秭歸地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌及細(xì)菌多樣性研究

席 啦，向凡舒，張 彥，單春會，郭 壯

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽 441053；3.酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安琪紐特股份有限公司，湖北 宜昌 443003；4.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

鲊廣椒又稱鲊?yán)苯?，通常是以大米面或玉米面、新鮮紅辣椒碎和適量食鹽為主要原料，經(jīng)均勻混合后密封發(fā)酵制作而成的一種特色谷物發(fā)酵制品，烹飪后口感酸辣酥脆，在我國華中和西南地區(qū)有較廣的食用人群[1]。有研究指出，微生物類群對鲊廣椒的品質(zhì)形成具有較大的影響[2-3]，因而對鲊廣椒的微生物多樣性進(jìn)行解析則極為必要。王玉榮等[2]采用第二代高通量測序技術(shù)對湖北省宜昌市當(dāng)陽地區(qū)鲊廣椒中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和戊糖片球菌屬（Pediococcus）等乳酸菌為其中主要的優(yōu)勢菌屬，同時(shí)葛東穎等[4]研究發(fā)現(xiàn)，接種乳酸菌純種發(fā)酵后能明顯提升鲊廣椒的酸味品質(zhì)。值得一提的是，本研究團(tuán)隊(duì)前期從湖北省宜昌市當(dāng)陽地區(qū)和恩施土家族苗族自治州鲊廣椒中各分離鑒定出了一株乳酸桿菌新物種，分別命名為鲊廣椒乳酸桿菌（L.zhachilii）[5]和恩施乳酸桿菌（L.enshiensis）[6]。由此可見，鲊廣椒中可能蘊(yùn)含了較為豐富和獨(dú)特的乳酸菌菌群資源，加之不同地區(qū)的鲊廣椒其微生物類群可能存在一定的差異[7]，因而對不同地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌資源進(jìn)行收集，同時(shí)對其微生物類群進(jìn)行解析，對后續(xù)傳統(tǒng)谷物發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化推動具有一定的作用。

雖然發(fā)酵食品中蘊(yùn)含的部分微生物菌株無法在實(shí)驗(yàn)室條件下分離得到[8]，但傳統(tǒng)微生物學(xué)手段目前依舊是進(jìn)行微生物菌株分離和鑒定的常用方法。第二代測序技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)微生物學(xué)手段的不足，可對發(fā)酵食品中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的類群進(jìn)行全面解析，實(shí)現(xiàn)了不同樣品間微生物群落的平行比較[9]，該技術(shù)在辣椒醬[10]、泡菜[11]和腐乳[12]等發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)解析中有著廣泛的應(yīng)用。由此可見，將兩種技術(shù)相結(jié)合用于谷物發(fā)酵食品的微生物類群解析是較為可行的。

湖北省宜昌市秭歸縣位于長江上游末端，當(dāng)?shù)鼐用裰谱鞯镊噺V椒以玉米面為主，目前有關(guān)該地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌多樣性的研究還未見報(bào)道。本研究在采用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法對秭歸地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌進(jìn)行分離和鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用MiSeq高通量測序技術(shù)對其細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，以期為后續(xù)我國傳統(tǒng)谷物發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化推動提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲊廣椒樣品：納入本研究的14份鲊廣椒樣品均于2019年1月采集于湖北省宜昌市秭歸縣（E110°18'～111°0'，N30°38'～31°11'）的橘頌市場和山水龍城市場，所有樣品均以玉米為主要原料且在當(dāng)?shù)刂谱骱弯N售，發(fā)酵時(shí)間在25～30 d，分別編號為ZG1～ZG14。

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)吳江有限公司；DNeasy mericon Food Kit 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；10×Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix和DNA聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物338F/806R和M13F（-47）/M13R（-48）：天一輝遠(yuǎn)（武漢）生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）Top10：湖北文理學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所自制。

1.2 儀器與設(shè)備

DG250型厭氧工作站：英國DonWhitley公司；VeritiFAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；164-5050基礎(chǔ)電泳儀：美國BIO-RAD公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920型機(jī)架式服務(wù)器：美國DELL公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離鑒定

采用倍比稀釋涂布法對鲊廣椒中疑似乳酸菌菌株進(jìn)行初分離，繼而通過平板劃線法對分離株進(jìn)行純化，將過氧化氫酶陰性且革蘭氏陽性的菌株做成甘油管于-80 ℃保藏[4]。后續(xù)菌株DNA的提取、PCR擴(kuò)增、清潔和連接轉(zhuǎn)化均參照葛東穎等[4]的方法進(jìn)行操作。將擴(kuò)增成功的陽性克隆子送至天一輝遠(yuǎn)（武漢）生物科技有限公司進(jìn)行測序，返回的序列在美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行比對[13]，并完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3.2 宏基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序

