貓傳染性腹膜炎病毒N蛋白的原核表達(dá)及多抗制備

牛 錚， 徐沙沙， 張靜怡， 張依玲， 闞子斐，張淑娟， 鄒 宏， 鄒卓嵐， 冉 玲， 宋振輝

1. 西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2. 西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 榮昌 402460

貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)可導(dǎo)致貓科動物傳染性腹膜炎(FIP)的發(fā)生，使貓科動物內(nèi)臟器官出現(xiàn)肉芽腫病變、腹腔出現(xiàn)大量腹水以及腹膜出現(xiàn)炎癥[1]．FIP的流行病學(xué)特點是傳染率和死亡率都比較高，感染途徑主要是口鼻，經(jīng)呼吸道、消化道或昆蟲媒介進(jìn)行傳播[2]．目前研究表明，貓傳染性腹膜炎病毒是因貓冠狀病毒發(fā)生突變而產(chǎn)生的[3]．貓冠狀病毒突變?yōu)樨垈魅拘愿鼓ぱ撞《竞?，在巨噬?xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，然后脫離腸道轉(zhuǎn)移至臟器或腹腔，從而引發(fā)傳染性腹膜炎[4]．迄今為止該病僅能做到在臨床上緩解輕微癥狀，延長患貓的壽命，但難以治愈[5]．目前使用常規(guī)疫苗和重組疫苗對貓傳染性腹膜炎進(jìn)行預(yù)防均沒有取得理想的效果．研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IPV的感染具有抗體依賴性增強(qiáng)現(xiàn)象[6]，而大部分貓體內(nèi)都存在貓冠狀病毒，如果接種強(qiáng)毒株反而會加劇貓傳染性腹膜炎的發(fā)作．

貓傳染性腹膜炎病毒主要編碼了刺突蛋白、膜蛋白、小包膜蛋白和核衣殼蛋白4種結(jié)構(gòu)蛋白[7]．研究表明，冠狀病毒的核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N蛋白)作為一個多功能蛋白，能包裝病毒的基因組形成核糖核蛋白復(fù)合體，與病毒的基因組之間存在相互作用，這對病毒粒子的裝配有重要影響[8]．同時，N蛋白作為免疫原性最強(qiáng)的蛋白，其對應(yīng)的抗體是最早產(chǎn)生的，所以N蛋白常被用來作為早期診斷的指標(biāo)[9]．本實驗在前人研究的基礎(chǔ)上，對FIPV的N基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，并以純化后的重組N蛋白作為抗原皮下免疫比利時兔，制備出了相應(yīng)的多克隆抗體．旨在為進(jìn)一步研究N蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，同時豐富FIPV檢測技術(shù)體系以及為FIP的進(jìn)一步研究和臨床治療奠定基礎(chǔ)．此外有研究表明，F(xiàn)IPV與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)有相近的抗原性，F(xiàn)IP病貓的血清和腹腔液中可檢出對TGEV的高價中和抗體[10]．FIPV N蛋白多抗的制備，也為進(jìn)一步研究FIPV與TGEV之間的關(guān)系提供了可能．

1 材料與方法

1.1 材 料

含F(xiàn)IPV病料收集自重慶市某動物醫(yī)院患病致死貓．經(jīng)基因測序鑒定后，放置于-80 ℃速凍保存?zhèn)溆茫?/p>

山羊抗鼠HRP-IgG，山羊抗兔HRP-IgG購自BBI公司，F(xiàn)IPV N蛋白鼠源單克隆抗體為實驗室保存；氯霉素，卡那霉素，DL 1 000 Marker，DL 5 000 Marker，DL 10 000 Marker，2×Taq Master Mix，PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit DNA購自O(shè)mega Bio-tek公司；Enhanced BCA Protein Assay Kit試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LB購自Biowest公司；蛋白純化試劑盒ProteinIso Ni-NTA Resin購自北京Transgen公司．

1.2 方 法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)FIPV轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)N基因的序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，并且在引物上增加限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位點，預(yù)計擴(kuò)增片段長度為967 bp，上下游引物信息見表1．引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成．

