葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨生長性能、免疫功能及腸道健康的影響

劉嬌，陳志敏，鄭愛娟，劉國華，蔡輝益，常文環(huán)

葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨生長性能、免疫功能及腸道健康的影響

劉嬌，陳志敏，鄭愛娟，劉國華，蔡輝益，常文環(huán)

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物飼料重點實驗室北京 100081

【目的】探究飼糧中添加葡萄糖氧化酶（GOD）對大腸桿菌攻毒肉鴨生長性能、免疫功能和腸道健康的影響及其作用機制，為尋求預(yù)防肉鴨大腸桿菌病的抗生素替代品研究提供思路?！痉椒ā窟x用144只1日齡健康北京公鴨，隨機分為3組，每組6個重復(fù)，每重復(fù)8只鴨。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，兩個試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加30 mg·kg-1維吉尼亞霉素（抗生素組）或200 U·kg-1GOD，于試驗第7天分兩次對所有鴨口腔灌服0.2 mL大腸桿菌 O88（3×109CFU / mL），兩次攻毒間隔8 h。試驗期28 d?！窘Y(jié)果】（1） 與對照組相比，飼糧中添加抗生素和GOD顯著提高攻毒肉鴨1—14日齡平均日增重和平均日采食量（＜0.05）。（2）GOD和抗生素顯著降低28日齡攻毒肉鴨血液中白細胞數(shù)（＜0.05），提高血液中淋巴細胞百分比（＜0.05）。此外，GOD顯著降低血液中紅細胞含量（＜0.05）。（3）GOD和抗生素顯著降低14日齡肉鴨血清MDA和28日齡CAT的含量（＜0.05）; GOD顯著提高28日齡肉鴨血清T-AOC（＜0.05），且有降低14日齡CAT的趨勢（=0.087）。（4）抗生素和GOD顯著降低14、28日齡肉鴨血清內(nèi)毒素含量（＜0.05）。（5）GOD和抗生素顯著降低肉鴨14、28日齡空腸IL-1β和IL-6濃度（＜0.05），以及28日齡空腸TNF-α濃度（＜0.05），兩組間無顯著差異（＞0.05）。（6）抗生素和GOD顯著降低大腸桿菌攻毒肉鴨14、28日齡血清DAO活性和-LA含量（＜0.05），兩組間無顯著差異（＞0.05）。（7）GOD增加了回腸特有OTUs的數(shù)量，降低了大腸桿菌含量，提高了乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌的相對豐度?！窘Y(jié)論】飼糧中添加GOD通過平衡大腸桿菌攻毒肉鴨的腸道菌群結(jié)構(gòu)、減少細菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生以及降低氧化應(yīng)激對細胞的損傷來維持腸黏膜的完整性、避免因內(nèi)毒素進入血液后激活炎癥信號通路而引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而改善肉鴨腸道健康、促進肉鴨生長。GOD能夠作為抗生素替代物用于預(yù)防或減輕肉鴨的大腸桿菌病。