鲊廣椒宏基因組DNA的提?。好糠蓣噺V椒樣品分別稱取2 g，參照基因組提取試劑盒說明方法提取總DNA。

PCR擴(kuò)增和高通量測序：使用添加barcode（核苷酸標(biāo)簽）的引物338F/806R對鲊廣椒中細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和程序均參照沈馨等[14]的方法。擴(kuò)增完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

反饋回的序列fq文件，參照沈馨等[14]的方法對序列進(jìn)行拼接和質(zhì)控，將質(zhì)控合格的fasta序列文件上傳至QIIME1分析平臺進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用兩步UCLUST法（100%和97%相似度）進(jìn)行序列歸并和構(gòu)建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[15]，刪除含有嵌合體序列的OTU[16]，選擇余下OTU代表性序列在SILVA[17]、RDP[18]和Greengenes[19]數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，并在門和屬水平注釋其分類學(xué)地位。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用R軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Excel2016繪制瀑布圖，使用Origin2017軟件繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鲊廣椒中乳酸菌分離鑒定及其多樣性分析

經(jīng)倍比稀釋后的樣品厭氧培養(yǎng)36～48 h后，在含有1.0% CaCO3的MRS固體平板中可觀察到已形成較多單菌落。本研究將菌落周圍存在透明圈、革蘭氏染色呈陽性和過氧化氫酶呈陰性的菌株初步判定為乳酸菌，共分離得到了43 株疑似乳酸菌菌株。部分分離株菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。

由圖1A可知，分離的部分菌株其菌落顏色均呈現(xiàn)白色或乳白色，表面光滑濕潤，且周圍均有透明圈形成。圖A1和A3中的菌落透明圈明顯要比圖A2中的透明圈透明程度更大，這表明不同菌株其產(chǎn)酸的能力有所差異。由圖1B可知，分離菌株的細(xì)胞形態(tài)均屬于短桿狀。各乳酸菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖1 部分疑似乳酸菌分離株的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of some suspected lactic acid bacteria strains

圖2 乳酸菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated lactic acid bacteria strains

由圖2可知，43株分離株中有27株鑒定為植物乳桿菌群，其中21株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），6株鑒定為副植物乳桿菌（L.paraplantarum），其余分離株中7株鑒定為消化乳桿菌（L.alimentarius），4株鑒定為屎腸球菌（Enterococcus faecium），2株鑒定為韓國乳桿菌（L.koreensis），各有1 株鑒定為短乳桿菌（L.brevis）、棒狀乳桿菌（L.coryniformis）和副干酪乳桿菌（L.paracasei）。由此可見，秭歸地區(qū)鲊廣椒中的乳酸菌分離株主要隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和屎腸球菌屬（Enterococcus）。分離株中各乳酸菌類群的構(gòu)成情況見圖3。

由圖3可知，L.plantarum是秭歸地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢乳酸菌，相對含量達(dá)60.47%；其次是L.alimentarius、E.faecium和L.koreensis，相對含量分別為16.28%、9.30%和4.65%；L.brevis、L.coryniformis、L.paraplantarum和L.paracasei相對含量最低，均為2.33%。在對湖北省荊州地區(qū)鲊廣椒乳酸菌類群進(jìn)行解析時(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)亦發(fā)現(xiàn)L.plantarum為其優(yōu)勢菌種[4]，這與本研究結(jié)果相同。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對谷物發(fā)酵食品的營養(yǎng)特性及抗?fàn)I養(yǎng)因子具有一定影響，ROGER T等[20]研究發(fā)現(xiàn)L.plantarumA6能夠降低發(fā)酵玉米糊中單寧成分的含量，而部分L.brevis則可以提高玉米糊中還原糖或淀粉的含量。

圖3 乳酸菌分離株中各類群的構(gòu)成情況Fig.3 Composition of various groups among lactic acid bacteria strains

2.2 基于門和屬水平的鲊廣椒細(xì)菌多樣性分析

在對鲊廣椒中乳酸菌分離鑒定的基礎(chǔ)上，本研究采用MiSeq高通量測序[21]進(jìn)一步對樣品中細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了解析。因有4個樣品微生物基因組提取質(zhì)量偏低，不符合建庫要求，故僅對10個樣品進(jìn)行了高通量測序。MiSeq結(jié)果顯示，10個鲊廣椒經(jīng)測序共得到了201 854條高質(zhì)量序列，每個樣品平均含有20 185條，有效序列經(jīng)97%相似度劃分后得到了6 404個OTU，每個樣品平均含有796個OTU。本研究將平均相對含量大于1.0%的門和屬定義為優(yōu)勢門和屬[22]，10 個鲊廣椒的優(yōu)勢門相對含量見圖4。

