示差折光高效液相色譜法測(cè)定無(wú)糖食品中的異麥芽酮糖醇

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233)

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，以及人們對(duì)低熱量和無(wú)糖食品的青睞。功能糖醇在食品領(lǐng)域的應(yīng)用得到了迅猛的發(fā)展，目前市場(chǎng)上非常流行的含有功能糖醇無(wú)糖飲料、無(wú)糖糖果以及無(wú)糖糕點(diǎn)等，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。異麥芽酮糖醇是近年來(lái)國(guó)際上新型的功能糖醇，它作為蔗糖的替代品，由于其良好的理化性質(zhì)、功能特點(diǎn)及口感，在無(wú)糖食品領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1,2]。

異麥芽酮糖醇(Isomalt)又名帕拉金糖醇(Palatinitol)，亦稱為益壽糖，由蔗糖用酶法轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖后，經(jīng)催化加氫而得的α-D-呋喃葡糖基-1，6-D-山梨糖醇和α-D-呋喃葡糖基-1，1-D-甘露糖醇混合物[3]。異麥芽酮糖醇化學(xué)性質(zhì)極其穩(wěn)定，不易吸濕，也不會(huì)發(fā)粘，在長(zhǎng)時(shí)間高溫時(shí)，其結(jié)構(gòu)也不會(huì)改變[4,5]。如果將其晶體加熱到熔點(diǎn)或?qū)⑵渌芤杭訜岬椒悬c(diǎn)以上，也觀察不到其分子結(jié)構(gòu)有所變化。具有分散性好，不粘結(jié)，易于包裝、運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)。異麥芽酮糖醇味道溫和，是一種新興的食品添加劑，可為食品增加甜味和晶體結(jié)構(gòu)?？茖W(xué)家和營(yíng)養(yǎng)學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，人體以及體內(nèi)微生物對(duì)異麥芽酮糖醇的應(yīng)答有許多方式，例如飽腹感、低胰島素血反應(yīng)、低消化性、低血糖反應(yīng)、產(chǎn)生斷鏈脂肪酸和益生菌等等[6-8]。食用異麥芽酮糖醇具有飽腹感，代謝沒(méi)有負(fù)擔(dān)，可減少高熱量食物的攝入等優(yōu)點(diǎn)，還具有降低能量值和維持血糖穩(wěn)定的作用，作為糖的替代品，適量的攝入不但能夠很好的控制體重遠(yuǎn)離肥胖，而且還可以降低一些疾病的發(fā)生，例如冠心病、糖尿病、高血糖等等[9,10]。異麥芽酮糖醇具有和其他食用糖醇(山梨醇、麥芽糖醇、木糖醇等)相類(lèi)似的性質(zhì)，如純正的甜味、低熱值、防齲齒糖尿病人可食用等[11,12]。異麥芽酮糖醇也具有很好的食品安全性，通過(guò)對(duì)其急性和亞慢性毒性研究，結(jié)果表明沒(méi)有毒性和致癌性，也未見(jiàn)有致突變性及致畸性[13]。因此作為一種糖的代替品，異麥芽酮糖醇有著廣闊的應(yīng)用前景[14]。

目前針對(duì)異麥芽酮糖醇的研究，更多的是對(duì)其理化性質(zhì)、制備工藝、產(chǎn)品用途以及食用是否健康安全方面做了大量的探索[15-21]。國(guó)內(nèi)對(duì)于無(wú)糖食品中異麥芽酮糖醇的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜通過(guò)示差折光檢測(cè)器測(cè)定無(wú)糖食品中的異麥芽酮糖醇含量的方法，本方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)糖飲料、無(wú)糖糖果以及無(wú)糖糕點(diǎn)中異麥芽酮糖醇含量的分析測(cè)定。此方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器和試劑

Waters高效液相色譜儀(配備示差檢測(cè)器)；萬(wàn)分位電子天平；超聲波清洗器；渦旋混合器；離心機(jī)。

異麥芽酮糖醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)；赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，)；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、三氯乙酸(優(yōu)級(jí)純)；乙腈(色譜純)；三乙胺。

本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的樣品均從超市購(gòu)買(mǎi)。

1.2 溶液的配制

乙酸鋅溶液：準(zhǔn)確稱取21.9g乙酸鋅，加入冰乙酸3 mL，加水定容至100mL，溶解并混勻。

亞鐵氰化鉀溶液：準(zhǔn)確稱取10.9g亞鐵氰化鉀，加水定容至100mL，溶解并混勻。

三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取10 g三氯乙酸，加水定容至100 mL，溶解并混勻。

異麥芽酮糖醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(50 mg/mL)：稱取5.000 g(精確到0.001 g)異麥芽酮糖醇于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容到刻度，4℃冰箱中可以保存2周。異麥芽酮糖醇標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取0.02 mL、0.04 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.0 mL、2 mL、4 mL異麥芽酮糖醇標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，相當(dāng)于0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、5.0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

(1)無(wú)糖飲料

稱取混合均勻的樣品2.5g(精確到0.001 g)于50 mL具塞離心管中，加入30 mL水，渦旋1 min，下超聲30 min，用水定容到50 mL，渦旋1 min，過(guò)0.22 μm(PTFE)微孔濾膜至樣品瓶，供測(cè)定。

(2)無(wú)糖糖果

稱取混合均勻的樣品2.5 g(精確到0.001 g)于50 mL離心管中，加入30 mL水，渦旋1 min，室溫下超聲30 min，用水定容到50 mL，渦旋1 min，以9000 r/min離心2 min，過(guò)0.22 μm(PTFE)微孔濾膜至樣品瓶，供測(cè)定。

(3)無(wú)糖糕點(diǎn)