葡萄糖氧化酶；肉鴨；大腸桿菌攻毒；生長性能；免疫功能；腸道健康

0 引言

【研究意義】隨著我國肉鴨需求量攀升，集約化養(yǎng)殖密度持續(xù)增大，導(dǎo)致肉鴨養(yǎng)殖的環(huán)保和免疫壓力日益增加。大腸桿菌病是肉鴨養(yǎng)殖中的常見疾病，抗生素是當前解決該疾病的最常用且最有效的飼料添加劑。但飼用抗生素在為畜禽集約化養(yǎng)殖提供保障、推動養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時，其藥物殘留、細菌耐藥性等負面影響也日益顯著。根據(jù)2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號公告，我國已于2020年7月1日在飼料端全面禁用抗生素。因此，尋找綠色、安全、高效、無毒副作用的抗生素替代品對提高動物生產(chǎn)性能、預(yù)防畜禽疾病具有重要的現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】葡萄糖氧化酶（GOD）能夠利用分子氧作為電子受體催化b-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫，主要發(fā)揮促消化、保護腸道健康、免疫、抗菌、抗氧化、抗應(yīng)激等方面的功能[1-3]，是理想的抗生素替代物之一。我國對GOD的研究起始較晚，但如今其使用范圍已涵蓋了包括食品[4]、醫(yī)藥[5]、生物等多個領(lǐng)域，并于1999年被納入12種允許在飼料中添加的酶制劑列表。湯海鷗等[6]研究表明GOD能顯著改善肉雞的生長性能和肉品質(zhì)，且能達到與抗生素相同的水平。趙國先等[7]發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加 GOD能顯著降低其腸道大腸桿菌含量，同時提高盲腸內(nèi)乳酸菌和雙歧桿菌含量。GOD能夠降低仔豬腸道pH，改善仔豬十二指腸形態(tài)，在降低腸道內(nèi)大腸桿菌含量的同時，提高乳酸菌含量，進而促進仔豬的生長[8]?！颈狙芯壳腥朦c】GOD在畜禽養(yǎng)殖中的作用效果已取得了部分研究成果，但對于其在肉鴨上的應(yīng)用效果卻鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗通過在肉鴨飼糧中添加GOD，研究其對大腸桿菌攻毒肉鴨生長性能、免疫功能和腸道健康的影響及其作用機制，并探明其替代抗生素預(yù)防肉鴨大腸桿菌病的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

動物試驗于 2019 年4—6月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所南口中試基地完成。其余試驗于 2019 年7—12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所完成。

1.2 試驗材料

試驗所用葡萄糖氧化酶，酶活為1 000 U·g-1，試驗所用抗生素為維吉尼亞霉素，兩者均由北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司提供。大腸桿菌O88購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 試驗方法

首先確定大腸桿菌攻毒方法。選取66只1日齡健康北京公鴨，隨機分為11組，每組6只。7日齡時，2—11組按照不同攻毒方案對肉鴨口腔灌服大腸桿菌O88菌液（菌液濃度為1×109CFU/mL）進行感染試驗，1組為健康對照組，口腔灌注1 mL滅菌LB肉湯培養(yǎng)基，各組具體攻毒方式見表1，各組均飼喂相同基礎(chǔ)飼糧（表2），觀察其攻毒后7d內(nèi)生長狀況并記錄，以確定最優(yōu)大腸桿菌攻毒方案。

各處理組肉鴨在人工感染大腸桿菌后臨床表現(xiàn)各不相同，與T1組（對照組）相比，T2、T3組無顯著變化，T4到T11組肉鴨表現(xiàn)出精神不振，排灰白或綠色稀便。進一步剖檢觀察到T9、T11組肉鴨出現(xiàn)大腸桿菌病的典型病理變化：心包內(nèi)充滿黃白色纖維性滲出物，肝臟腫大且被覆淡黃色纖維滲出物。由圖1可知，與對照組相比，T8至T11組肉鴨有更低的平均日增重，更高的料重比，這顯著影響了肉鴨的生長性能。此外，圖中可見T1至T7組無死淘個體，T8至T11組死淘率分別為16.7%、33.3%、50.0%和16.7%。

表1 試驗分組及攻毒方式

>A：不同攻毒方式對7-14日齡肉鴨平均日增重的影響；B：不同攻毒方式對7-14日齡肉鴨料重比的影響；C：不同攻毒方式對7-14日齡肉鴨死淘率的影響；T：處理組

A: Effects of different infecting methods on average daily gain of 7 to 14 days of age ducks; B: Effects of different infecting methods on feed/gain of 7 to 14 days of age ducks; C: Effects of different infecting methods on mortality of 7 to 14 days of age ducks; T: Treatment

圖1 不同攻毒方式對7-14日齡肉鴨生長性能的影響

Fig. 1 Effects of different infecting methods on growth performance of 7 to 14 days of age ducks

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1）維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供The vitamin premix provided the following per kg of diets: VA 10 000 IU, VD32 000 IU, VE 10 IU, VK32.5 mg, VB11 mg, VB26 mg, VB310 mg, VB540 mg, VB63 mg, VB110.3 mg, VB120.01 mg, 生物素 biotin 0.12 mg

2）微量元素預(yù)混料為每千克飼糧提供The mineral premix provided the following per kg of diets: Cu (as copper sulfate) 8 mg, Fe (as ferrous sulfate) 80 mg, Mn (as manganese sulfate) 60 mg, Zn (as zinc sulfate) 40 mg, Se (as sodium selenite) 0.15 mg, I (as potassium iodide) 0.35 mg

