dá)動態(tài)的兩個(gè)關(guān)鍵因素。開發(fā)適合特異性細(xì)胞或組織的啟動子可以實(shí)現(xiàn)對特定組織的靶向性。Nieuwenhuis 等[29］將4 種常用啟動子[短的CMV 早期增強(qiáng)子/雞β肌動蛋白（short CMV early enhancer/chicken β actin，sCAG）、人類巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，hCMV）、小鼠磷酸甘油酸激酶（mouse phosphoglycerate kinase，mPGK）與人類突觸蛋白（human synapsin，hSYN）］分別包裝進(jìn)AAV1 中，然后注射到大鼠和小鼠的感覺運(yùn)動皮層中以轉(zhuǎn)導(dǎo)皮質(zhì)脊髓束。帶有hCMV 和sCAG 啟動子的AAV1 載體在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)基因表達(dá)，mPGK 和hSYN 啟動子具有最強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，mPGK 啟動子驅(qū)動了在皮質(zhì)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，而帶有hSYN啟動子的AAV 轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)了神經(jīng)元特異性表達(dá)，包括周圍神經(jīng)網(wǎng)中的中間神經(jīng)元和V 層的皮質(zhì)脊髓神經(jīng)元。這一研究有助于改善轉(zhuǎn)基因在大腦和脊髓的傳遞，皮質(zhì)脊髓束的優(yōu)化轉(zhuǎn)導(dǎo)有助于研究脊髓損傷。

擴(kuò)展AAV 載體容量 AAV 載體容量小，目前最多只能容納4.7 kb 外源DNA 片段，通過相關(guān)技術(shù)擴(kuò)展AAV 載體容量才能攜帶大型基因。

由內(nèi)含肽（intein）介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接被單細(xì)胞生物體用來重構(gòu)蛋白質(zhì)。Levy 等[30］報(bào)道了雙AAV 系統(tǒng)在遞送分隔的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，然后通過反式剪接內(nèi)含肽對其進(jìn)行重構(gòu)。在小鼠大腦（未分類皮質(zhì)組織高達(dá)59%）、肝臟（38%）、視網(wǎng)膜（38%）、心臟（20%）和骨骼?。?%）等部位的治療相關(guān)效率與劑量下，優(yōu)化的雙AAV 系統(tǒng)可進(jìn)行體內(nèi)堿基編輯。結(jié)果顯示，堿基編輯可以糾正小鼠腦組織中引起C 型尼曼- 皮克?。∟iemann-Pick disease，NP）的突變，修正后能延緩神經(jīng)變性并延長壽命。優(yōu)化的遞送載體有助于將靶向點(diǎn)突變有效引入多個(gè)目的組織中。Tornabene 等[31］通過內(nèi)含肽在小鼠、豬以及人的視網(wǎng)膜中進(jìn)行蛋白質(zhì)反式剪接和全長蛋白重構(gòu)，能夠重建大型治療性蛋白質(zhì)，改善了兩種視網(wǎng)膜遺傳性疾病小鼠的表型。通過內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)反式剪接結(jié)合AAV 對視網(wǎng)膜進(jìn)行遞送，可治療大型基因突變導(dǎo)致的遺傳性失明。

Maddalena 等[32］設(shè)計(jì)的三AAV 系統(tǒng)最多能轉(zhuǎn)移14 kb 的基因，首先應(yīng)用于Alstr?m 綜合征（Alstr?m syndrome type Ⅰ，ALMS1）中，因?yàn)锳LMS1 基因突變會導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性疾病。三AAV 系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，預(yù)期的全長產(chǎn)物與許多異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一致，但是只有全長轉(zhuǎn)錄本可以在體內(nèi)有效翻譯。三AAV 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)約4% 的小鼠感光體，并顯示ALMS基因的正確定位。低感光素轉(zhuǎn)導(dǎo)水平可能證明，在ALMS 小鼠模型的視網(wǎng)膜中出現(xiàn)了適度和短暫的改善。在豬視網(wǎng)膜中觀察到三AAV 載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平達(dá)到單AAV 載體的40%，這預(yù)示需要進(jìn)一步提高三AAV 載體在視網(wǎng)膜中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

優(yōu)化調(diào)控AAV 載體基因表達(dá)的策略

調(diào)控AAV 載體的基因表達(dá) 基因治療技術(shù)的廣泛使用受到缺乏小型遺傳開關(guān)的限制，RNA 介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)可控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)而無需其他蛋白質(zhì)成分。