表1 引物擴(kuò)增序列

1.2.2 FIPV總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol試劑分別對因患FIPV而致死的貓肝臟、腎臟、胃、小腸等組織的總RNA進(jìn)行提取，采用核酸測定儀檢測總RNA的濃度和純度，以提取的FIPV總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT Master Kit試劑盒說明合成cDNA．

1.2.3N基因的克隆

以FIPV的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(12.5 μL)：2×Taq Master Mix 6.25 μL，上下游引物各0.5 μL，dH2O 4.25 μL，模板1 μL．PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min．

按照Omega Bio-tek的E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit DNA膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收，與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含16 μL IPTG(24 mg/mL)和38 μL X-GAL(20 mg/mL)的LB/Amp+瓊脂平板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)13 h，然后對陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定．

1.2.4 N蛋白的原核表達(dá)

將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-N，將pMD19-T-N和Pet-28a用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，構(gòu)建Pet-28a-N重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR、雙酶切驗證后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于LB(Kana+/Camr)的液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，測菌液OD600值為0.6～0.8，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，具體濃度及時間見表2，將菌液于4 ℃，7 500 r/min離心20 min，收集菌體，超聲波破碎，分別收集上清和沉淀，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測．檢測到目的蛋白后，再分別參照表2進(jìn)行時間和IPTG濃度的優(yōu)化．

表2 不同表達(dá)條件

1.2.5 N蛋白的純化及鑒定

采用鎳柱親和層析的方法對重組蛋白進(jìn)行純化．首先分別用15 mL包涵體洗涂液I-V重懸包涵體沉淀，4 ℃，7 000 r/min離心20 min后，在包涵體中加入30 mL(pH值為8.0)8 mol/L尿素使其變性溶解，靜置過夜；4 ℃，7 000 r/min離心20 min，收集上清，棄去沉淀，上清用0.45 μm濾器過濾．再參照ProteinIso Ni-NTA Resin 的具體步驟進(jìn)行蛋白純化，SDS-PAGE檢測最適純化結(jié)果，以最佳咪唑濃度對蛋白進(jìn)行純化．將純化的N蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定(一抗為FIPV N蛋白鼠源單克隆抗體，二抗為山羊抗鼠HRP-IgG抗體)．

1.2.6 多克隆抗體的制備、特異性鑒定

選擇2只健康的比利時雄兔在脊柱兩側(cè)皮下進(jìn)行多點注射免疫，采用1，15，30，45 d的免疫周期，免疫劑量為100 μg/kg．首次免疫周齡為12周齡，體質(zhì)量為2.5 kg．免疫30 d后耳緣靜脈采血2 mL，將裝有血液的EP管呈45～60度角于室溫放置1 h，4 ℃靜置過夜．用移液槍將析出的血清轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管內(nèi)，4 ℃，2 500 r/min離心30 min，分裝至PCR管內(nèi)，封口膜封口后-80 ℃保存?zhèn)溆茫庖吆?5 d于耳緣靜脈采血2 mL，步驟同上．

Western Blot鑒定多克隆抗體與重組N蛋白的反應(yīng)性．將制備的多克隆抗體用TBST按1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000的比例稀釋作為一抗．將山羊抗兔HRP-IgG用TBST按1∶5 000的比例稀釋作為二抗．

以實驗得到的多克隆抗體作為一抗對病死貓的低溫恒冷組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗以驗證其是否具有特異性，并以實驗室保存的FIPV鼠源單克隆抗體制備的免疫組化切片作為陽性對照．本實驗中，F(xiàn)IPV鼠源單克隆抗體使用山羊抗鼠HRP-IgG，制備的FIPV兔源多克隆抗體使用山羊抗兔HRP-IgG作為二抗，最后使用DAB顯色液進(jìn)行顯色、染色．

2 實驗結(jié)果

2.1 N基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

分別對病死貓肝臟、腎臟、胃、小腸等組織進(jìn)行檢測，電泳檢測顯示所有組織的PCR產(chǎn)物中均可見1條約967 bp特異性條帶(圖1a)．將該序列克隆至pMD19-T載體，測序結(jié)果顯示序列長度為3 659 bp(含限制性內(nèi)切酶識別序列和保護(hù)堿基)；通過ORF Finder預(yù)測N基因的開放閱讀框，可知該基因從第1個堿基到第1 131個堿基為一個完整的CDS，共編碼377個氨基酸，編碼的蛋白為N蛋白．將該CDS序列克隆至Pet-28a表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切鑒定，結(jié)果表明目的基因成功連接到Pet-28a載體上(圖1)．