圖4 鲊廣椒中優(yōu)勢細(xì)菌門的相對含量Fig.4 Relative contents of dominant bacterial phyla in Zha-chili

由圖4可知，硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為鲊廣椒中的優(yōu)勢細(xì)菌門，其平均相對含量分別為70.02%和28.38%。在樣品ZG3和ZG9中Proteobacteria為相對含量最高的優(yōu)勢門，相對含量分別為86.13%和62.62%；而在其余8 個樣品中Firmicutes為相對含量最高的優(yōu)勢門，其相對含量范圍在51.64%～93.30%之間。由此可見，各鲊廣椒的細(xì)菌類群可能存在一定的差異，而這種差異在門水平上就有所體現(xiàn)。本研究進(jìn)一步對鲊廣椒中優(yōu)勢屬的相對含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖5。

圖5 鲊廣椒中優(yōu)勢細(xì)菌屬的相對含量Fig.5 Relative contents of dominant bacterial genera in Zha-chili

由圖5可知，隸屬于Firmicutes的Lactobacillus（47.85%）、Pediococcus（13.29%）和Weissella（1.81%），隸屬于Proteobacteria的假單胞菌屬（Pseudomonas）（21.31%）、沙雷菌屬（Serratia）（1.80%）和弓形桿菌屬（Arcobacter）（1.54%）為鲊廣椒中的優(yōu)勢屬，其中Lactobacillus、Pediococcus和Weissella均為乳酸菌，累計(jì)含量達(dá)到62.95%。由此可見，秭歸鲊廣椒中蘊(yùn)含著較為豐富的乳酸菌資源。由圖5亦可知，在樣品ZG3和ZG9中Pseudomonas的含量較高，分別為64.16%和53.37%。有大量研究表明Pseudomonas是發(fā)酵食品中的一類微生物污染物，防止Pseudomonas污染是提高食品安全性的重要方面[23-24]。除此之外，鲊廣椒中還含有少量的Serratia，WANG X Q等[25]的研究指出粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）會導(dǎo)致玉米作物患有輪紋斑病，因而鲊廣椒中含有少量Serratia的原因極有可能是農(nóng)戶制作鲊廣椒時(shí)使用的原料中夾雜了部分患有輪紋斑病的玉米作物。

2.3 基于OTU水平的鲊廣椒細(xì)菌多樣性分析

本研究將平均相對含量大于1.0%的OTU定義為優(yōu)勢OTU[22]，鲊廣椒中優(yōu)勢OTU的相對含量見圖6。

圖6 鲊廣椒中優(yōu)勢操作分類單元（OTU）的相對含量Fig.6 Relative contents of dominant operational taxonomic unit in Zha-chili

由圖6可知，測序的10個鲊廣椒中共含有13個優(yōu)勢OTU，平均累計(jì)相對含量達(dá)到55.10%，其中OTU531被鑒定為Pediococcus，平均相對含量為10.00%；OTU3158、OTU1003、OTU2354、OTU1872、OTU7027、OTU5238、OTU3756和OTU 3968均被鑒定為Lactobacillus，平均累計(jì)含量達(dá)30.25%；OTU5864和OTU6203被鑒定為Pseudomonas，平均累計(jì)含量為10.21%；OTU5546和OTU5683分別被鑒定為Weissella和Serratia，平均相對含量為3.56%和1.08%。綜上所述，各鲊廣椒樣品中乳酸菌的平均累計(jì)相對含量達(dá)到43.81%。由此可見，乳酸菌是鲊廣椒中的核心類群，但Pseudomonas在所有樣品中均占有一定的比例，這也進(jìn)一步說明在后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)業(yè)化推動進(jìn)程中積極開展具有優(yōu)良發(fā)酵特性乳酸菌的篩選，同時(shí)通過加強(qiáng)原料質(zhì)量的監(jiān)管和生產(chǎn)環(huán)境的改良，積極探索提升鲊廣椒食用安全品質(zhì)的路徑是極為必要的。

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)生物學(xué)方法和MiSeq高通量測序技術(shù)分別對秭歸鲊廣椒中乳酸菌和細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析。結(jié)果顯示，分離的乳酸菌菌株主要隸屬于Lactobacillu和Enterococcus，且L.plantarum為其中的優(yōu)勢菌種。高通量測序結(jié)果顯示，鲊廣椒中主要的細(xì)菌類群為隸屬于Firmicutes的Lactobacillus和Pediococcus以及隸屬于Proteobacteria的Pseudomonas。由此可見，秭歸鲊廣椒中蘊(yùn)含著較為豐富的乳酸菌資源，同時(shí)也含有一定量的條件致病菌。