小麥TaNAC基因基于可變剪切和microRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分析

呂士凱，馬小龍，張敏，鄧平川，陳春環(huán)，張宏，劉新倫，吉萬全

西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100

小麥TaNAC基因基于可變剪切和microRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分析

呂士凱，馬小龍，張敏，鄧平川，陳春環(huán)，張宏，劉新倫，吉萬全

西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100

【目的】以條銹菌和白粉菌脅迫的普通小麥（Triticum aestivum L.）為研究對(duì)象，分析由可變剪切（alternative splicing，AS）形成的TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)分析TaNAC 基因的microRNA 調(diào)控位點(diǎn)，為進(jìn)一步解析TaNAC 基因通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與小麥響應(yīng)真菌脅迫奠定基礎(chǔ)。【方法】普通小麥兼抗種質(zhì)N9134 在被白粉菌和條銹菌分別侵染后，各8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣并混合，然后從混合樣本中克隆得到大量TaNAC 轉(zhuǎn)錄本。參考中國(guó)春小麥基因組注釋信息（IWGSC RefSeq v1.1）進(jìn)行比對(duì)，選擇由可變剪切形成的TaNAC 序列結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本 ，分析它們的序列結(jié)構(gòu)特征。利用生物信息學(xué)軟件和在線工具，對(duì)這些TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本編碼產(chǎn)物的功能結(jié)構(gòu)域、高級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位等特征和變異情況進(jìn)行比對(duì)分析。同時(shí)，利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證其中1 對(duì)TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果，并選取5 組TaNAC基因的可變剪切序列結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)錄自激活試驗(yàn)，研究序列結(jié)構(gòu)變異對(duì)TaNAC 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的影響。此外，利用miRBase 數(shù)據(jù)庫收錄的小麥中已報(bào)道的miRNAs 和TaNAC 基因，進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)分析，建立小麥TaNAC 家族成員與miRNAs的靶向關(guān)系?！窘Y(jié)果】以條銹菌和白粉菌侵染的普通小麥兼抗種質(zhì)N9134 為材料，克隆得到的TaNAC 轉(zhuǎn)錄本中的35 條序列結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本由13 個(gè)TaNAC 基因可變剪切形成。通過分析發(fā)現(xiàn)，同一TaNAC 基因由可變剪切形成的不同結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的核酸序列結(jié)構(gòu)存在差異，而且其對(duì)應(yīng)編碼產(chǎn)物的功能結(jié)構(gòu)域、高級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位等方面均會(huì)存在差異，同時(shí)也會(huì)表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性；不同TaNAC 基因的可變剪切方式存在差異，而且它們的結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本及其編碼產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性等方面也均呈現(xiàn)出多樣性的特征。通過分析TaNAC 基因與其在編碼序列區(qū)域的靶標(biāo)tae-miRNAs，發(fā)現(xiàn)具有可變剪切轉(zhuǎn)錄本的TaNAC 基因與tae-miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)均在其非可變剪切區(qū)域?！窘Y(jié)論】TaNAC 基因可以通過可變剪切這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式參與小麥對(duì)真菌脅迫的響應(yīng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，調(diào)控TaNAC 基因的tae-miRNA 可以獨(dú)立于可變剪切這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式行使功能。

小麥；TaNAC 轉(zhuǎn)錄因子；microRNA；可變剪切；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；脅迫響應(yīng)