Zhong 等[33］設(shè)計(jì)了一種Ⅲ型錘頭狀核酶，以開發(fā)在哺乳動物mRNA 上高效的RNA 開關(guān)，并顯示它們可以被位阻的反義寡核苷酸嚴(yán)格調(diào)控。變體核酶能夠在體內(nèi)調(diào)節(jié)AAV 傳遞的轉(zhuǎn)基因，從而在至少43 周內(nèi)對蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行劑量依賴性控制，最多可達(dá)223 倍。這些可逆開關(guān)在慢性腎臟病貧血基因治療中的測試證明，寡核苷酸可調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素在生理水平的表達(dá)。這種小型、模塊化和高效的RNA 開關(guān)可提高安全性和功效，并拓寬基因療法的使用范圍。Remes 等[34］利用AAV 介導(dǎo)的RNA發(fā)夾激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）誘餌寡核苷酸（decoy oligonucleotide，dON）遞送，可能有效改善小鼠主動脈同種異體移植模型中的血管病變。AP-1 dON 處理可顯著降低41.5% 的移植物中的內(nèi)膜-中膜比率（P＜0.05）。在處理過的主動脈移植物中，黏附分子、細(xì)胞因子的表達(dá)以及增生的平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cell，SMC）、基質(zhì)金屬蛋白酶9陽性細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤的數(shù)量均顯著降低，證明了抗AP-1 的RNA dON 方法在動物模型中治療同種異體血管病變的可行性、功效和特異性。 基于AAV 的方法提供了將基于核酸的治療劑延長遞送至血管壁的可能性。 侯愛生等[35］通過構(gòu)建表達(dá)shRNA 的rAAV 載體，建立了一種敲減小鼠海馬EAAT3 表達(dá)的動物模型，為進(jìn)一步研究EAAT3 調(diào)控機(jī)制和相關(guān)分子信號通路打下研究基礎(chǔ)。邢夢瑤 等[36］通 過rAAV9 介 導(dǎo) 的RNA干擾能有效抑制H9c2 細(xì)胞NF-κB p65 基因的表達(dá)，抑制p65 基因表達(dá)對H9c2 細(xì)胞活力無明顯抑制，但能減少Ang Ⅱ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

亮氨酸拉鏈（或亮氨酸剪刀[37］）是蛋白質(zhì)中常見的三維結(jié)構(gòu)基序，在AAV 衣殼上進(jìn)行亮氨酸拉鏈的修飾，通過拉鏈結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，翻譯后將外源肽和蛋白質(zhì)整合到AAV 衣殼上，同時(shí)保留載體功能?；诖耍琓hadani 等[38］展示了一個(gè)模塊化平臺，用亮氨酸拉鏈卷曲螺旋結(jié)合基序裝飾AAV 衣殼，形成特定的非共價(jià)異二聚體。通過鎳柱親和力證明，AAV 衣殼可通過這種方法成功展示6組氨酸標(biāo)記的肽。該蛋白質(zhì)展示平臺可以促進(jìn)在AAV 表面上摻入生物部分，從而擴(kuò)大載體增強(qiáng)和工程改造的可能性。

基因編輯技術(shù)提高AAV 載體的精準(zhǔn)度 AAV與CRISPR-Cas 技術(shù)相結(jié)合能夠?qū)Π邢虿课贿M(jìn)行精準(zhǔn) 的 編 輯[39］。AAV 是CRISPR-Cas 的 主 要候選 載體，可用于在體內(nèi)進(jìn)行治療性基因組編輯。Hanlon等[40］觀察到高水平AAV 整合（高達(dá)47%）到Cas9 誘導(dǎo)的鼠類神經(jīng)元、小鼠大腦、肌肉和耳蝸治療相關(guān)基因中的雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）區(qū)，小鼠腦中全基因組AAV 定位顯示，除CRISPR/Cas9 目標(biāo)位點(diǎn)外，AAV 整合并未增加。然而，基于CRISPR-Cas9 的體內(nèi)肝臟基因組編輯存在功效和安全性問題[41］，Li 等[42］提出的解決方法是，通過自刪除AAV-CRISPR 系統(tǒng)，將插入和缺失突變引入AAV 附加體，該系統(tǒng)顯著降低金黃色葡萄球菌的Cas9 蛋白水平，同時(shí)在肝臟中實(shí)現(xiàn)了高目標(biāo)編輯率，在預(yù)測的潛在脫靶位點(diǎn)均未觀察到自缺失Cas9誘導(dǎo)RNA 脫靶，該系統(tǒng)高效且通用。這種自我刪除的AAV-CRISPR 系統(tǒng)有助于實(shí)現(xiàn)人類肝臟基因組編輯。Zhang 等[43］在單鏈AAV 中包裝了Cas9 核酸酶，在自互補(bǔ)AAV（self-complementary AAV，scAAV）中包裝了CRISPR sgRNA，并將該雙AAV系統(tǒng)送入杜氏肌營養(yǎng)不良癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）小鼠模型中，有效的基因組編輯所需的自互補(bǔ)AAV 劑量比單鏈AAV 低至少20 倍。王娟[44］設(shè)計(jì)的AAV-SaCas9-sgRNA，通過約3.2 kb的SaCas9 與AAV9 載體介導(dǎo)CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，靶向肌肉生長抑制素（myostatin）基因敲除，無論在體外NIH3T3 細(xì)胞模型中，還是在小鼠模型中，都顯著提高肌肉生長抑制素蛋白的表達(dá)量，從而引起肌肉性狀發(fā)生明顯變化。