由生長性能及剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T9、T11組出現(xiàn)了明顯大腸桿菌感染的臨床癥狀及病理變化。最終綜合考慮病理檢查、生長性能及死淘率結(jié)果選定最優(yōu)的攻毒方案為大腸桿菌接種量6×108CFU，攻毒兩次，兩次間隔8 h。

1.4 試驗設(shè)計

選擇144只健康1日齡北京公鴨（50±2.75）g作為試驗動物，隨機分為3組，每組6個重復(fù)，每重復(fù)8只鴨。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，兩個試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中以30 mg·kg-1維吉尼亞霉素（抗生素）或200 U·kg-1GOD等比例替代其中的沸石粉，試驗期28 d。根據(jù)篩選試驗確定的最優(yōu)大腸桿菌攻毒方案，于試驗第7天分兩次對所有鴨口腔灌服0.2 mL大腸桿菌 O88（3×109CFU / mL），兩次攻毒間隔8 h。試驗采用玉米-豆粕-雜粕型基礎(chǔ)飼糧，參照《肉鴨飼養(yǎng)標準》（NY/T 2122-2012）配制，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗采用立體三層籠養(yǎng)，1—3 d每日24 h光照且鴨舍溫度維持在33℃，第3天后每日為23 h光照，以每周降低2℃的速度將鴨舍內(nèi)溫度降至24℃，之后溫度不再繼續(xù)降低，使用乳頭式飲水器，自由采食。試驗鴨飼養(yǎng)管理和鴨舍衛(wèi)生管理均按常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)程進行。每天進行健康觀察，記錄死亡只數(shù)、時間以及原因，按時記錄損料、余料以及各項生長性能指標。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 生長性能 于肉鴨14、28日齡時，斷食空腹12 h，之后分別對每個重復(fù)鴨進行稱重、結(jié)料。計算1—14日齡、14—28日齡和1—28日齡肉鴨平均體重（BW）、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

1.6.2 血液樣品采集與測定 于肉鴨14、28日齡時，分別從每重復(fù)中隨機選取一只肉鴨。經(jīng)翅靜脈采血，經(jīng)3 500 r/min離心10 min，收集血清，分裝于EP管中，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?8日齡時另取5 mL血液于含乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-2K）抗凝劑的EP管，30 min之內(nèi)進行血常規(guī)測定。采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、二胺氧化酶（DAO）以及-乳酸（-LA）的含量；采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）（Bethyl Laboratories, Inc. USA）的方法測定血清中內(nèi)毒素含量；全血稀釋后采用全自動動物血液分析儀（TEK-Ⅱ mini）檢測紅細胞數(shù)（RBC）、白細胞數(shù)（WBC）、淋巴細胞比例（LYM%）、血小板數(shù)（PLT）。

1.6.3 空腸樣品采集與測定 于肉鴨14、28日齡時，分別從每重復(fù)中隨機選取一只肉鴨，迅速屠宰，解剖。在無菌條件下，取空腸腸段（對折后取中段）約3cm，用生理鹽水沖洗腸道內(nèi)食糜后置于無菌凍存管，于-80℃冷凍保存，采用ELISA（Bethyl Laboratories, Inc. USA）的方法檢測炎癥因子（腫瘤壞死因子α（TNF-α），白介素-1β（IL-1β），白介素-6（IL-6））以及TLR4的含量。

1.6.4 回腸樣品采集與測定 于肉鴨14日齡時，分別從每重復(fù)中隨機選取一只肉鴨，迅速屠宰，解剖。在無菌條件下，取回腸中段處的食糜樣品置于無菌凍存管中，于-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

提取14日齡肉鴨回腸食糜的微生物基因組DNA，同時采用Nanodrop對其進行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測。使用無菌水稀釋部分樣品至1 ng·mL-1。以取得的稀釋后基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域，設(shè)計并使用含有Barcode序列的特異性引物，并在全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶的作用下進行目標片段的PCR擴增，確保擴增準確性的同時提高擴增效率。本試驗采用16s rRNA基因V3-V4區(qū)的引物為：F：5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCA-3′和R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′來擴增細菌DNA。將擴增后的PCR產(chǎn)物進行磁珠純化回收，隨后將PCR擴增回收產(chǎn)物進行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應(yīng)比例進行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過在Agilent Bioanalyzer（Agilent High Sensitivity DNA Kit）上的質(zhì)檢和Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit）對文庫進行定量，文庫合格后，使用Illumina MiSeq PE250進行上機測序，測序分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。