0 引言

【研究意義】NAC（no apical meristem，NAM；Arabidopsistranscription activation factor，ATAF；cup-shaped cotyledon，CUC）轉(zhuǎn)錄因子基因家族幾乎在植物的所有組織器官，以及包括形態(tài)發(fā)生、生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、對(duì)生物和非生物逆境脅迫響應(yīng)等在內(nèi)的生命過程各個(gè)階段均發(fā)揮重要作用[1-5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在白粉菌（Powdery mildew，P，Blumeria graminisf.sp.tritici）和條銹菌（Stripe rust，S，Puccinia striiformis Westend.f.sp.Tritici Eriks.）脅迫下，普通小麥（Triticum aestivumL.）NAC 轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因會(huì)由可變剪切（alternative splicing，AS）等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控形成大量的結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本[6]。此外，小麥NAC 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)會(huì)受到microRNA（miRNA）的調(diào)控[7]。了解小麥中TaNAC 可變剪切事件，分析TaNAC 的miRNA 調(diào)控因子，對(duì)解析小麥通過可變剪切和miRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式響應(yīng)真菌脅迫的機(jī)制具有重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】NAC 轉(zhuǎn)錄因子是植物特有且家族成員數(shù)量最多的一類轉(zhuǎn)錄因子基因家族[8]。NAC 轉(zhuǎn)錄因子得名于其保守的一致性序列，一般包括來自矮牽牛（Petunia hybrida）的 NAM 以及來自擬南芥（Arabidopsis thaliana）的轉(zhuǎn)錄激活因子ATAF1,2 和CUC2[9-10]。NAC轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列一般包括一個(gè)高度保守且具有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N 末端，以及行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能且結(jié)構(gòu)多變的C 末端[11-12]。據(jù)報(bào)道，模式植物擬南芥和水稻（Oryza sativaL.）的轉(zhuǎn)錄因子家族分別有138和170 個(gè)成員[13-14]，而普通小麥為異源六倍體，具有龐大的基因組，其NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，中國(guó)春小麥參考基因組（IWGSC RefSeq v1.1）有460個(gè)NAC 基因位點(diǎn)，注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量更是多達(dá)559條[6,15]。目前，關(guān)于NAC 轉(zhuǎn)錄因子的功能研究已有很多報(bào)道，僅在普通小麥中就有涉及葉片衰老等生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的NAM-A1、TaNAC-S等[16-17]，參與低溫、干旱等非生物逆境脅迫響應(yīng)的TaNAC69、TaNAC47等[18-19]，參與條銹病、赤霉病抗性等生物逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的TaNAC30、TaNACL-D1等[20-21]，也有基于全基因組層面的對(duì)小麥NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的特性進(jìn)行系統(tǒng)分析的報(bào)道[6,15]。NAC 轉(zhuǎn)錄因子在行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能時(shí)，其自身一般也會(huì)受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后調(diào)控等多種不同層次的調(diào)控[22]。其中，NAC 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控一般與脅迫響應(yīng)有關(guān)[22]，其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控包括miRNA 和可變剪切等調(diào)控方式。miRNA 是一類廣泛存在于真核生物、長(zhǎng)度為20—24個(gè)核苷酸的內(nèi)源非編碼單鏈RNA，在多種生物過程中發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[8]。通過與基因的ORF 區(qū)結(jié)合，裂解靶標(biāo)mRNA 和抑制其翻譯，是miRNAs分子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的一種重要方式[23]。據(jù)報(bào)道，一些NAC 轉(zhuǎn)錄因子會(huì)受到miR164 家族成員的調(diào)控，如tae-miR164 和TaNAC21/22 互作，調(diào)控小麥對(duì)條銹病菌的抗性[7]?？勺兗艚幼鳛橐环N重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式，可以改變mRNA 的序列結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在植物抗病等壓力脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[24]。【本研究切入點(diǎn)】普通小麥中含有數(shù)量眾多的NAC 轉(zhuǎn)錄因子，但TaNAC 相關(guān)研究與其數(shù)量相比卻相對(duì)不足[7,20,25]。植物NAC 基因含有大量可變剪切事件，但是關(guān)于它們的這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式研究有限[6,26]，在小麥中關(guān)于TaNAC 基因可變剪切的研究更是少之又少[6]。可變剪切帶來的序列結(jié)構(gòu)變異可能會(huì)影響miRNA 與靶標(biāo)基因在編碼區(qū)結(jié)合[27]，但是小麥TaNAC 基因相關(guān)的可變剪切和miRNA 這兩種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的綜合研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過分析病菌脅迫后克隆得到的TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的特征，探究TaNAC 基因基于可變剪切在小麥脅迫響應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控規(guī)律；分析已經(jīng)鑒定的所有TaNAC 轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控miRNA，完善調(diào)控小麥TaNAC 基因的miRNA 家族成員；通過分析TaNAC基因的可變剪切結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)特征及其與miRNAs 在編碼序列區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)，探究在TaNAC基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中可變剪切與miRNA 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

冬小麥優(yōu)異種質(zhì)N9134 由西北農(nóng)林科技大學(xué)通過染色體工程育種技術(shù)從阿勃5B 缺體和野生二粒小麥AS846 的雜交后代選育而來。N9134 對(duì)中國(guó)目前鑒定的所有白粉菌和多種條銹菌表現(xiàn)高抗到免疫，其在1B和5BL 染色體均含有1 個(gè)抗性基因位點(diǎn)[28]。條銹菌生理小種CYR31 和CYR32 由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供，白粉菌生理小種E09 由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥遠(yuǎn)緣雜交與分子染色體工程育種實(shí)驗(yàn)室（本室）保存。高感白粉病的普通小麥品種陜優(yōu)225 和高感條銹病的普通小麥地方品種輝縣紅的種子由本室保存，分別作為2 種病菌接種質(zhì)量的對(duì)照材料。

1.2 材料處理

選取N9134、陜優(yōu)225 和輝縣紅3 個(gè)小麥材料的等量種子，置于培養(yǎng)皿中，加入沒過種子的無菌蒸餾水，于23℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約48 h，挑選芽和根發(fā)育良好且一致的幼苗移入裝有育苗基質(zhì)的瓦盆，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在18℃光照16 h/12℃黑暗8 h條件下培養(yǎng)5—7 d，待幼苗長(zhǎng)至5—10 cm，利用抖粉的方式接種。白粉菌生理小種 E09 和條銹菌CYR31、CYR32 混合小種分別在陜優(yōu)225 和輝縣紅上提前誘發(fā)培養(yǎng)。3 種小麥材料的培養(yǎng)條件、接種方式、接種量等均保持一致，通過陜優(yōu)225 和輝縣紅的發(fā)病情況判斷N9134 的接種質(zhì)量。每個(gè)材料均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在接種后0、12、24、36、48、72、96 和120 h 對(duì)分別接種白粉菌和條銹菌的N9134 進(jìn)行取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本由3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)的各1 株的葉片混樣組成，取樣后，立即液氮冷凍，然后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆

2 種病菌分別侵染后的8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本全部取樣完畢后，利用Trizol（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）分別提取總計(jì)16 個(gè)樣本的總RNA，后續(xù)利用DNaseⅠ消化樣本中的DNA 并對(duì)提取的RNA 進(jìn)行純化。純化后的RNA 用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并用超微量分光光度計(jì)（Nanodrop ND-1000; Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA）測(cè)定濃度。將16個(gè)樣本（白粉菌和條銹菌2 種脅迫各8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本）的等量RNA 混合后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄試劑選用PrimescriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，大連，中國(guó)）。

