控制展青霉素產(chǎn)生菌方法綜述

李 瑞，胡青菊，沈雪維，張東新，殷 勤， 段騰飛

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

我國每年生產(chǎn)大量的水果、谷物及其制品，除了滿足自身需求，在出口貿(mào)易中也占有很大比例。近年來，食品中毒事件頻發(fā)，引起了社會的高度關(guān)注，其中真菌毒素引起食品污染的事件發(fā)生在日常飲食中，時刻影響著人類的健康。許多國家對果品中展青霉素檢出率都有嚴(yán)格的限定。因此，研究如何使果品中展青霉素達(dá)到良好的控制效果具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。

1 展青霉素及其在果蔬行業(yè)的危害

1.1 展青霉素的理化性質(zhì)

展青霉素又名珊瑚青霉毒素、棒曲毒素，是一種普遍存在于食品中的真菌類毒素。化學(xué)名稱為4-羥基4-氫-呋喃，分子式為C7H6O4，分子量為154，呈無色結(jié)晶，易溶于氯仿、丙酮、水、乙醇及乙酸乙酯，微溶于乙醚和苯，不溶于石油醚。展青霉素是一種多聚乙酰內(nèi)酯，在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，堿性條件中活性降低易被破壞[1-2]。

1.2 展青霉素的毒性

展青霉素是由擴(kuò)展青霉、曲霉等各種真菌產(chǎn)生具有遺傳毒性的次級代謝物[3]。對人體和動物具有未知的潛在毒性，長期食用含展青霉素制品會對機(jī)體功能造成嚴(yán)重?fù)p害，可能會引起嘔吐、惡心、便血、抽搐、昏迷等癥狀。世界衛(wèi)生組織對展青霉素的毒性進(jìn)行檢測分析并將其列為三類致癌物。通過大量細(xì)胞毒理學(xué)和動物試驗(yàn)，認(rèn)為展青霉素的毒性表現(xiàn)在致癌性、急性毒性、免疫毒性、生育毒性、亞急性毒性、腎毒性、皮膚毒性、遺傳和和細(xì)胞毒性等[4]。

世界衛(wèi)生組織、歐盟和美國的食品藥品監(jiān)督管理局對食品中展青霉素的殘留問題給予了高度重視。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定食品中展青霉素的含量不得高于10~15LD50/(mg/kg)[5]。盡管國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中展青霉素的含量進(jìn)行了嚴(yán)格限定，仍然有大量產(chǎn)品難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，如何降低食物中的展青霉素已經(jīng)演變?yōu)楫?dāng)今世界面臨的重要難題之一。

1.3 展青霉素在果蔬行業(yè)的危害

在果蔬生產(chǎn)、加工、包裝、貯存、運(yùn)輸、銷售、食用等過程中容易受到機(jī)械損傷，果皮受損后很容易被病原菌侵染而產(chǎn)生霉變。常見的寄主包括蘋果、獼猴桃、梨、番茄等水果及其加工制品[6]。

研究表明，即使去除發(fā)霉水果的腐爛部分，周圍新鮮組織中仍含有展青霉素污染的情況。這些水果再經(jīng)過加工生產(chǎn)，使得果汁、果酒等產(chǎn)品中的展青霉素難以達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。不僅構(gòu)成了極大的安全隱患，也在很大程度上制約了我國農(nóng)產(chǎn)品的出口貿(mào)易，對果蔬產(chǎn)業(yè)發(fā)展也是巨大的打擊。因此，為了維護(hù)公眾健康和食品安全，需要在確保安全的前提下，盡可能對食品中的展青霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行預(yù)防和控制。

2 展青霉素的檢測方法

由于展青霉素能夠帶來多種復(fù)雜的潛在毒性，因此各國學(xué)者一直致力于研發(fā)能夠快速準(zhǔn)確檢測展青霉素的方法。雖然目前針對展青霉素的測定方法有多種，但各有缺陷。薄層色譜法操作繁瑣，液相色譜設(shè)備昂貴，對樣品純度要求高，氣相色譜前處理繁雜，酶免疫吸附不成熟。

我國研究人員一直致力于尋找可以快速有效測定水果中展青霉素的方法。2020年出版的《中國藥典》對2 351種真菌毒素的測定方法進(jìn)行了修訂，特別提出了使用液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用色譜法、多種真菌毒素液質(zhì)聯(lián)用法和黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫法（黃曲霉素ELISA）[7]檢測展青霉素。

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）最早被用于蘋果制品中展青霉素含量的測定。該方法設(shè)備簡單、成本低廉，但在樣品預(yù)處理操作時較繁雜費(fèi)時，需要經(jīng)過有機(jī)溶劑萃取、碳酸鈉凈化、真空減壓濃縮、薄層展開等定量分析步驟，雜質(zhì)干擾較嚴(yán)重，難以避免假陽性，有時分離效果不好，只能半定量[8]，并且不能檢測出果品中殘留的展青霉素。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）較于薄層色譜法而言，效率更高、靈敏度更大、適用范圍更廣、分析速度更快[9]。但價格昂貴，需使用各種填料粒和大量的流動相，并且容量小、大多具有毒性。李先江等人[10]采用液相色譜法對乙腈中展青霉素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性、短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性的評價。

2.3 色譜聯(lián)用技術(shù)