采用絕對定量PCR的方法測定食糜中大腸桿菌的含量，具體方法如下：首先使用DNA提取試劑盒從0.2 g肉鴨回腸食糜中提取細菌總DNA（Mag-Bind Soil DNA Kit 200，Omega公司，美國），置于-20℃冷凍存放。PCR引物設(shè)計基于16s rDNA，引物序列見表3。使用DNA純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收后，與PCR?2.1質(zhì)粒載體（TA克隆試劑盒，Invitrogen公司，美國）相連后導(dǎo)入大腸桿菌的感受態(tài)細胞DH-5α（Takara公司，日本）制成標準質(zhì)粒，使用超微量分光光度計（Nano-drop 2000）測定質(zhì)粒濃度。隨后將標準質(zhì)粒進行梯度稀釋，加入96孔板制作標準曲線。最后，使用已提取的回腸食糜DNA為模板，按照AceQ?qPCR SYBR?GreenMaster Mix試劑盒的說明書進行熒光定量PCR。最終食糜中微生物的含量用基因拷貝數(shù)/每克食糜來表示。

按照“中國特色、世界水準”的高等職業(yè)教育的奮斗目標，高職院校在今后的內(nèi)涵式發(fā)展中勢必進一步加強國際交流和合作。輔導(dǎo)員要積極組織中、外學(xué)生文化交流，引導(dǎo)學(xué)生敢于并善于把中國文化最優(yōu)秀的一面展示給國外留學(xué)生，樹立學(xué)生的文化自信。同時，要引導(dǎo)學(xué)生積極思考，按照“各美其美、美人之美、美美與共、天下大同”的原則，發(fā)現(xiàn)他文化之長，并結(jié)合實際情況，經(jīng)過科學(xué)的揚棄后使之為我所用。

表3 大腸桿菌16s rDNA PCR引物序列表

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，對組間差異顯著的指標，使用Duncan 氏法進行多重比較。以＜0.05作為差異顯著性判斷標準，＜0.01為差異極顯著的標準。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨生長性能的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加GOD極顯著提高了1—14日齡肉鴨平均日增重和平均日采食量（＜0.01），且與抗生素組間無顯著差異。添加GOD對攻毒肉鴨其他階段生長性能影響不顯著（＞0.05）。

2.2 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨血常規(guī)的影響

由圖2可知，與對照組相比，飼糧中添加GOD和抗生素均顯著降低了血液中白細胞數(shù)（＜0.05），極顯著提高了血液中淋巴細胞百分比（＜0.01）。此外，GOD極顯著降低了血液中紅細胞含量（＜0.01），抗生素僅有降低紅細胞含量的趨勢。GOD和抗生素對血液中粒細胞數(shù)無顯著影響（＞0.05）。

2.3 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨抗氧化功能的影響

由表5可知，飼糧中添加GOD和抗生素能顯著降低14日齡肉鴨血清MDA（＜0.05）且極顯著降低28日齡CAT的含量（＜0.01）。此外，GOD能夠顯著提高肉鴨28日齡血清T-AOC（＜0.05），且有降低14日齡CAT的趨勢（=0.087）?？股赜刑岣呷怿?8日齡血清T-AOC的趨勢（＞0.05）。GOD和抗生素對其他抗氧化功能無顯著影響（＞0.05）。

表4 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨生長性能的影響

同行無字母或數(shù)值標相同字母表示差異不顯著(＞0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著 (＜0.01)。下表同

In the same row，values with no letter or the same letter means no significant difference (＞0.05), while with different small letter means significant difference (＜0.05), and with different capital letter means extremely significant difference (＜0.01). The same as below

