基因編輯技術(shù)在家畜育種中的研究進(jìn)展

鄒菊紅，鄒劍偉，申玉建，馮雪萍，連子童，徐建建，宋 穎，胡 艷，張 瑜，黃艷娜，蔣欽楊

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004）

基因編輯技術(shù)是對(duì)生物體基因組 DNA 進(jìn)行特異性修飾的技術(shù)，其對(duì)DNA 的修飾有精確敲除、定點(diǎn)插入或誘導(dǎo)突變等，可以使被編輯的生物體性狀發(fā)生定向改變，并且能夠穩(wěn)定遺傳給后代，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、動(dòng)物遺傳育種、基因工程和植物分子育種等領(lǐng)域。鋅指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/相關(guān)蛋白 9（CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）是3 種 不同的基因編輯工具。在家畜遺傳育種方面，利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)基因編輯可以大大縮短家畜選育時(shí)間，加快育種進(jìn)程，還能對(duì)物種性狀改良進(jìn)而誘導(dǎo)突變理想性狀，且安全性有一定保障[1]。本文重點(diǎn)闡述3 種基因編輯技術(shù)在家畜育種中的應(yīng)用，對(duì)提高肉品質(zhì)、減少動(dòng)物過(guò)敏源產(chǎn)品、構(gòu)建疾病模型等方面的應(yīng)用研究進(jìn)展及前景作簡(jiǎn)要概述。

1 基因編輯技術(shù)概述

基因編輯技術(shù)是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA 進(jìn)行序列特異性修飾的工程技術(shù)，修飾包括對(duì)DNA 片段的插入、刪除、序列替換等。DNA 損傷的修復(fù)機(jī)制以及由此引起的DNA 結(jié)構(gòu)變化研究已經(jīng)成為有針對(duì)性的基因編輯的基礎(chǔ)[2]。鋅指核酸酶最早于1995 年被發(fā)現(xiàn)，它是一種細(xì)菌蛋白質(zhì)的DNA 切割域和最初在序列特異性真核轉(zhuǎn)錄因子中鑒定的鋅指雜交產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)鋅指蛋白特異性識(shí)別的DNA 序列進(jìn)行切割引入雙鏈斷裂（Double-Strand Break，DSB）[3]。2010 年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)來(lái)源于植物病原菌的轉(zhuǎn)錄激活子，其與限制性核酸內(nèi)切酶連接后被命名為TALENs。TALENs 使用和ZFNs 相同的細(xì)菌切割域，將其與植物病原菌產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子的DNA 識(shí)別模塊相結(jié)合來(lái)達(dá)到基因編輯的目的。1987 年，日本科學(xué)家首次在大腸桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，它是一種獲得性免疫的原核系統(tǒng)，由規(guī)律成簇間隔短回文序列和CRISPR 相關(guān)蛋白9（Cas9）組成。CRISPR技術(shù)通過(guò)DSB 修復(fù)途徑，堿基編輯，可以誘導(dǎo)基因的定性表達(dá)和定量改變。另外，基因編輯技術(shù)可以與其他技術(shù)（如體細(xì)胞克隆技術(shù)）結(jié)合，制備出具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值或醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值的基因編輯動(dòng)物，在動(dòng)物遺傳育種和人類疾病研究等領(lǐng)域具有廣闊的前景[4]。

2 基因編輯核酸酶的基因結(jié)構(gòu)和作用原理

2.1 ZFNs ZFNs 是鋅指蛋白（Zinc Finger Protein，ZFP）的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與FokI 核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域融合而形成[5]。ZFN 的序列特異性源自ZFP 區(qū)域，該區(qū)域包含3～6 個(gè)鋅指，每個(gè)鋅指可以識(shí)別1 個(gè)三聯(lián)體核苷酸代碼[6]。典型的鋅指由30 個(gè)氨基酸組成，形成2 個(gè)與α螺旋相對(duì)的反平行β折疊。該結(jié)構(gòu)域由結(jié)合鋅離子的2 個(gè)半胱氨酸和2 個(gè)組氨酸殘基來(lái)穩(wěn)定，形成致密的球形結(jié)構(gòu)域，可以將多個(gè)鋅指結(jié)合在一起形成更大的鋅指蛋白DNA 識(shí)別域，從而增加特異性和編輯效率。鋅指的特異性結(jié)合在很大程度上是獨(dú)立的，但是相鄰鋅指之間的某些接觸會(huì)改變堿基對(duì)的識(shí)別。非特異性核酸內(nèi)切酶FokI 必須二聚化形成功能性二聚體才能切割雙鏈DNA。