M為DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；(a) N基因的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增(1為肝臟，2為腎臟，3為胃，4為小腸，5為陰性對照)；(b) N基因膠回收鑒定(1為回收N基因)；(c) pMD19-T-N質(zhì)粒的鑒定(1為陽性重組pMD19-T-N質(zhì)粒)；(d) pMD19-T-N質(zhì)粒的雙酶切鑒定(1為雙酶切重組質(zhì)粒pMD19-T-N)；(e) 重組Pet-28a-N質(zhì)粒的鑒定(1為陽性重組Pet-28a-N質(zhì)粒)；(f) Pet28a-N質(zhì)粒的雙酶切鑒定(1為雙酶切重組質(zhì)粒Pet-28a-N)．

2.2 N蛋白的表達(dá)形式及條件優(yōu)化

將陽性重組質(zhì)粒Pet-28a-N轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞后，在IPTG誘導(dǎo)下重組N蛋白以包涵體形式表達(dá)，蛋白的大小約為39 kD，與理論預(yù)測值相符(圖2)．對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，誘導(dǎo)溫度為16 ℃，誘導(dǎo)時間為8 h，IPTG濃度為1.0 mmol/L時為誘導(dǎo)最佳條件，目的蛋白表達(dá)效率最高(圖3和圖4)．

M為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)．1為Pet-28a-N誘導(dǎo)表達(dá)破碎后沉淀；2為Pet-28a-N未誘導(dǎo)上清；3為Pet-28a-N誘導(dǎo)表達(dá)破碎后上清；4為Pet-28a(空載體)誘導(dǎo)破碎后上清．

M為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)．1～9為Pet-28a-N誘導(dǎo)沉淀，其中1，4，7為由0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，分別在4，6，8 h下產(chǎn)生的沉淀；2，5，8為由0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，分別在4，6，8 h下產(chǎn)生的沉淀；3，6，9為由1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，分別在4，6，8 h下產(chǎn)生的沉淀．

M為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)．1～9為1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)Pet-28a-N產(chǎn)生的沉淀，其中1，2，3為在4 h下產(chǎn)生的沉淀；4，5，6為在6 h下產(chǎn)生的沉淀；7，8，9為8 h下產(chǎn)生的沉淀．

2.3 N蛋白的純化及鑒定

利用優(yōu)化的條件大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，參照Transgen的ProteinIso Ni-NTA Resin對變性后的N蛋白進(jìn)行4次純化，結(jié)果如圖5．洗脫后經(jīng)檢測在39 kD處有目的蛋白，與預(yù)期大小相符．將純化的N蛋白進(jìn)行Western-Blot鑒定，結(jié)果顯示，在39 kD處出現(xiàn)的目的條帶，與實際的N蛋白大小一致(圖6)．

M為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)．1為未純化的包涵體蛋白；2為第1次洗脫液；3為第2次洗脫液；4，5，6和7為洗滌液；8為第3次洗脫液；9為第4次洗脫液．

M為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)．1為過柱純化第1次洗脫液；2為過柱純化第2次洗脫液；3為切膠純化蛋白；4為空載體陰性對照．

2.4 包涵體總蛋白與N蛋白濃度的測定

參照Enhanced BCA Protein Assay Kit 試劑盒測包涵體總蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7．R2=0.998 4，表明擬合程度較好，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出包涵體總蛋白的濃度為1 320 μg/mL．

圖7 包涵體總蛋白濃度的測定

將處理后的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和包涵體沉淀按照2，4，6，8，10 μL的體積加入到SDS-PAGE膠的泳道內(nèi)，結(jié)果如圖8．利用Image J軟件，由灰度比和加樣體積定量出N蛋白濃度為950 μg/mL．

M為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)．1，2，3，4，5分別為2，4，6，8，10 μL BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白；6，7，8，9分別為2，4，6，8 μL待測重組N蛋白．