A：28日齡肉鴨紅細胞含量；B：28日齡肉鴨白細胞含量；C：28日齡肉鴨淋巴細胞比例；D：28日齡肉鴨粒細胞絕對值；CON：對照組；ANT：抗生素組；GOD：葡萄糖氧化酶組；RBC：紅細胞；WBC：白細胞；LYM：淋巴細胞；GRA：粒細胞。數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下圖同

表5 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨抗氧化功能的影響

2.4 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨血清內(nèi)毒素的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧中添加GOD極顯著降低了14、28日齡大腸桿菌攻毒肉鴨血清內(nèi)毒素含量（＜0.01），且與抗生素組間無顯著差異。

2.5 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨空腸細胞因子濃度的影響

由圖3可知，與對照組相比，飼糧中添加GOD和抗生素均可顯著降低大腸桿菌攻毒肉鴨14、28日齡空腸IL-1β和IL-6濃度（＜0.05）以及28日齡空腸TNF-α濃度（＜0.05），且兩組間無顯著差異。

A：肉鴨空腸TLR4的濃度；B：肉鴨空腸TNF-α的濃度；C：肉鴨空腸IL-1β的濃度；D：肉鴨空腸IL-6的濃度；CON：對照組；ANT：抗生素組；GOD：葡萄糖氧化酶組；D：日齡

2.6 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨腸黏膜通透性的影響

血清DAO活性和D-LA含量是描述肉鴨腸黏膜通透性的重要標志，由圖4可知，GOD組肉鴨14、28日齡血清DAO活性（＜0.05）和14日齡血清-LA含量（＜0.05）均顯著低于對照組，抗生素組肉鴨28日齡DAO活性（＜0.05）和14、28日齡-LA含量（＜0.05）顯著低于對照組，且抗生素組和GOD組肉鴨在血清DAO和-LA水平上無顯著差異。

A：肉鴨血清二胺氧化酶含量；B：肉鴨血清D-乳酸含量；CON：對照組；ANT：抗生素組；GOD：葡萄糖氧化酶組；DAO：二胺氧化酶；D-LA：D-乳酸；D：日齡

2.7 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨菌群多樣性的影響

通過對肉鴨回腸食糜進行16srRNA基因測序分析發(fā)現(xiàn)，對照組與GOD組alpha多樣性指數(shù)無顯著差異（＞0.05，圖5）；飼糧中添加GOD使得攻毒肉鴨特有的OTUs增加，進而影響了其回腸微生物菌群組成（圖6）；PCoA分析發(fā)現(xiàn)GOD組和對照組間微生物群落結(jié)構(gòu)的組內(nèi)和組間都有較大的變異（圖7），GOD能夠影響大腸桿菌攻毒肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)。

由圖8可知，從門水平來看，肉鴨回腸微生物菌群以厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）為主，三類菌的含量達99%以上，飼糧中添加GOD提高了放線菌門的相對豐度，降低了厚壁菌門的相對豐度。從綱水平來看，攻毒肉鴨回腸微生物菌群以桿菌綱（Bacilli）、梭菌綱（Clostridia）以及放線菌綱（Actinobacteria）為主，GOD增加了肉鴨回腸中桿菌綱的相對豐度，同時降低了梭菌綱的相對豐度。從目水平來看，飼糧中添加GOD提高了乳酸桿菌目（Lactobacillales）和雙歧桿菌目（Bifidobacteriales）的相對豐度，降低了梭菌目的相對豐度。從科、屬和種的水平來分析，飼糧中添加GOD能夠提高鏈球菌科（Streptococcaceae）和雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）的相對豐度，降低梭菌科（Clostridiaceae）和腸球菌科（Enterococcaceae）的相對豐度。

2.8 葡萄糖氧化酶對大腸桿菌攻毒肉鴨回腸大腸桿菌含量的影響

由圖9可知，通過對肉鴨腸道大腸桿菌的絕對定量發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼糧中添加GOD能夠極顯著降低14日齡大腸桿菌攻毒肉鴨回腸中大腸桿菌含量（＜0.01）。

A：Simpson 指數(shù)（OTU水平）；B：Shannon 指數(shù)（OTU水平）；CON：對照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

