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    貴州花紅離體再生體系的建立與優(yōu)化

    2021-12-06 07:50:56鄒思艷吳敏芳文曉鵬
    關(guān)鍵詞:花紅子葉離體

    鄒思艷, 田 田, 吳敏芳, 文曉鵬

    1. 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025;2. 貴州大學(xué) 林學(xué)院,貴陽(yáng) 550025

    花紅(Malusasiatica)屬薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉小喬木,既可以作為果實(shí)開發(fā),也可以作為蘋果的良好砧木,同時(shí)也是貴州省重要的蘋果種質(zhì)資源[1],但其繁殖效率較低.高效的離體再生體系對(duì)于苗木快繁具有重要意義[2],也是開展遺傳轉(zhuǎn)化研究的前提[3].外植體的選擇對(duì)于植物離體再生體系的建立至關(guān)重要,葉片是蘋果屬植物離體再生常用的外植體,此外,子葉、莖尖和下胚軸等均可通過(guò)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出完整植株[4].花紅的離體再生研究較早,蔣啟林等[5]利用花紅幼胚成功誘導(dǎo)成苗并建立快繁體系,萬(wàn)瑩[6]和陳鑫[7]以來(lái)安花紅莖段為外植體建立了快繁體系,但易受胚發(fā)育程度和數(shù)量的限制,也會(huì)受莖段木質(zhì)化程度所影響,致其繁殖系數(shù)相對(duì)較低.由于葉片和子葉不受材料發(fā)育階段及數(shù)量的限制,本研究以花紅葉片和子葉為外植體誘導(dǎo)再生,探究不同因子對(duì)其直接再生不定芽頻率的影響,以期建立高效的花紅離體再生體系,為花紅轉(zhuǎn)基因工作奠定理論基礎(chǔ),也為花紅新品種培育和砧木遺傳改良提供新途徑.

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    以貴州省黔西縣本地品種花紅的幼胚、子葉(成熟胚)及組培苗葉片為材料.

    1.2 研究方法

    1.2.1 外植體的獲得

    幼胚:取花后40 d的花紅幼果,自來(lái)水沖洗1 h,于超凈工作臺(tái)上用75%的酒精滅菌30 s,無(wú)菌水洗2~3次,再用0.1%的升汞溶液加2滴吐溫20滅菌10 min,無(wú)菌水清洗3~4次,吸水紙吸干水分,切除果肉,取出幼胚備用.

    子葉:選取成熟飽滿、顆粒均一的花紅種子,用無(wú)菌水浸泡10 min后,于超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒30 s,無(wú)菌水洗2~3次,再用10%的次氯酸鈉溶液處理10 min,無(wú)菌水洗3~4次,吸水紙吸干水分后,剝除種皮,取出兩片子葉,頂端胚芽切除,另一端切去1/3備用.

    葉片:取本實(shí)驗(yàn)室繼代保存的花紅組培苗上部幼嫩的葉片,將葉片邊緣和葉柄切除,用手術(shù)刀垂直主葉脈將背面(遠(yuǎn)軸面)劃傷備用.

    1.2.2 外植體類型對(duì)不定芽再生的影響試驗(yàn)

    取上述幼胚和成熟胚的子葉為外植體,正面朝上分別接種于以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、添加2.0 mg/L TDZ和0.1 mg/L NAA的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中;葉片外植體背面朝上接種到葉片不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(MS+3.0 mg/L TDZ+0.20 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA).暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)光下培養(yǎng),光照時(shí)間為12 h/d,培養(yǎng)溫度(25±1) ℃,光照強(qiáng)度 2 000~2 500 lx.每個(gè)處理接種20個(gè),重復(fù)3次.

    1.2.3 暗培養(yǎng)時(shí)間及子葉部位對(duì)不定芽再生的影響試驗(yàn)

    將上述成熟胚的子葉斜切近胚芽端,正切另一端,接種于再生培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L NAA)上,分別進(jìn)行不同時(shí)間(0 d,7 d,14 d)的暗培養(yǎng)處理.每個(gè)處理接種20個(gè),重復(fù)3次.

    1.2.4 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)不定芽再生的影響試驗(yàn)

    為篩選誘導(dǎo)不定芽分化的最佳組合生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)(Plant Growth Regulator,PGR),將上述成熟胚的子葉分別接種于16個(gè)含有不同濃度的TDZ(1.0,2.0,3.0,4.0 mg/L),NAA(0.05,0.10,0.20,0.40 mg/L),IBA(0,0.05,0.10,0.20 mg/L)不定芽再生培養(yǎng)基中,暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)50 d.每個(gè)處理接種20個(gè)子葉,重復(fù)3次.光下培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)各處理下不定芽的誘導(dǎo)率.