整合本室報(bào)道的白粉菌和條銹菌脅迫下N9134 苗期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)[6,29]和中國(guó)春小麥參考基因組（IWGSC RefSeq v1.1）數(shù)據(jù)，并參考在NCBI 中比對(duì)得到的山羊草等近緣物種的同源基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），以上述cDNA 為模板批量克隆TaNAC 基因。使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa，大連，中國(guó)）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)電泳、目的片段回收、3′平末端加“A”尾、TA 克隆并藍(lán)白斑篩選、菌落PCR 驗(yàn)證后，陽性克隆送至公司測(cè)序，最后分析測(cè)序結(jié)果。涉及的引物合成和測(cè)序均在北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行。

表1 TaNAC 可變剪切結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的克隆引物序列Table 1 The primer sequences of TaNAC structural variation transcripts with alternative splicing in the gene cloning experiment

1.4 洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)分析亞細(xì)胞定位

選取1 對(duì)具有可變剪切結(jié)構(gòu)變異的TaNAC 轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建融合表達(dá)GFP 載體，利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)分析其亞細(xì)胞定位。

構(gòu)建重組pYJ-GFP 載體時(shí)，由限制性內(nèi)切酶SpeⅠ酶切完成載體線性化；TaNAC 編碼區(qū)序列由特異引物從連接有相應(yīng)目的片段的T 載體經(jīng)過PCR 擴(kuò)增、電泳、回收后獲得。然后利用ClonExpress II One Step Cloning Kit（諾唯贊，南京，中國(guó)）同源重組定向克隆，完成各pYJ-GFP 重組載體的構(gòu)建。PCR 擴(kuò)增使用高保真酶，特異引物由pYJ-GFP 載體酶切位點(diǎn)同源臂的通用接頭序列（F：5′-TAGCCATGGTAGATCTG-3′；R：5′-GCCTTACGTAACTAGT-3′）和各目標(biāo)編碼框的起始和終止內(nèi)側(cè)約20 bp 的特異序列組合成，其中，反向特異引物去除終止密碼子。重組pYJ-GFP 載體經(jīng)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證后使用。

將重組pYJ-GFP 載體和空白對(duì)照載體（pYJ-GFP）轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌（GV3101），然后利用液體LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600約1.0，侵染經(jīng)過預(yù)處理的洋蔥表皮，然后把侵染后的洋蔥表皮置于MS 固體培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)16—24 h，利用激光共聚焦顯微鏡（Olympus，IX83-FV12003040101）觀察并拍照。

1.5 轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性分析

選取共計(jì)5 組TaNAC 可變剪切結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本（具有外顯子跳躍或內(nèi)含子保留的可變剪切方式）為代表，分組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性試驗(yàn)。共構(gòu)建17 個(gè)重組pGBKT7 載體，構(gòu)建重組pGBKT7 載體時(shí)，由限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切完成載體線性化；pGBKT7 同源臂的通用接頭序列為F：5′-CAT GGAGGCCGAATTC-3′和R：5′-CTGCAGGTCGAC GGAT-3′，反向特異引物不需要去除終止密碼子；其余過程和使用的試劑等同構(gòu)建重組pYJ-GFP 載體過程類似。

以構(gòu)建好的各TaNAC 轉(zhuǎn)錄本編碼序列的重組pGBKT7 載體為試驗(yàn)組、以載體 pGBKT7-53+pGADT7-T 為陽性對(duì)照組、以pGBKT7 空載體為陰性對(duì)照組，同步分別轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2H Gold 中，涂布于SD/-Trp 固體培養(yǎng)基平板，在30℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)3—5 d，挑選陽性單克隆，于SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，在200 r/min，30℃震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6 左右時(shí)，以100、10-1、10-2和10-3的相對(duì)濃度稀釋菌液，各取2 μL 分別點(diǎn)涂于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/AbA、SD/-Trp/-His/-Ade 固體培養(yǎng)基，于30℃黑暗培養(yǎng)3—5 d，觀察各培養(yǎng)基上菌株的生長(zhǎng)情況，分組分析結(jié)果，每組包括同一TaNAC 基因不同轉(zhuǎn)錄本的試驗(yàn)組、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，以此判斷各重組載體攜帶轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用多序列比對(duì)軟件Cluster X 和BioEdit 比對(duì)分析核酸序列結(jié)構(gòu)；利用SMART 工具（http://smart.emblheidelberg.de/）和NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Conserved Domain Search Service（CD Search）程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析這些編碼產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)，同時(shí)在NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用BLASTP 程序確認(rèn)了不含NAC 保守結(jié)構(gòu)域的序列屬性；利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）的ProtParam 工具分析克隆得到的TaNAC轉(zhuǎn)錄本編碼肽鏈的理化性質(zhì)；利用TMHMM server v.2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測(cè)這些肽鏈的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用CELLO server v.2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）預(yù)測(cè)它們的亞細(xì)胞定位信息；利用SOPMA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）分別對(duì)這些肽鏈的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；上述操作沒有特殊說明均以默認(rèn)設(shè)置運(yùn)行。

結(jié)合從中國(guó)春小麥參考基因組（IWGSC RefSeq v1.1）鑒定得到的高可信度的460 個(gè)基因位點(diǎn)的559條TaNAC 轉(zhuǎn)錄本[6]，利用psRNATarget（https://www.zhaolab.org/psRNATarget/analysis?function=2）設(shè)置期望值（expectation）≤3.5 反向搜索小麥miRNA數(shù)據(jù)庫，預(yù)測(cè)調(diào)控TaNAC 基因的miRNA 及其結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的克隆

RNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，提取過程中DNaseⅠ處理效果理想，所有總RNA 樣本均沒有g(shù)DNA 殘留，保證了克隆得到的TaNAC 轉(zhuǎn)錄本不存在基因組序列的污染。利用這些總RNA 的混合樣本進(jìn)行基因克隆，圖2 展示了部分基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。利用小麥參考基因組（IWGSC RefSeq v1.1）比對(duì)得到的TaNAC 轉(zhuǎn)錄本序列，并對(duì)相似度高的序列進(jìn)行深入分析，根據(jù)序列差異與相似度進(jìn)行分類，確定各自所屬的部分同源染色體及對(duì)應(yīng)的物理位置，據(jù)此排除部分同源染色體上同源基因可能帶來的序列結(jié)構(gòu)差異的干擾。從克隆得到的TaNAC 轉(zhuǎn)錄本中[6]，篩選出13 個(gè)TaNAC 基因（表2）的35 條序列結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分析（轉(zhuǎn)錄本TaNAC017_5D.4提取自中國(guó)春參考基因組IWGSC RefSeq v1.1；其余轉(zhuǎn)錄本均已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得了相應(yīng)的登錄號(hào)）。在進(jìn)行基因克隆和序列分析時(shí)已經(jīng)排除了其他可能的序列結(jié)構(gòu)變異影響因素，因此，這些轉(zhuǎn)錄本中存在的序列結(jié)構(gòu)變異應(yīng)該都是由可變剪切形成的，具體包括外顯子跳躍和內(nèi)含子保留2 種方式。

分析這些TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的序列特征，發(fā)現(xiàn)有些由外顯子跳躍形成的新轉(zhuǎn)錄本仍可按照可變剪切前原轉(zhuǎn)錄本的編碼順序正常編碼，如TaNAC_NTL5_7B.3；有些新轉(zhuǎn)錄本的編碼框會(huì)發(fā)生移碼導(dǎo)致相對(duì)原轉(zhuǎn)錄本分段編碼，如TaNAC017_5A.4；有些新轉(zhuǎn)錄本的編碼框會(huì)發(fā)生移碼導(dǎo)致開放閱讀框（Open reading frame，ORF）相對(duì)原轉(zhuǎn)錄本提前終止，如TaNAC013_3A.3。同樣，內(nèi)含子保留形成的新轉(zhuǎn)錄本也會(huì)出現(xiàn)上述3 種情況。同時(shí)存在外顯子跳躍和內(nèi)含子保留的轉(zhuǎn)錄本，變異情況相對(duì)復(fù)雜，但概括起來仍和上述情況一樣，包括新轉(zhuǎn)錄本可以正常編碼和不能正常編碼。

表2 克隆得到的13 個(gè)基因可變剪切形成的35 條TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本Table 2 The 35 TaNAC structural variation transcripts cloned from 13 genes by alternative splicing

N：正常；S：分段；P：提前終止
N: Normal; S: Segmented; P: Premature termination

2.2 TaNAC 可變剪切轉(zhuǎn)錄本的序列結(jié)構(gòu)分析

選取獲得的4 個(gè)TaNAC 基因（外顯子跳躍和內(nèi)含子保留這兩種可變剪切方式各2 個(gè)）進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析（圖 3）。外顯子跳躍形成的新轉(zhuǎn)錄本TaNAC_NTL5_7B.3相對(duì)TaNAC_NTL5_7B.2，在其起始密碼子88 bp 位置后，缺失1 053 bp 序列，涉及第1個(gè)外顯子后端389 bp 序列，第2 個(gè)外顯子全部210 bp序列和第3 個(gè)外顯子前端454 bp 的序列，但是TaNAC_NTL5_7B.3的讀碼沒有變化，只是相較TaNAC_NTL5_7B.2，其編碼產(chǎn)物幾乎缺失了NAM 保守結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)（圖3-a）。TaNAC013_3A.3因?yàn)橥怙@子跳躍缺失了第3 個(gè)外顯子中段偏前的43 bp 序列（位于原轉(zhuǎn)錄本ORF 起始密碼子之后的770—812 bp的序列），其讀碼方式在其缺失處之后出現(xiàn)移碼，導(dǎo)致在ORF 的第801 位即提前出現(xiàn)了終止密碼子TGA；相應(yīng)未出現(xiàn)外顯子跳躍的2 條轉(zhuǎn)錄本TaNAC013_3A.1和TaNAC013_3A.2，在起始密碼子后的第778 位有1 個(gè)堿基的差異，導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物在第260 位由絲氨酸（S）突變?yōu)楦拾彼幔℅）（S260G），而此堿基變異位點(diǎn)恰好位于TaNAC013_3A.3被跳躍的43 bp 序列區(qū)間（圖3-b）。轉(zhuǎn)錄本TaNAC011_7D.1相對(duì)TaNAC011_7D.2在其第2 個(gè)外顯子后插入了一段602 bp 的內(nèi)含子（具有GT-AG 結(jié)構(gòu)特征），保留了內(nèi)含子的TaNAC011_7D.1可以正常編碼，而無這一內(nèi)含子的TaNAC011_7D.2則出現(xiàn)了分段編碼的情況，其在ATG 之后的第387 位即出現(xiàn)了終止密碼TAG，同時(shí)，在其第2 個(gè)外顯子的第159 位又出現(xiàn)了一個(gè)可以按照TaNAC011_7D.1讀碼方式的起始密碼子（圖3-c）。轉(zhuǎn)錄本TaNAC024_3D.1和TaNAC024_3D.2均可順利讀碼，它們僅在第3 個(gè)外顯子末端存在3 bp 的有無差異；而TaNAC024_3D.3相對(duì)TaNAC024_3D.2在第2個(gè)外顯子后保留了一段140 bp 的內(nèi)含子（具有GT-AG結(jié)構(gòu)特征），兩者的其余序列完全一樣；轉(zhuǎn)錄本TaNAC024_3D.3在ATG 之后第198 位即出現(xiàn)了終止密碼子TAG，但其在插入的內(nèi)含子序列區(qū)域另有一個(gè)起始密碼子，形成總長(zhǎng)1 233 bp 的編碼序列，包括插入內(nèi)含子序列后端的 30 bp 以及與TaNAC024_3D.2的ORF 后端完全一樣的1 203 bp序列（圖3-d）。