CON：對照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

3 討論

3.1 對大腸桿菌攻毒肉鴨生長性能的影響

本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加GOD和抗生素與對照組相比極顯著提高1—14日齡肉鴨平均日增重和平均日采食量，兩組間無顯著差異。這與以前的研究結(jié)果是一致的，即添加GOD能顯著改善肉雞[9-10]、豬[8]和肉鴨[11]的生產(chǎn)性能，降低其死亡率。

3.2 對大腸桿菌攻毒肉鴨血細胞含量的影響

血常規(guī)檢查通常用于反映大部分早期全身性疾病、判斷動物健康狀態(tài)[12-13]。其中淋巴細胞的數(shù)量和活性更是反映機體免疫功能水平的重要指標[14]。研究表明，大腸桿菌通過分泌包括細胞致死腫脹毒素、空泡毒素等具有細胞毒性的毒素物質(zhì)引起血液中淋巴細胞的降低與機體內(nèi)紅細胞、白細胞和粒細胞含量的升高[15-16]，進而使得體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇[17]。本研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加GOD能夠顯著增加攻毒肉鴨血液中淋巴細胞含量、同時顯著降低攻毒肉鴨血液紅細胞、白細胞含量，且有降低粒細胞含量的趨勢，抗生素對攻毒肉鴨血常規(guī)的影響與GOD無顯著差別。這表明GOD能夠通過增強機體的非特異性免疫，抑制機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提高機體的免疫功能。

CON：對照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

CON：對照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

CON：對照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

3.3 對大腸桿菌攻毒肉鴨抗氧化功能的影響

氧化還原反應(yīng)是動物機體內(nèi)一種重要的生理生化反應(yīng)，當其處在平衡破壞的不利條件下，自由基過度積累將會對機體組織造成氧化應(yīng)激損傷[18]。T-SOD是機體重要的抗氧化酶，一般能夠通過清除超氧陰離子自由基來防止細胞受到氧化應(yīng)激損傷。MDA是機體脂質(zhì)過氧化程度變化的標志，其含量變化與細胞的完整性呈負相關(guān)，與脂質(zhì)過氧化程度呈正相關(guān)[19]。T-AOC能夠反映機體綜合性抗氧化能力。CAT是參與GOD催化氧化葡萄糖過程中的重要物質(zhì)，能夠與GOD共同催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸，且消耗大量氧氣，防止氧自由基過度積累造成機體內(nèi)的氧化損傷。本試驗發(fā)現(xiàn)，GOD能夠提高大腸桿菌攻毒肉鴨血清T-AOC，降低血清MDA含量以及CAT活性，且與抗生素組無顯著差別，除GOD自身能發(fā)揮抗氧化作用外，本研究結(jié)果可能與GOD催化氧化產(chǎn)生的葡萄糖酸也有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加GOD能提高血清SOD活性，同時使得血清MDA含量顯著降低，這有助于緩解機體氧化應(yīng)激損傷[20]。馬可為等[21]研究表明飼糧中添加不同比例的葡萄糖酸均能顯著提高血清SOD含量，且添加0.2%葡萄糖氧化酶能顯著降低血清MDA含量，與本試驗結(jié)果相同。這表明GOD能提高機體的抗氧化性能，消除氧自由基，減少機體氧化應(yīng)激損傷，維護動物健康。

3.4 對大腸桿菌攻毒肉鴨血清內(nèi)毒素含量的影響

內(nèi)毒素也叫脂多糖，其在細菌細胞壁被破壞后釋放，對宿主產(chǎn)生毒性。有研究表明，大腸桿菌感染會引起肉雞血清內(nèi)毒素增加[22]，進而通過內(nèi)毒素休克反應(yīng)對機體健康產(chǎn)生不良影響。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GOD能顯著降低大腸桿菌攻毒肉鴨血清內(nèi)毒素含量，與抗生素作用效果一致。這表明GOD能夠降低攻毒引起的肉鴨內(nèi)毒素含量增加，防止發(fā)熱、炎癥反應(yīng)甚至休克現(xiàn)象的出現(xiàn)，提高機體免疫功能，維護肉鴨健康。