    1.2.5 不定芽增殖培養(yǎng)

    待子葉誘導(dǎo)出叢芽之后(50 d),切除多余子葉,將叢芽分別轉(zhuǎn)入到含有0.05 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2周后,切取長(zhǎng)勢(shì)一致的單株芽分別接種于9個(gè)不同濃度6-BA(1.0,2.0,4.0 mg/L)和NAA(0.1,0.2,0.3 mg/L)的增殖培養(yǎng)基中,每瓶接種4株,重復(fù)5次.光下培養(yǎng)40 d后,觀察記錄不定芽的生長(zhǎng)情況,并統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù).

    1.2.6 生根培養(yǎng)

    待不定芽生長(zhǎng)至1.5~2.5 cm時(shí),用解剖刀切取單株的苗接種于含有不同激素濃度的生根培養(yǎng)基中,生根培養(yǎng)基采用 1/2 MS+ 20 mg/L蔗糖+6 mg/L瓊脂作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同濃度的IBA(0.5,1.0,2.0 mg/L)和NAA(0,0.1,0.2 mg/L).每個(gè)處理接種4株增殖苗,重復(fù)5次,培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)各處理的生根情況.

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行處理,采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)及差異顯著性分析.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 外植體類型對(duì)不定芽再生的影響

    不同外植體對(duì)花紅離體再生有很大的影響.結(jié)果表明,花紅子葉與幼胚和葉片在再生培養(yǎng)基上的再生率有差異,幼胚和葉片均無(wú)不定芽形成,成熟胚的子葉培養(yǎng)于MS+2.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中,不定芽再生率為11.67%.

    2.2 暗培養(yǎng)時(shí)間及子葉部位對(duì)不定芽再生的影響

    前期暗培養(yǎng)對(duì)植物再生不定芽有一定的促進(jìn)作用,暗培養(yǎng)7 d能夠顯著促進(jìn)子葉再生不定芽.結(jié)果表明,子葉暗培養(yǎng)后變黃,且體積膨大至原來(lái)的2倍時(shí),未經(jīng)暗培養(yǎng)的子葉無(wú)明顯變化(表1).暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)13 d,子葉開始產(chǎn)生不定芽(圖1a);暗培養(yǎng)0 d和暗培養(yǎng)14 d的子葉均無(wú)不定芽產(chǎn)生.

    暗培養(yǎng)7 d后的子葉轉(zhuǎn)光下培養(yǎng),子葉迅速轉(zhuǎn)綠,近軸面近胚芽端切口處出現(xiàn)疑似不定芽雛形,接種20 d后開始出現(xiàn)不定芽,并陸續(xù)發(fā)育成小植株.50 d時(shí)不定芽再生率達(dá)到最高(圖1b),子葉再生的不定芽大部分發(fā)生于近軸面近胚端切口處,再生率達(dá)36.7%,相較遠(yuǎn)胚端增高約11倍(表1),表現(xiàn)出明顯的極性效應(yīng).

    表1 培養(yǎng)時(shí)間及子葉部位對(duì)誘導(dǎo)再生不定芽的影響

    2.3 PGR濃度對(duì)子葉再生不定芽的影響

    植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)花紅子葉再生不定芽有很大影響.結(jié)果表明,在添加了1.0 mg/L TDZ和0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上,子葉誘導(dǎo)不定芽的再生率最高達(dá)38.9%,再生芽數(shù)最多,平均11.7個(gè)(表2).

    表2 PGR濃度對(duì)花紅子葉再生不定芽的影響

    2.4 6-BA和NAA濃度對(duì)花紅不定芽增殖的影響

    不同6-BA和NAA濃度配比對(duì)花紅不定芽的增殖系數(shù)及增殖效果影響較大(表3),培養(yǎng)基MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的不定芽增殖系數(shù)最高,為7.73,但芽細(xì)弱,長(zhǎng)勢(shì)差,呈玻璃化狀.從芽的長(zhǎng)勢(shì)及健康程度來(lái)看,培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA中不定芽生長(zhǎng)狀態(tài)最好,伸長(zhǎng)明顯(圖1c),增殖系數(shù)較高,為最佳增殖培養(yǎng)基.