2.3 TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)分析

選取的35 條TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本中有24 條能夠正常編碼（TaNAC017_5D.4直接從中國(guó)春參考基因組IWGSC RefSeq v1.1 提?。?，本研究對(duì)它們編碼產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)特征和氨基酸的總平均疏水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）、理論等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析或預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)構(gòu)特征方面，不同剪切方式形成的結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本，其編碼產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域均可能存在有無的差異（表3），如：TaNAC_NTL5_7B.2編碼具有NAM 保守結(jié)構(gòu)域的肽鏈，而因外顯子跳躍形成的新轉(zhuǎn)錄本TaNAC_NTL5_7B.3的編碼產(chǎn)物缺失了NAM 保守域；轉(zhuǎn)錄本TaNAC008_3A.1編碼的多肽在C 末端具有跨膜結(jié)構(gòu)域，而外顯子跳躍形成的新轉(zhuǎn)錄本TaNAC008_3A.2編碼的多肽卻丟失了這一結(jié)構(gòu)。

在理化性質(zhì)方面（表3），這些TaNAC 轉(zhuǎn)錄本的編碼產(chǎn)物均表現(xiàn)親水性（總平均疏水性負(fù)值是親水蛋白，正值為疏水蛋白），可變剪切事件沒有改變這一特性，且對(duì)應(yīng)的脂肪系數(shù)變化也很??；而在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（穩(wěn)定蛋白系數(shù)＜40，不穩(wěn)定蛋白系數(shù)＞40）、理論等電點(diǎn)方面，TaNAC 轉(zhuǎn)錄本卻可能因可變剪切事件使其編碼產(chǎn)物表現(xiàn)出性質(zhì)上的改變，如TaNAC_NTL5_7B.2編碼穩(wěn)定蛋白而其外顯子跳躍序列異構(gòu)轉(zhuǎn)錄本TaNAC_NTL5_7B.3編碼不穩(wěn)定蛋白；TaNAC008_3A.1編碼產(chǎn)物等電點(diǎn)為5.67（＜7）為酸性蛋白，而其外顯子跳躍序列異構(gòu)轉(zhuǎn)錄本TaNAC008_3A.2編碼的多肽鏈等電點(diǎn)為9.08（＞7）為堿性蛋白。另外，TaNAC 可變剪切轉(zhuǎn)錄本的編碼產(chǎn)物在功能域和理化性質(zhì)方面的變化，可能會(huì)導(dǎo)致其亞細(xì)胞定位發(fā)生變化。

表3 克隆得到的13 組TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本中正常編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)Table 3 Structural characteristics and physicochemical properties of the peptides encoded by the 13 groups of normal encoding transcripts selected from the cloned TaNAC transcripts

S：分段；o：外側(cè)；i：內(nèi)側(cè)；Nu：細(xì)胞核；Ex：胞外；Cy：細(xì)胞質(zhì)；Ch：葉綠體；Mi：線粒體。*：轉(zhuǎn)錄本從中國(guó)春小麥參考基因組（IWGSC RefSeq v1.1）中獲得
S: Segmented; o: Outside; i: Inside; Nu: Nuclear; Ex: Extracellular; Cy: Cytoplasmic; Ch: Chloroplast; Mi: Mitochondrial.*: The transcript was obtained from the wheat reference genome of Chinese Spring (IWGSC RefSeq v1.1)

2.4 TaNAC 可變剪切結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本編碼產(chǎn)物的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

選取的13 組TaNAC 可變剪切轉(zhuǎn)錄本中有7 組均包含至少2 條可正常編碼的轉(zhuǎn)錄本（提前終止視為正常編碼），對(duì)這7 組轉(zhuǎn)錄本編碼產(chǎn)物的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并分組進(jìn)行比較分析（表4）。結(jié)果表明，TaNAC008_3A和TaNAC092_2B可變剪切形成的結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的編碼產(chǎn)物，二級(jí)結(jié)構(gòu)變化較大（表4，圖4-a1—a4）。轉(zhuǎn)錄本TaNAC008_3A.2相對(duì)于TaNAC008_3A.1，其編碼產(chǎn)物形成α 螺旋（alpha helix）的氨基酸比例降低約50%（從28.48%降至14.65%），而形成延伸鏈（extended strand）結(jié)構(gòu)的氨基酸比例則從12.47%增至21.72%；而轉(zhuǎn)錄本TaNAC092_2B.1和TaNAC092_2B.3之間編碼肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化主要體現(xiàn)在 α 螺旋（氨基酸的比例從 18.93%增加至37.02%）和無規(guī)則卷曲（random coil）（氨基酸的比例從63.84%降至42.98%）。