稱取混合均勻的樣品2.5 g(精確到0.001 g)于50 mL離心管中，加入30 mL水，渦旋1 min，室溫下超聲30 min，緩慢加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1 mL，加水定容至50 mL，渦旋1 min，以9000 r/min離心2 min，過(guò)0.22 μm(PTFE)微孔濾膜至樣品瓶，供測(cè)定。

2.2.3液相色譜分析條件

色譜柱為XBridge?BEH Amide 5 μm(4.6×250 mm)色譜柱，流動(dòng)相A為乙腈-水-三乙胺(3∶1∶0.002,V/V/V)溶液，等度洗脫，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為40℃；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

糖醇類(lèi)易溶于水，因此前處理選擇用水提取異麥芽酮糖醇。本實(shí)驗(yàn)采用XBridge?BEH Amide色譜柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析，流動(dòng)相中乙腈比例的多少直接影響分離效果，經(jīng)多次試驗(yàn)，確定選擇乙腈-水-三乙胺(3∶1∶0.002,v/v/v)溶液作為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫。在此條件下，異麥芽酮糖醇在14min左右出峰，其峰形較窄且具有很好的分離度，如圖1，不會(huì)受到其他無(wú)糖食品中常見(jiàn)糖醇的干擾(例：赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇)，如圖2所示，該方法對(duì)異麥芽酮糖醇的選擇性很好。同時(shí)選擇基質(zhì)比較復(fù)雜的無(wú)糖糕點(diǎn)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，如圖3所示。從圖譜中發(fā)現(xiàn)異麥芽酮糖醇具有很好的回收，該基質(zhì)對(duì)異麥芽酮糖醇的分析檢測(cè)幾乎無(wú)影響，說(shuō)明用該方法檢測(cè)無(wú)糖食品中的異麥芽酮糖醇是可行的。因此，本實(shí)驗(yàn)以乙腈-水-三乙胺(3∶1∶0.002,v/v/v)溶液作為流動(dòng)相。

圖1 異麥芽酮糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 其他常見(jiàn)糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖

2.2 超聲時(shí)間的優(yōu)化

考察了不同超聲時(shí)間對(duì)樣品中異麥芽酮糖醇提取效率的影響，選擇了相對(duì)復(fù)雜的無(wú)糖糕點(diǎn)作為基質(zhì)，加入相同質(zhì)量濃度的異麥芽酮糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別選取了10 min、20 min和30 min作為低、中、高3個(gè)時(shí)間點(diǎn)。在相同條件下對(duì)異麥芽酮糖醇進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示，不同超聲時(shí)間異麥芽酮糖醇的提取率未發(fā)生明顯的變化，故選擇超聲時(shí)間20 min作為提取時(shí)間。

另外，本實(shí)驗(yàn)還考察了超聲溫度對(duì)提取效率的影響。分別選取20℃、30℃、40℃這3個(gè)溫度點(diǎn)，在同樣的條件下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明在這3種超聲溫度下，提取效率無(wú)明顯差異，均能滿足測(cè)定需求。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲溫度不做特別要求。

2.3 沉淀方式的優(yōu)化

對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的無(wú)糖食品，由于樣品中含有難溶脂肪或者蛋白質(zhì)等難以溶解的雜質(zhì)，不能直接進(jìn)樣分析，需要除去雜質(zhì)后再進(jìn)行后續(xù)分析檢測(cè)。基于此，實(shí)驗(yàn)分別考察了乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液(1∶1；v：v)、乙腈、三氯乙酸這3種沉淀方式對(duì)于樣品中目標(biāo)物提取效率的影響。稱取3份無(wú)糖糕點(diǎn)，分別加入相同濃度的異麥芽酮糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法進(jìn)行處理，分別用乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液、乙腈、三氯乙酸溶液作為沉淀劑，結(jié)果如圖5所示，表明采用乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀劑，異麥芽酮糖醇具有很好的回收率。因此，本實(shí)驗(yàn)使用乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液作為無(wú)糖糕點(diǎn)中沉淀雜質(zhì)的方式。

圖5 不同沉淀方式對(duì)異麥芽酮糖醇提取效率的影響

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

用去離子水將異麥芽酮糖醇的標(biāo)準(zhǔn)中間液配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按色譜條件對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y，待測(cè)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)線性回歸后求得相關(guān)系數(shù)。根據(jù)檢出限的定義，以信噪比S/N=3為樣品的檢出限(LODS)，S/N=10為樣品的定量限(LOQS)，結(jié)果如表1所示。

表1 異麥芽酮糖醇的線性方程

2.5 方法回收和精密度試驗(yàn)

選取3種有代表性的陰性空白樣品基質(zhì)(無(wú)糖飲料、無(wú)糖糖果、無(wú)糖糕點(diǎn))，分別按低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平(10 g/kg、20 g/kg、50 g/kg)進(jìn)行添加，每個(gè)添加水平做6個(gè)平行試驗(yàn)。然后在相同的處理和檢測(cè)條件下測(cè)定回收率，檢測(cè)結(jié)果如表2所示，加標(biāo)回收率在93.0%～105.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3%。由此可見(jiàn)，本方法具有較高的準(zhǔn)確性。

表2 異麥芽酮糖醇回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用本方法對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的12份無(wú)糖食品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果中有1份無(wú)糖糖果樣品中異麥芽酮糖醇的含量為 93.2g/100g，其余樣品均未檢測(cè)到目標(biāo)物。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜法通過(guò)示差折光檢測(cè)器檢測(cè)無(wú)糖食品中異麥芽酮糖醇含量的方法，該方法操作便捷，易于掌握，選擇性好，穩(wěn)定性高，可以滿足食品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制和質(zhì)檢部門(mén)進(jìn)行市場(chǎng)監(jiān)管的需求。