2.2 TALENs TALE（轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物）是由植物病原體自然產(chǎn)生的，例如革蘭氏陰性細(xì)菌黃單胞菌，可以感染胡椒、水稻、柑桔、棉花、番茄和大豆等多種植物[7-8]。TALE 與宿主DNA 結(jié)合，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子并激活有助于細(xì)菌感染的植物基因表達(dá)。單個(gè)TALE 重復(fù)序列可用于構(gòu)建識(shí)別哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源序列的DNA 結(jié)合域，通過(guò)將該結(jié)合域與II 型限制性核酸內(nèi)切酶FokI的非特異性切割結(jié)構(gòu)域相連接成TALEN 工具[9-14]。TALENs 由重復(fù)序列組成，每個(gè)重復(fù)序列由33～35 個(gè)氨基酸組成，在重復(fù)序列的12 和13 號(hào)位點(diǎn)氨基酸殘基具有多態(tài)性，稱為重復(fù)可變雙殘基（Repeat Variant Di-Residues，RVDs），負(fù)責(zé)識(shí)別特定核苷酸[15]。具有不同特異性的RVD 可以組裝成不同陣列，以靶向不同的DNA 序列。1 個(gè)RVD 特異性結(jié)合基因組DNA 的1 個(gè)核苷酸[16]，因此為蛋白質(zhì)與DNA 的相互作用建立了一對(duì)一關(guān)系。TALENs 可成功用于靶向內(nèi)源基因并有效切割哺乳動(dòng)物的DNA，已被用于敲除大鼠和斑馬魚(yú)以及牛、綿羊和豬的基因[17-19]，有效誘導(dǎo)不同物種的遺傳修飾[20]。

2.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng) CRISPR 和CRISPR 相關(guān)（Cas）蛋白是一種可遺傳的、適應(yīng)性強(qiáng)的原核生物（細(xì)菌和古細(xì)菌）的免疫系統(tǒng)，可為它們提供先前病毒感染的記憶力和防御再次感染的能力[21]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)有I 型、II 型、III 型、IV 型和V 型，在功能上又分為I 類和II 類[22]。Ⅰ類系統(tǒng)是有著多重亞基靶標(biāo)特異性CRISPR RNA 的效應(yīng)子復(fù)合物，包括I、III、IV 型，II類系統(tǒng)的效應(yīng)子復(fù)合物都是 Cas9，包括Ⅱ和Ⅴ型[23]。II 類（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)是 CRISPR/Cas 系統(tǒng)中最簡(jiǎn)單，也是現(xiàn)在研究最為深入、應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)[24]。通過(guò)開(kāi)發(fā)II 類CRISPR/Cas9 核酸酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因組編輯的常規(guī)實(shí)踐。如2013 年化膿性鏈球菌的II 型Cas 蛋白（SpCas9）用于RNA 引導(dǎo)的DNA 切割在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中首次使用，奠定了CRISPR/ Cas9 作為廣泛適用的基因組編輯工具的基礎(chǔ)[25]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)由Cas9核酸內(nèi)切酶和單鏈向?qū)NA（sgRNA）組成，sgRNA為20～30 bp 的核苷酸，其又包含靶標(biāo)特異性CRISPR RNA（crRNA）和輔助反式激活RNA（tracrRNA）2個(gè)成分[26-27]。crRNA 和tracrRNA 激活并引導(dǎo)Cas 蛋白結(jié)合病毒DNA 序列，隨后將其切割，使靶序列雙鏈斷裂（DSB）[28]。在切割目標(biāo)DNA 之前，Cas9 核酸酶與sgRNA 結(jié)合后會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化并定向到其目標(biāo)位點(diǎn)[29]。原間隔子相鄰基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）是CRISPR/Cas 系統(tǒng)必不可少的靶向組件，可以識(shí)別自我或者識(shí)別非自我系統(tǒng)，防止本身CRISPR 被靶向編輯。DSB 通過(guò)非同源末端連接（Nonhomologous End Joining，NHEJ）和同源重組（Homologous Recombination，HR）2 種修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。真核生物通過(guò)非同源末端連接修復(fù)，原核生物通過(guò)同源重組修復(fù)或其他修復(fù)途徑。非同源末端連接（NHEJ）是一種易于出錯(cuò)的修復(fù)機(jī)制，通常會(huì)導(dǎo)致片段插入或缺失，這就可以實(shí)現(xiàn)外源基因的定向敲入及敲除，但可能發(fā)生過(guò)早終止密碼子而導(dǎo)致基因功能喪失的情況[30]。而同源重組（HR）使用DNA供體模板的輔助重組來(lái)重建裂解的DNA，通過(guò)將供體模板轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中可以引入定義明確的突變[31]。