2.5 多克隆抗體特異性鑒定

以采取到的耳緣靜脈血清稀釋后作為一抗、山羊抗兔HRP-IgG稀釋后作為二抗，Western-Blot檢測多克隆抗體與重組N蛋白的反應(yīng)性，結(jié)果如圖9．不同稀釋度的多克隆抗體均能與重組N蛋白反應(yīng)，表明家兔3免后可產(chǎn)生有效抗體，與重組N蛋白反應(yīng)性良好，稀釋度可達(dá)1∶6 000．同時也發(fā)現(xiàn)，在將血清與TBST按照1∶4 000的比例進(jìn)行稀釋后，抗體的反應(yīng)性最好．

圖9 多克隆抗體特異性檢測

查閱DAB染液說明可知，經(jīng)過DAB染液染色后HRP二抗呈現(xiàn)棕色．將病變的肝臟組織免疫組化切片放在顯微鏡下觀察，可在病變組織表層黏膜處發(fā)現(xiàn)明顯陽性結(jié)果(圖10)，因此可證明本實驗制備的多克隆抗體能夠較好地與FIPV特異性結(jié)合．

圖10 多克隆抗體與FIPV特異性結(jié)合檢測

3 討 論

抗體作為一種研究工具，在目前的診斷、科研以及醫(yī)學(xué)治療等工作中起到舉足輕重的作用[11]．多克隆抗體是針對各種抗原決定簇產(chǎn)生的，其優(yōu)點是制備周期相對較短，并且應(yīng)用廣泛，包括抗原物質(zhì)的鑒別、定位、分析和純化，以及作為疾病的診斷、檢疫試劑和治療制劑等[12]．因此，在科研領(lǐng)域中多克隆抗體的使用相對較多．

本實驗選用N蛋白作為抗原物質(zhì)，主要是因為N蛋白作為FIPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的致病性密切相關(guān)，其不僅能與病毒基因組RNA結(jié)合，參與病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，而且具有較強(qiáng)的抗原性，誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答能促進(jìn)病毒清除[13]．用純化后的N蛋白作為抗原，能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體．而本研究選用雄性家兔作為免疫對象來制備多克隆抗體，原因是家兔是最適合制備抗體的動物，制備后可采集量較大，性格相對溫順，易于進(jìn)行免疫注射和采血操作[14]．選用雄性家兔不僅可避免雌性家兔因性周期帶來免疫系統(tǒng)的波動，也可避免因雌性家兔妊娠而使實驗被迫終止．

Pet系統(tǒng)載體是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)載體[15]．其宿主菌Rosetta為高效率表達(dá)菌株，生長速度快，可在短時間內(nèi)產(chǎn)出大量蛋白[16]．然而，表達(dá)速度過快容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)二硫鍵不能進(jìn)行正確的配對，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，從而形成不可溶形式的包涵體[17]．為了獲取天然有活性的目的蛋白，包涵體首先需要進(jìn)行純化，然后使用變性劑進(jìn)行變性溶解，再進(jìn)行復(fù)性操作，去除變性劑[18]．

實驗過程中通過蛋白切膠回收可以獲得純度較高的蛋白，但該方法操作略顯煩瑣，難以大批量純化蛋白，因此，重組N蛋白的純化與復(fù)性條件還需要進(jìn)一步的探索．含有目的蛋白的SDS-PAGE膠研磨后無需與免疫佐劑混合可直接免疫動物，原因是聚丙烯酰胺可以作為佐劑，提高抗原對機(jī)體的免疫原性，延緩抗原的釋放，延長抗原在體內(nèi)的停留時間，從而提高產(chǎn)生抗體的效價[19]．一般情況下，二免后即可耳緣靜脈采血分離出血清，通過Western-Blot與免疫組織化學(xué)方法檢測抗體的特異性并初步檢測其效價．

本實驗對FIPV的N基因進(jìn)行了克隆與原核表達(dá)，并利用純化后重組N蛋白免疫家兔制備出多克隆抗體，為下一步包被N蛋白建立間接ELISA檢測未知抗體或包被純化后的多克隆抗體建立雙夾心法ELISA檢測未知抗原打下堅實基礎(chǔ)．N基因的表達(dá)為進(jìn)一步研究N蛋白在感染過程中的作用機(jī)理及基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)．然而，重組N蛋白的純化與復(fù)性的條件、多克隆抗體純化方式的優(yōu)化還需要進(jìn)一步研究．