基于二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，分別對(duì)轉(zhuǎn)錄本TaNAC008_3A.1、TaNAC008_3A.2、TaNAC092_2B.1和TaNAC092_2B.3編碼產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)（圖4-b1—圖4-b4），發(fā)現(xiàn)這4 條多肽序列在構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)均以水稻的壓力響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子NAC1 為模型，相似序列區(qū)間均在其肽段N 末端具有DNA 結(jié)合功能的NAM 保守結(jié)構(gòu)域，且構(gòu)建的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，均為中間凹陷的結(jié)構(gòu)，符合其功能特征。但是，預(yù)測(cè)得到的三級(jí)結(jié)構(gòu)在相對(duì)于水稻NAC1 的整體和局部的質(zhì)量評(píng)估等參數(shù)及結(jié)構(gòu)本身等方面均存在差異（圖4-b1—b4），其中TaNAC008_3A.2（圖4-b2）相對(duì)于TaNAC008_3A.1（圖4-b1），其編碼產(chǎn)物除了圖示的三級(jí)結(jié)構(gòu)差異外，還缺失了一段位于C 末端的α 螺旋結(jié)構(gòu)；而TaNAC092_2B.1（圖4-b3）和TaNAC092_2B.3（圖4-b4）編碼產(chǎn)物之間在預(yù)測(cè)的圖示三級(jí)結(jié)構(gòu)本身即有較明顯差異。

2.5 TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的亞細(xì)胞定位的比對(duì)分析

根據(jù)表3 中的預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇亞細(xì)胞定位信息有差異的結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本TaNAC013_3A.2和TaNAC013_3A.3，利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析（圖5）。結(jié)果顯示，對(duì)照組（pYJ-GFP）的洋蔥表皮細(xì)胞中，熒光信號(hào)在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中都有分布。試驗(yàn)組中，轉(zhuǎn)化TaNAC013_3A.2-pYJ-GFP 重組載體的洋蔥表皮細(xì)胞中，融合綠色熒光蛋白在多個(gè)位置表達(dá)，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均可觀察到明顯的綠色熒光信號(hào)；而轉(zhuǎn)化TaNAC013_3A.3-pYJGFP 載體的洋蔥表皮細(xì)胞中，只在細(xì)胞核的位置能夠觀察到綠色熒光信號(hào)。在分別瞬時(shí)表達(dá)2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本的洋蔥表皮細(xì)胞中，存在細(xì)胞核以外的綠色熒光信號(hào)差異，說明轉(zhuǎn)錄本TaNAC013_3A.2可以細(xì)胞核外（細(xì)胞質(zhì)）表達(dá)，而TaNAC013_3A.3僅能在細(xì)胞核表達(dá)。結(jié)果和表3 中的預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合。

2.6 TaNAC 結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的比較分析

通過對(duì)選取的5 組TaNAC結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行酵母自激活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)于α 半乳糖苷酶編碼基因MEL-1 的轉(zhuǎn)錄激活活性均有不同（圖6-a 和表5）。其中，TaNAC013_3A.1-pGBKT7 重組載體的轉(zhuǎn)化菌株有轉(zhuǎn)錄激活活性（B3），而代表TaNAC013_3A.2的菌株無轉(zhuǎn)錄激活活性（B4），這兩條轉(zhuǎn)錄本僅在起始密碼子之后第778 位有1 個(gè)堿基的差異，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物在第260 位存在絲氨酸（S）和甘氨酸（G）的變異；同時(shí)，這堿基變異位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄本TaNAC013_3A.3外顯子跳躍事件涉及的43 bp 序列區(qū)間，而代表TaNAC013_3A.3的菌株均具有轉(zhuǎn)錄激活活性（B1 和B2）；這些結(jié)果表明，這一具有單堿基變異的外顯子跳躍區(qū)間（770—812 bp）序列在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基（SD/-Trp/-His/-Ade）和金擔(dān)子素A（aureobasidin A，AbA）篩選培養(yǎng)基（SD/-Trp/AbA）上，僅有TaNAC008_3A的2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本重組pGBKT7 載體轉(zhuǎn)化的陽性Y2H Gold 酵母菌株（A1 和A2）表現(xiàn)出生長(zhǎng)狀態(tài)的差異，即轉(zhuǎn)錄本TaNAC008_3A.1在上述2 種條件下均具有轉(zhuǎn)錄激活活性而TaNAC008_3A.2均不表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活活性（圖6-b 和表5）；而其他4 組TaNAC 基因共計(jì) 15 條結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的重組pGBKT7 載體轉(zhuǎn)化的陽性Y2H Gold 酵母菌株在這兩種培養(yǎng)基上均能夠正常生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)情況無差異，即這些轉(zhuǎn)錄本在這兩種條件下均具有轉(zhuǎn)錄激活活性（表5）。

2.7 結(jié)合于小麥TaNAC 基因編碼區(qū)的miRNA 的預(yù)測(cè)分析

根據(jù)miRNA 數(shù)據(jù)庫miRBase（http://www.mirbase.org/）中的最新數(shù)據(jù)，目前報(bào)道的普通小麥中miRNA前體和成熟miRNA 的數(shù)量分別為122 和125 個(gè)，分為99 個(gè)miRNA 家族。利用psRNATarget 預(yù)測(cè)調(diào)控TaNAC 基因的miRNA 及其結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，搜索設(shè)置的期望值（expectation≤3.5）比建議條件（expectation≤5）更嚴(yán)格，所以預(yù)測(cè)結(jié)果會(huì)有更高的可信度。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，小麥中共有40 個(gè)TaNAC 基因通過可變剪切形成的45 條轉(zhuǎn)錄本在編碼區(qū)具有miRNA 結(jié)合位點(diǎn)（表6）。這45 條TaNAC 轉(zhuǎn)錄本共受到miRBase 數(shù)據(jù)庫中收錄的小麥含有的8 個(gè)miRNA 家族的9 個(gè)成熟miRNA 的調(diào)控，其中tae-miR164 調(diào)控?cái)?shù)量最多的TaNAC 基因（18 個(gè)）和轉(zhuǎn)錄本（21 條），其次為tae-miR1128 可以調(diào)控11 個(gè)TaNAC 基因編碼的12 條轉(zhuǎn)錄本。tae-miRNA 對(duì)TaNAC 轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)的調(diào)控方式主要為形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA inducing silencing complex，RISC）裂解靶標(biāo)mRNA（41/46），另有5 組調(diào)控方式為miRNA 介導(dǎo)的翻譯抑制。