3.5 對大腸桿菌攻毒肉鴨空腸炎癥因子含量的影響

炎癥反應(yīng)能誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的出現(xiàn)，但炎癥反應(yīng)過度卻會對動物的健康造成不利影響，有報道稱在大量新型冠狀病毒引起的肺炎重癥感染者體內(nèi)就出現(xiàn)了“細胞因子風(fēng)暴”，也就是過度的炎癥反應(yīng)引起機體內(nèi)細胞因子急劇增加，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，最終對宿主產(chǎn)生不可逆的傷害[23-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌作為病原菌進入畜禽體內(nèi)后，首先經(jīng)過與模式識別受體TLR4的識別與結(jié)合，而后激活MyD88/NF-kB信號通路，引起細胞因子TNF-α、IL-1b和IL-6等含量增加，而TNF-α、IL-1b等能夠通過誘導(dǎo)白細胞的黏附蛋白表達使白細胞浸潤增加，引起機體炎癥反應(yīng)，損傷免疫系統(tǒng)正常功能，威脅畜禽健康[25]。另外，白細胞介素是動物機體內(nèi)細胞因子的一部分，具有傳遞信息、激活和調(diào)節(jié)免疫細胞，參與T、B細胞活化、增殖分化，誘導(dǎo)或抑制機體炎癥反應(yīng)等功能[26]。WANG 等[27]研究表明飼喂葡萄糖氧化酶有助于降低黃羽肉雞腸道中促炎細胞因子和趨化因子的濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，飼糧中添加抗生素或GOD均能降低肉鴨空腸細胞因子（TNF-α、IL-1b、IL-6）的含量，且在抗生素組與GOD組間均無顯著差異。這表明抗生素和GOD能通過抑制病原菌侵染后促炎信號通路的激活，降低促炎細胞因子的含量，進而緩解畜禽機體炎癥反應(yīng)，減少機體損傷。

3.6 對大腸桿菌攻毒肉鴨腸黏膜通透性的影響

腸黏膜通透性是描述腸道損傷程度的重要指標。-乳酸是腸道細菌的次級代謝產(chǎn)物或腸道細菌自身經(jīng)發(fā)酵和裂解后的產(chǎn)物之一，它會在動物腸黏膜通透性增加時進入血液循環(huán)，使得其在血清中的含量增加，因此血清中-乳酸含量是反映腸黏膜通透性變化的重要標志[28]。血液中DAO含量一般用于反映動物腸絨毛的完整性和成熟度，血液中DAO的酶活性變化也常被看作反映腸黏膜通透性的另一個標志，這是因為小腸絨毛尖端的絨毛細胞內(nèi)含有大量高活性的DAO，但DAO在血液中卻含量極低，因此只有當絨毛細胞和腸黏膜受損后DAO才會大量進入腸細胞間隙、血液和淋巴管中，且進入血液后DAO 的酶活性會維持相對穩(wěn)定，血液中的DAO含量也會相應(yīng)升高[29-30]。本試驗結(jié)果顯示肉鴨飼糧中添加GOD可以顯著降低血清中-乳酸含量和DAO活性，且與抗生素組間無顯著差別。這表明GOD可以通過降低腸黏膜通透性，緩解大腸桿菌攻毒引起的腸道損傷，維持腸黏膜完整性。

3.7 對大腸桿菌攻毒肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸道大腸桿菌含量的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)GOD能夠影響攻毒肉鴨回腸菌群結(jié)構(gòu)，增加其回腸特有OTUs的數(shù)量，并且提高了乳酸桿菌目（）和雙歧桿菌目（）等益生菌的相對豐度。通過對GOD作用機制分析可知，GOD氧化分解葡萄糖過程中大量耗氧，創(chuàng)造腸道低氧環(huán)境，這有利于厭氧有益菌的生長和繁殖，達到了平衡腸道菌群的效果。另外，GOD在氧化葡萄糖過程中產(chǎn)生了葡萄糖酸和H2O2，兩者也被證實有平衡菌群的作用[2, 31]。另外，乳酸桿菌（）和雙歧桿菌（）作為和中占有優(yōu)勢地位的重要菌屬，可以顯著提高動物的腸道免疫功能和腸道屏障功能、影響炎癥因子的表達、抑制有害菌增殖，從而改善機體的抗病力[32]。本試驗中絕對定量結(jié)果也顯示飼糧中添加GOD降低了攻毒肉鴨回腸大腸桿菌的含量。這與前人的研究結(jié)論一致。大腸桿菌含量的降低對于降低大腸桿菌病及并發(fā)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生、提高肉鴨生長性能具有重要意義。這表明飼糧中添加GOD能夠通過提高攻毒肉鴨腸道菌群多樣性以及乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的相對豐度、降低大腸桿菌含量來平衡肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善動物腸道健康。