3 3 種基因編輯工具的異同

對(duì)人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以及3 種不同靶基因AAVS1、OCT4和PITX3的比較研究表明，TALEN 和ZFN 具有類似的靶向效率[32]。ZFN 與TALEN 的不同體現(xiàn)在3 個(gè)方面：一是TALEN 重復(fù)序列對(duì)目標(biāo)DNA 每個(gè)堿基對(duì)的識(shí)別是ZFN 的3～4 倍；二是TALEN 間隔子長(zhǎng)度（2 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的間隔）是可變的且不限于特定長(zhǎng)度，這會(huì)使TALEN 設(shè)計(jì)復(fù)雜化，并且相對(duì)于具有固定間隔子長(zhǎng)度的ZFN 核酸酶而言，可能導(dǎo)致更大的脫靶性；三是ZFN 需要有更高質(zhì)量、功能明確的模塊區(qū)域來(lái)組裝，這樣才能實(shí)現(xiàn)特定的基因靶向編輯[33]，而TALEN 各重復(fù)單元之間具有上下相關(guān)效應(yīng)，可以結(jié)合起來(lái)潛在地識(shí)別靶序列[34]，因此TALEN 在設(shè)計(jì)和組裝的難易程度、成本優(yōu)于ZFN。另外在一項(xiàng)研究展示了相對(duì)簡(jiǎn)單的TALEN 裝配，報(bào)告了18 740 種人類不同蛋白質(zhì)編碼基因的TALENs 文庫(kù)構(gòu)建方式[35]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)本質(zhì)上是RNA 引導(dǎo)的核酸酶。與ZFN、TALEN 通過(guò)蛋白質(zhì)-DNA 相互作用識(shí)別靶序列的核酸酶不同，CRISPR/Cas 核酸酶是通過(guò)RNA 和DNA 堿基配對(duì)來(lái)識(shí)別靶序列。CRISPR/Cas9 提供了一種更低成本、高效且易于使用的基因編輯系統(tǒng)。與TALENS 相比，CRISPR 采用易于傳遞的小蛋白質(zhì)，更快捷；與ZFN 相比，CRISPR 不需要成對(duì)的蛋白質(zhì)即可靶向特定基因座，更方便[36-37]。CRISPR/Cas 除了具有一次性促進(jìn)多重基因組修飾的能力外，與其他2 種DNA核酸酶相比設(shè)計(jì)要容易很多，使用CRISPR/Cas9 技術(shù)也為復(fù)雜的多基因疾病研究帶來(lái)新的可能與突破[38-39]。