色譜聯(lián)用技術(shù)主要分為液-質(zhì)聯(lián)用色譜法（LC/MS）和氣-質(zhì)聯(lián)用色譜法（GC/MS）。GC/MS能夠高效分離待測物質(zhì)，需要衍生介質(zhì)、衍生促進(jìn)劑、內(nèi)標(biāo)進(jìn)行分析前衍生化，前期浸提處理費(fèi)時、繁瑣[11]。LC/MS在檢測展青霉素前需要經(jīng)過溶劑萃取和提取液凈化，然后進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜檢測。液-質(zhì)聯(lián)用色譜法可以滿足快速篩查和精確定性定量的要求[12]。質(zhì)譜與色譜的結(jié)合可以充分利用兩者的優(yōu)勢[13]。

2.4 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫學(xué)檢測技術(shù)具有成本低、便捷、高效、快速等特點(diǎn)。其原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，再使用諸如同位素、熒光素或酶之類的標(biāo)記技術(shù)來定性或定量的顯示待測物質(zhì)[14]。目前，除了Mcelroy L J等人[15]利用多克隆抗體建立的酶聯(lián)免疫法廣泛運(yùn)用以外，還開發(fā)出了放射免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫傳感器等多種準(zhǔn)確可靠的檢測技術(shù)[16]。

3 展青霉素的防治控制方法

3.1 脫毒方法

3.1.1 物理脫毒

物理脫毒的方法有輻射、加熱、吸附等。紫外照射、電磁輻射的方法能夠在不同程度上減少展青霉素的含量，微波處理、稀釋法和加熱法等也能夠達(dá)到降解效果。另外，活性炭、硅膠、樹脂等具有吸附作用物質(zhì)可以在液態(tài)環(huán)境中控制展青霉素的含量。但是，物理脫毒的局限性在于成本高和操作過程繁瑣，目前仍停留在試驗(yàn)階段，尚未投入實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中。

3.1.2 化學(xué)脫毒

化學(xué)脫毒的方法有加二硫化物法、加鹽法、加酸法、加堿法等。加二硫化物法已用于造酒、飲料、果干及濕法碾谷的生產(chǎn)脫毒，作用機(jī)理是二硫化物能夠與展青霉素發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生具有生物活性的化合物，從而達(dá)到脫毒效果[17]。另外，臭氧對展青霉素也有氧化降解脫毒功能。有研究發(fā)現(xiàn)，植物活性提取物能夠去除展青霉素或者降低其毒性，從而進(jìn)一步提高果蔬的貯藏效果[18]。

3.1.3 生物脫毒

生物脫毒的主要原理是菌株通過吸附作用來達(dá)到降低展青霉素的目的。代表性菌株包括氧化葡萄糖桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和多種酵母菌[19]。此外，酶也能作為生物解毒劑，具有代表性的豬胰脂肪酶就具有成本低、高效、環(huán)保的特點(diǎn)，是使用較廣泛的生物脫毒方法之一。

3.2 抑菌方法

3.2.1 物理抑菌

通過紫外照射、低溫或者熱激等物理手段可以抑制果實(shí)表面展青霉素產(chǎn)生菌的活性。

巴氏殺菌能夠破壞展青霉素產(chǎn)生菌的孢子，低溫能降低果實(shí)中乙烯的釋放量并減弱病原菌生長繁殖能力，氣調(diào)貯藏是通過人工調(diào)改O2和CO2的比例來達(dá)到防腐保鮮的目的[20]。該方法操作簡單、效果良好，但在抑菌的同時會影響果蔬的口感和營養(yǎng)價值。

3.2.2 化學(xué)抑菌

通過利用殺菌劑（如噻菌靈、咪酰胺、克菌丹、抑霉唑等）、防腐劑、酚類抗氧化劑、食品添加劑等[21]來達(dá)到抑菌作用。但長期濫用化學(xué)殺菌劑易使展青霉素產(chǎn)生菌有耐藥性，甚至?xí)龠M(jìn)病菌生長，造成嚴(yán)重的安全隱患和農(nóng)藥殘留問題。

3.2.3 生物抑菌

（1）酵母菌。相比物理抑菌和化學(xué)抑菌，利用微生物抑菌更加安全、環(huán)保。采用酵母菌抑制擴(kuò)展青霉的原理主要可以分為2個方向：①直接作用：進(jìn)行營養(yǎng)和空間競爭，并且分泌胞外水解酶產(chǎn)生抑制作用；②間接作用：提高水果抗性相關(guān)酶的活性，來誘導(dǎo)組織產(chǎn)生抗性[22]。

（2）芽孢桿菌。芽孢桿菌通過營養(yǎng)競爭、分泌脂肽類抗生素及誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性來抑制病菌產(chǎn)毒，具有高效、安全、綠色環(huán)保的特點(diǎn)[23]。其中，枯草芽孢桿菌分布廣、抗逆性強(qiáng)、繁殖快并且能產(chǎn)生大量的代謝物。這種低成本的處理可以在不破壞果蔬品質(zhì)的前提下達(dá)到高效的抑菌效果。

4 結(jié)語

隨著國民收入的不斷增加，人們關(guān)注的焦點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移至食品安全上來。當(dāng)大量不達(dá)標(biāo)的食品流入市場，使人們被動陷入展青霉素的威脅之中。

目前，雖已經(jīng)研制出多種天然保鮮專利產(chǎn)品，但仍存在諸多問題，每一種都無法從根源上徹底消除展青霉素。研究開發(fā)安全、環(huán)保的天然生物防控機(jī)制不僅關(guān)系到我國水果產(chǎn)業(yè)能否持續(xù)、高速地發(fā)展，更時刻影響著人們的健康。因此，如何安全有效地抑制展青霉素產(chǎn)生菌成為了國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。