    表3 6-BA和NAA濃度對(duì)不定芽增殖的影響

    2.5 生根培養(yǎng)

    增殖后的花紅不定芽在含有不同濃度IBA(0.5,1.0,2.0 mg/L)和不同濃度NAA(0,0.1,0.2 mg/L)的1/2MS生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),一段時(shí)間后不同濃度組合的生根率有明顯差異.結(jié)果表明,1/2 MS+1.0 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA生根培養(yǎng)基,暗培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)生根率(60%)最高,且根系粗壯,須根多(圖1f).

    表4 IBA和NAA濃度對(duì)花紅不定芽生根的影響

    圖1 花紅子葉誘導(dǎo)不定芽再生過(guò)程

    3 討 論

    以往對(duì)花紅組織培養(yǎng)的研究中,多以幼胚和帶芽莖段為外植體建立快繁體系,但是繁殖系數(shù)受胚發(fā)育程度和莖段木質(zhì)化影響較大[5-7].二球懸鈴木再生研究表明,子葉再生體系較葉片再生體系受基因型影響較小、組織肥厚不易褐化、再生效率更加穩(wěn)定[8],并且子葉具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),作為外植體被廣泛應(yīng)用于不定芽再生體系中[9-10].幼胚發(fā)育至接近子葉期才有不定芽發(fā)生的能力[11],且成熟胚子葉作為外植體再生不定芽誘導(dǎo)率較高,再生能力較強(qiáng)[12].本試驗(yàn)研究了花紅的幼胚、成熟胚的子葉和葉片離體再生不定芽的能力,結(jié)果僅有花紅成熟胚的子葉作為外植體,成功建立了花紅的離體再生體系.楊海峰[13]認(rèn)為全光照是獲得高效再生的關(guān)鍵技術(shù)之一,但也有研究指出,前期暗培養(yǎng)有利于不定芽的再生[14-16].本研究的結(jié)果表明,暗培養(yǎng)7 d比直接光照培養(yǎng)更有利于花紅子葉再生不定芽,且近胚端再生率顯著高于遠(yuǎn)胚端,導(dǎo)致該結(jié)果的主要因素可能是與子葉近胚端到遠(yuǎn)胚端IAA(吲哚乙酸)信號(hào)逐漸減弱、生長(zhǎng)素差異分布有關(guān)[17].

    生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和含量對(duì)植物離體再生植株的影響極大[18],其對(duì)植物器官直接發(fā)生途徑的影響首先表現(xiàn)在對(duì)不定芽的誘導(dǎo)上[19].前人的研究結(jié)果[20-21]表明,TDZ較6-BA更有利于離體不定芽的再生,TDZ能顯著促進(jìn)較難誘導(dǎo)分化的植物的離體培養(yǎng),能有效改善其誘導(dǎo)率[22-23].有研究證實(shí),適宜濃度的TDZ是誘導(dǎo)西瓜外植體分化的關(guān)鍵,低濃度NAA也有利于西瓜外植體的分化[24].TDZ與NAA的適宜濃度比能促進(jìn)花紅不定芽的分化,但高濃度TDZ會(huì)明顯抑制不定芽的再生,且誘導(dǎo)出的不定芽失綠,生長(zhǎng)緩慢,后期褐化死亡.

    當(dāng)NAA濃度高于1.0 mg/L時(shí)會(huì)加重組培苗玻璃化效應(yīng),而低濃度的6-BA能有效降低玻璃化效應(yīng)[25].在花紅增殖培養(yǎng)過(guò)程中,高濃度6-BA和NAA的組合使得組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,葉片變脆,叢芽難以分離成單株等問(wèn)題.宋常美等[26]的研究表明,壯苗培養(yǎng)可適當(dāng)加入赤霉素(GA),GA不僅能促進(jìn)增殖,還能促進(jìn)生根,縮短了壯苗的時(shí)間.萬(wàn)瑩[6]的研究由于激素用量、基本培養(yǎng)基不適及品種性能等原因,導(dǎo)致在來(lái)安花紅離體快繁的研究中未獲得生根試管苗.本試驗(yàn)綜合“錫金海棠”和“青砧一號(hào)”的生根培養(yǎng)基[27],通過(guò)IBA和NAA適宜的濃度配比成功獲得了花紅生根苗.

    綜上所述,本研究以花紅成熟子葉作為外植體,接種于含有1.0 mg/L TDZ和0.05 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中,可高效誘導(dǎo)出花紅不定芽.經(jīng)生根培養(yǎng)后可獲得完整再生植株,實(shí)現(xiàn)花紅再生體系的優(yōu)化.再生體系的建立為進(jìn)一步開展花紅的細(xì)胞工程及基因工程遺傳育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ).

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