4 結(jié)論

飼糧中添加GOD通過平衡大腸桿菌攻毒肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)、減少細菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生、降低氧化應(yīng)激對細胞的損傷來維持腸黏膜的完整性、避免因內(nèi)毒素進入血液后激活炎癥信號通路而引起的炎癥反應(yīng)，從而改善肉鴨腸道健康、促進肉鴨生長。GOD能夠替代抗生素用于預(yù)防或減輕肉鴨因大腸桿菌攻毒引發(fā)的疾病。

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Effects of Glucose Oxidase on Growth Performance, Immune Functions and Intestinal Health of Ducks Challenged by

LIU Jiao, CHEN ZhiMin, ZHENG AiJuan, LIU GuoHua, CAI HuiYi, CHANG WenHuan

Feed Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081

【Objective】 This experiment was conducted to study the effects of glucose oxidase (GOD) on growth performance, immune functions and intestinal health of ducks challenged byO88and its mechanism to find a substitute for antibiotics to prevent duck colibacillosis.【Method】 A total of 144 one-day-old healthymale lean Peking ducklings were selected and randomly divided into three groups with six replicates and eight ducks per replicate. Ducks were fed the three diets supplemented with nothing (Control group), 30 mg·kg-1virginiamycin (Antibiotic group) and 200 U·kg-1GOD in basal diet, respectively.On day 7, all ducks were orally taken 0.2 mLO88(3×109CFU/mL) twice, 8 hours apart. The experiment lasted for 28 days. 【Result】The results showed as follows: 1) Compared with the control group, adding antibiotic or GOD in the diet significantly increased the average daily gain and average daily feed intake of 1 to 14-day-old attacking ducks (＜0.01).2) The number of serum white blood cell of 28-day-old attacking ducks was significantly reduced and the percentage of serum lymphocyte was significantly increased by adding antibiotic and GOD in diet (＜0.01), and the number of serum red blood cell of 28-day- old attacking ducks was significantly reduced by adding GOD in diet (＜0.05). 3) Serum MDA at day 14 (＜0.05) and CAT contents at day 28 (＜0.01) were significantly reduced by adding antibiotic and GOD, serum T-AOC at day 28 was significantlyincreased (＜0.05), and CAT at day 14showed a tendency to decrease by adding GOD (=0.087). 4) Supplementation of antibiotic and GOD significantly decreased endotoxin of 14 and 28-day-old attacking ducks (＜0.01). 5) Adding antibiotic or GOD significantly decreased the concentration of IL-1β and IL-6 of ducks at day 14 and 28 and TNF-α at d 28 (＜0.05), no significant differences between the GOD and the antibiotic groups（＞0.05）. 6) The concentration of serum diamine oxidase and-lactic of 14 and 28-day-old attacking ducks were significantly reduced by adding antibiotic and GOD (＜0.05), no significant differences between the GOD and the antibiotic groups (＞0.05). 7) The addition of GOD increased the number of unique OTUs in ileum, reduced the contents of, and increased the relative abundance of probiotics such asand. 【Conclusion】 In conclusion, addition of GOD in the diet can balance the structure of intestinal flora, reduce the production of bacterial endotoxin and decrease oxidative stress, and then maintain the integrity of intestinal mucosa and prevent activation of inflammatory signal pathway by endotoxin and occurrence of inflammatory reaction, so as to improve intestinal health and growth of ducks infected with. The GOD can be used as antibiotics substitute to prevent or alleviate colibacillosis of ducks.

glucose oxidase; duck;challenge;growth performance; immune function; intestinal health

2020-06-09；

2021-09-27

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程協(xié)同創(chuàng)新任務(wù)（CAAS-XTCX2016011）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0601001）

劉嬌，Tel：13126721676；E-mail：853652746@qq.com。通信作者常文環(huán)，E-mail：changwenhuan@caas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）