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，AAV 與CRISPR 能夠較好地實(shí)現(xiàn)體外編輯。Kumar 等[45］利用金黃色葡萄球菌的Cas9（SaCas9）開 發(fā)AAV，可 在 人 類 衍 生 的293FT 細(xì)胞和小鼠衍生的Neuro2A（N2A）細(xì)胞中進(jìn)行體外基因組編輯，以及在小鼠腦神經(jīng)元中進(jìn)行體內(nèi)基因組編輯，還證明了其有能力調(diào)節(jié)Dox 和Cre 重組酶在空間上的基因組編輯。這些系統(tǒng)的組合使AAV 介導(dǎo)的CRISPR-Cas9 基因組編輯能夠在空間和時(shí)間上得到調(diào)節(jié)。鄒定峰等[46］在體內(nèi)睪丸組織中對特異性敲除的人源Wee1 基因進(jìn)行編輯。

Hung 等[47］研究發(fā)現(xiàn)，AAV2 介導(dǎo)的SpCas9 與靶向YFP sgRNA 的體內(nèi)遞送能顯著減少轉(zhuǎn)基因小鼠模型視網(wǎng)膜的黃色熒光YFP 細(xì)胞數(shù)量。與LacZsgRNA 處理的眼睛相比，感染YFP sgRNA 的視網(wǎng)膜細(xì)胞中YFP 陽性細(xì)胞減少了84.0%。與未經(jīng)治療的對側(cè)眼睛相比，AAV2 介導(dǎo)CRISPR-Cas 遞送后，視網(wǎng)膜電圖譜分析未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜功能發(fā)生明顯改變。表明AAV 是進(jìn)行CRISPR 基因編輯的良好載體。

AAV 載體的安全性隱患最近，研究人員對患有A 型血友病的9 只狗進(jìn)行AAV 基因治療，并隨訪長達(dá)10年。結(jié)果顯示，表達(dá)犬凝血因子Ⅷ（canine factor Ⅷ，cFⅧ）的AAV8 或AAV9 載體AAV-cFⅧ能夠?qū)⑷狈Φ哪蜃英Ｕ琳Ｋ降?.9%～11.3%。其中，2 只狗中Ⅷ活性在治療后約4年開始逐漸增加，并沒有狗顯示出腫瘤或者肝功能改變的跡象。從6 只狗的肝臟樣品基因組DNA 中分析了1741 個(gè)獨(dú)特的AAV 整合事件，在5 只狗中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞克隆增生，其中44% 的基因整合涉及細(xì)胞生長。所有恢復(fù)的整合載體均被部分刪除和/或重新排列。這些數(shù)據(jù)表明，2 只狗中cFⅧ蛋白表達(dá)的增加可能是由于攜帶整合載體的細(xì)胞克隆擴(kuò)增所致。早在2020年1月，一項(xiàng)針對狗的血友病研究表明，AAV 可以輕易將其攜帶的基因插入到宿主DNA 中，并且插入位置靠近調(diào)控細(xì)胞生長的基因，可能誘發(fā)癌癥[48］。

這些結(jié)果支持了在A 型血友病中針對肝臟的AAV 基因治療的臨床開發(fā)，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了對接受AAV 載體治療中潛在遺傳毒性進(jìn)行長期監(jiān)測的重要性。

結(jié)語目前AAV 的研究包括蛋白替代療法、基因編輯、基因沉默等，需要根據(jù)不同的組織和器官設(shè)計(jì)出不同的AAV 以滿足不同的需求。 隨著AAV 相關(guān)研究的發(fā)展，AAV 逐漸克服了基因治療方面的挑戰(zhàn)，例如轉(zhuǎn)基因維持、安全性、宿主免疫應(yīng)答和靶標(biāo)疾病，越來越能夠滿足人們的期望[49］。AAV 載體系統(tǒng)具有很高的安全性，已成為越來越成多基因治療方法的首選載體[50］。 因此，需要解決AAV 載體設(shè)計(jì)、生產(chǎn)平臺、產(chǎn)品的定量和質(zhì)量控制，以及AAV 可能存在的安全隱患問題，以推動AAV基因治療進(jìn)一步發(fā)展。

作者貢獻(xiàn)聲明翟貫星 文獻(xiàn)收集，制圖，論文撰寫和修訂。傅衛(wèi)輝 論文審閱和指導(dǎo)。徐建青 論文寫作指導(dǎo)。張曉燕 論文審核和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。