表5 5 組TaNAC 基因的17 條結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性分析結(jié)果Table 5 Results of transcriptional activation of 17 structural variant transcripts from five TaNAC genes

表6 小麥參考基因組（IWGSC RefSeq v1.1）注釋的TaNAC 轉(zhuǎn)錄本與小麥tae-miRNA 的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)結(jié)果Table 6 The predicted relationship of the TaNAC transcripts in IWGSC RefSeq v1.1 and the tae-miRNA

續(xù)表6 Continued table 6

分析tae-miRNA 靶標(biāo)TaNAC 基因編碼序列上的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，tae-miR1128、tae-miR9677a 和tae-miR9780 與其各自對(duì)應(yīng)的TaNAC 轉(zhuǎn)錄本（總計(jì)16條）在NAM 保守結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)結(jié)合，調(diào)控它們的表達(dá)；其余miRNA 和TaNAC 轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合位點(diǎn)靠近ORF 的3′端。本研究涉及的所有能夠發(fā)生可變剪切的TaNAC 基因，其轉(zhuǎn)錄本與miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)均位于非可變剪切區(qū)域。這些結(jié)果表明，調(diào)控TaNAC 基因表達(dá)的miRNA 和可變剪切是各自獨(dú)立行使轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能的。

3 討論

3.1 TaNAC 基因可以通過可變剪切的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式參與脅迫響應(yīng)

本研究通過對(duì)克隆得到的TaNAC 基因的可變剪切轉(zhuǎn)錄本序列分析發(fā)現(xiàn)，可變剪切可以導(dǎo)致TaNAC轉(zhuǎn)錄本編碼序列結(jié)構(gòu)變異，進(jìn)而改變其編碼產(chǎn)物的序列結(jié)構(gòu)，即改變其對(duì)應(yīng)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)特征。對(duì)應(yīng)地，編碼序列結(jié)構(gòu)變異會(huì)影響其編碼產(chǎn)物的高級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位等。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，由可變剪切導(dǎo)致的TaNAC轉(zhuǎn)錄本編碼序列結(jié)構(gòu)變異也會(huì)帶來相應(yīng)編碼產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的功能變化。綜上所述，可變剪切事件導(dǎo)致TaNAC 轉(zhuǎn)錄本編碼序列變異，其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)等也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，進(jìn)而可能影響其亞細(xì)胞定位，最終通過其各自編碼產(chǎn)物對(duì)靶基因的識(shí)別、結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面的變化，影響TaNAC 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)。另外，有報(bào)道表明，在小麥抗病[30-31]、籽粒發(fā)育[32]等過程中均有可變剪切這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式參與，因此，推斷TaNAC 基因應(yīng)該可以通過可變剪切這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式參與脅迫響應(yīng)。

本文選取并分析的13 組TaNAC 可變剪切結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本是在條銹菌和白粉菌脅迫下，從普通小麥兼抗種質(zhì)N9134 中克隆得到的，這些可變剪切形成的新TaNAC 轉(zhuǎn)錄本大多沒有被中國(guó)春參考基因組（IWGSC RefSeq v1.1）注釋到，但是，它們到底是由于材料差異而特異存在的，還是因?yàn)樾←湠榱隧憫?yīng)條銹菌和白粉菌的脅迫由可變剪切形成的，這些還需要深入研究。另外，基于克隆得到的TaNAC可變剪切結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本在小麥參考基因組注釋信息中不存在的事實(shí)，推斷小麥TaNAC 基因在特定組織、不同生長(zhǎng)階段、或?yàn)榱隧憫?yīng)特定逆境，可能會(huì)通過可變剪切這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式，形成更多的轉(zhuǎn)錄本。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)、比對(duì)了這些TaNAC 可變剪切結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本，并對(duì)它們進(jìn)行了初步分析，然而TaNAC 基因可變剪切結(jié)構(gòu)變異的影響因素、調(diào)控機(jī)制、引起的功能變化和對(duì)下游靶基因的影響等還需要進(jìn)一步研究。

3.2 TaNAC 基因可變剪切和miRNA 耦聯(lián)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

從miRBase 數(shù)據(jù)庫收錄的miRNA 最新數(shù)據(jù)可知，在小麥、玉米（Zea maysL.）、水稻這三種最重要的糧食作物和兩種常用的模式植物擬南芥和二穗短柄草（Brachypodium distachyon(L.) Beauv.）中，小麥中的miRNA 前體和成熟miRNA 的數(shù)量均是最少的（表7）[33]。比較這5 個(gè)物種中其他功能基因家族成員數(shù)量的差異[6,14]，可以發(fā)現(xiàn)，基因組較小的物種所包含的基因家族成員數(shù)量一般不會(huì)比小麥、玉米等較大基因組的物種多。miRNA 作為功能基因的調(diào)控因子均有對(duì)應(yīng)的靶基因，據(jù)此推斷，小麥、玉米等大基因組的物種中，miRNA 家族的成員數(shù)量應(yīng)該不會(huì)比基因組較小的模式植物少，至少不會(huì)像目前這樣差距如此之大（表7）。

進(jìn)一步對(duì)已報(bào)道的不同物種中miRNA 家族成員的存在情況進(jìn)行比較分析（圖7），發(fā)現(xiàn)僅有miR156、miR159、miR160 等14 個(gè)miRNA 家族在上述5 個(gè)物種中同時(shí)存在，其余miRNA 家族成員大多為單個(gè)物種獨(dú)有。綜合上述分析推斷，基因組龐大且復(fù)雜的小麥中應(yīng)該存在大量的miRNA 待繼續(xù)挖掘。

目前，見諸報(bào)道的調(diào)控NAC 基因的miRNA 多為miR164 家族成員[7,34-35]。本研究利用已報(bào)道的小麥TaNAC 基因家族和tae-miRNAs 數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)到TaNAC基因除了tae-miR164 家族同樣可以受到其他miRNA家族的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，如tae-miR1128 等。本研究豐富了靶向調(diào)控小麥TaNAC 基因表達(dá)的tae-miRNA，但具體它們之間的調(diào)控關(guān)系、共同發(fā)揮的生物學(xué)功能等還需深入研究；基于小麥中有大量miRNA 待挖掘，所以能夠靶向調(diào)控TaNAC 基因的tae-miRNA 應(yīng)該能夠繼續(xù)豐富。

表7 小麥、玉米、水稻、二穗短柄草和擬南芥中已報(bào)道m(xù)iRNAs 的匯總分析Table 7 Summary and analysis of miRNAs reported in Triticum aestivum, Zea mays, Oryza sativa, Brachypodium distachyon and Arabidopsis thaliana

miRNA 可以通過和靶基因的ORF 區(qū)結(jié)合參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[23]，本研究分析結(jié)果顯示，在小麥中，tae-miRNA 與TaNAC 基因ORF 區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)均不涉及可變剪切事件，但因?yàn)樾←淭aNAC 基因應(yīng)該存在更多的可變剪切事件[6]，同時(shí)推斷小麥中應(yīng)該存在更多的miRNA，所以可以考慮將可變剪切和miRNA 耦聯(lián)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式作為它們各自單獨(dú)對(duì)TaNAC 基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的擴(kuò)充進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

同一編碼基因可變剪切形成的結(jié)構(gòu)變異轉(zhuǎn)錄本可以具有不同的生物學(xué)功能，據(jù)此推斷，TaNAC基因應(yīng)該可以通過可變剪切這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式參與小麥真菌脅迫響應(yīng)。另外發(fā)現(xiàn)，TaNAC 基因相關(guān)的miRNA 相對(duì)于可變剪切獨(dú)立行使轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能。

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Post-transcriptional Regulation of TaNAC Genes by Alternative Splicing and MicroRNA in Common Wheat (Triticum aestivum L.)

Lü ShiKai, MA XiaoLong, ZHANG Min, DENG PingChuan, CHEN ChunHuan, ZHANG Hong, LIU XinLun,JI WanQuan
College of Agronomy, Northwest Aamp;F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100,Shaanxi

【Objective】 In the present study, the common wheat (Triticum aestivum L.) was exposed to the stress of stripe rust and powdery mildew.Then the cloned TaNAC structural variation transcripts formed by alternative splicing were analyzed.And putative information of TaNAC genes regulated by miRNAs was annotated.It would shed light on the study of TaNAC genes in response to fungal stress of wheat at the post-transcriptional level.【Method】 After common wheat resistance germplasm N9134 being infected stripe rust and powdery mildew respectively , the leaves were sampled at eight time points.Then a large number of TaNAC transcripts were cloned from the mixed sample pool.Referring to the wheat genome annotation of Chinese Spring (IWGSC RefSeqv1.1), the sequence structure characteristics of TaNAC structural variation transcripts formed by alternative cutting were revealed.Using bioinformatics software and online tools, the coding products derived from these TaNAC transcripts were compared and analyzed, including the functional domain, advanced structure, physical and chemical properties, subcellular localization and other characteristics.And then, one pair of TaNAC structural variation transcripts were selected to further verify the predicted subcellular localizations by onion epidermis transient expression system.Meanwhile, five groups of TaNAC transcripts were conducted transcriptional self-activation experiments in yeast.It was aimed to analyze the effects of structural variation, which caused by alternative splicing on transcriptional regulation activity.Additionally, using the miRBase database, the targeting relationship between TaNAC genes and tae-miRNAs was forecasted and established in wheat.【Result】 In this study, 35 TaNAC structural variation transcripts were formed by alternative splicing form 13 TaNAC genes, and they all were cloned from common wheat N9134 after infecting by stripe rust and powdery mildew.After analyzing, it was found that there were differences in the nucleic acid sequence structure of different structural variation transcripts from the same TaNAC gene, as well as in the functional domain, advanced structure, physicochemical properties and subcellular localization of their corresponding coding products.And they might be with different transcriptional regulatory activities.Moreover, different TaNAC genes could be with different patterns of alternative splicing, and the coded products of the structural variation transcripts from different TaNAC genes showed diversity in characteristics of structure, physical and chemical properties, transcriptional regulatory activity and so on.By analysis of TaNAC genes and their target tae-miRNAs, which is in the coding region, the result showed that the binding sites of tae-miRNAs were all in the non-alternative splicing region.【Conclusion】 In conclusion, TaNAC genes might be involved in the response of wheat to fungal stress through the post-transcriptional regulation of alternative splicing.And the tae-miRNAs targeted to TaNAC genes could function post-transcriptional regulation independently of alternative splicing.

wheat; TaNAC transcription factor; microRNA; alternative splicing; post-transcriptional regulation; stress responses

2021-02-10；

2021-04-07

陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019DLNY04-06）

聯(lián)系方式：呂士凱，E-mail：lvshikaiyd@163.com。通信作者吉萬全，E-mail：jiwanquan2008@126.com。通信作者劉新倫，E-mail：liuxxlun@126.com。通信作者張宏，E-mail：zhangh1129@nwafu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）