4 基因編輯技術(shù)在家畜育種中的應(yīng)用

4.1 在疾病抵抗中的應(yīng)用 疾病是制約畜禽業(yè)發(fā)展的重要因素之一，嚴(yán)重影響畜禽的健康和養(yǎng)殖效益。CD163是富含清除劑受體的半胱氨酸超家族（SRCR）的成員，作為PRRSV 的結(jié)合受體，其第7 外顯子的SRCR5 結(jié)構(gòu)域是感染豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）病毒的關(guān)鍵。Burkard 等[40]使用CRISPR/Cas9 敲除CD163 受體而產(chǎn)生抗PRRS 病毒的豬。CD163-KO 豬不僅可以完全免受PRRS 感染的所有癥狀的侵害[41]，而且在農(nóng)業(yè)中使用經(jīng)基因編輯CD163-KO 豬可大大減少PRRS 相關(guān)的經(jīng)濟(jì)損失。牛結(jié)核病是牛感染分枝桿菌病原體引起的人畜共患病，Gao 等[42]使用Cas9 內(nèi)切酶將NRAMP1基因（對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體1 的感染具有天然抵抗力）插入?；蚪M，插入的NRAMP1 可以在?；蚪M中正確表達(dá)，進(jìn)而提高牛對(duì)分枝桿菌感染的抵抗力。Lillico 等[43]使用ZFN將來(lái)自疣豬的等位基因（與非洲豬瘟抵抗力相關(guān)）引入到普通豬中，使自然繁殖條件下產(chǎn)生的豬獲得了抵抗非洲豬瘟的能力。Liu 等[44]使用ZFN 將人類溶菌酶（Hlyz）基因插入到牛β-酪蛋白基因座中，從而使該牛的乳腺可以分泌人溶菌酶，該酶溶入牛的乳汁具有殺死金黃色葡萄球菌的能力。Lee 等[45]使用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)雞B 亞型腫瘤病毒基因(TVB)進(jìn)行編輯，使該基因受體中含有半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的位點(diǎn)產(chǎn)生終止密碼子而無(wú)法表達(dá)，從而使雞抵抗B 亞型白血病腫瘤病毒的感染，建立了抗B 亞型白血病的雞細(xì)胞系。

4.2 在性能提升上的應(yīng)用 肌肉生長(zhǎng)抑制素基因（Myostatin，MSTN）屬于生長(zhǎng)激素家族的負(fù)調(diào)節(jié)基因，其能抑制動(dòng)物肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的更新和增長(zhǎng)，從而抑制骨骼肌生長(zhǎng)。天然存在MSTN-KO 表型的有比利時(shí)藍(lán)牛、皮埃蒙特牛和特塞爾羊。Bi 等[46]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)結(jié)合Cre/LoxP 重組系統(tǒng)引入了精確突變編輯豬的MSTN基因，發(fā)現(xiàn)MSTN基因敲除的豬骨骼肌中成肌基因表達(dá)增加，骨骼肌發(fā)育增強(qiáng)，肌纖維數(shù)量提高，背最長(zhǎng)肌增大，背脂肪厚度減小，在一定條件下可以產(chǎn)更多的肉。目前在一些普通動(dòng)物（如兔、綿羊、山羊、牛）中也成功誘導(dǎo)了MSTN-KO 表型[47-48]，這些動(dòng)物在視覺(jué)上與野生型個(gè)體明顯不同的是肌肉量多，在肌肉的組織學(xué)比較中也可以觀察到[49-50]。脂肪酸脫氫酶1（Fat1）基因的翻譯產(chǎn)物是n-3 多不飽和脂肪酸脫氫酶，可以將多不飽和脂肪酸從n-6 轉(zhuǎn)化為n-3 形式，人體自身不能合成n-3 多不飽和脂肪酸，只能從食物中獲得。Tao 等[51]使用ZFN 技術(shù)將外源的Fat1基因成功插入到豬基因組中，該豬產(chǎn)生的肉與未被編輯過(guò)的豬相比有著更高的n-3 多不飽和脂肪酸。NANOS2是嚴(yán)格的雄性生殖特異性基因，與雄性生育能力有關(guān)，缺少該基因的公豬能夠健康生長(zhǎng)，但會(huì)表現(xiàn)出不育。利用CRISPR/Cas9 把豬攜帶的NANOS2基因敲除[52]，在被敲除NANOS2基因的普通公豬中植入來(lái)自其他優(yōu)良公豬的精原細(xì)胞（即產(chǎn)生精子的干細(xì)胞）后，普通公豬開(kāi)始產(chǎn)生優(yōu)良公豬的精子，這就使得具有遺傳優(yōu)勢(shì)的雄性生殖細(xì)胞在普通公豬體內(nèi)保留下來(lái)，有助于擴(kuò)大遺傳潛能，培育具備優(yōu)良性狀的牲畜。

4.3 在減少過(guò)敏源動(dòng)物產(chǎn)品上的應(yīng)用β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）基因編碼的乳清蛋白是山羊和其他反芻動(dòng)物乳中的主要乳清蛋白，在人乳中通常不存在，也是主要的人過(guò)敏源[53]。使用ZFN 技術(shù)剔除山羊BLG基因后，所產(chǎn)的牛奶蛋白質(zhì)含量明顯改變，乳清蛋白水平降低，酪蛋白水平升高[54]。因?yàn)槿狈?gòu)成羊奶主要致敏成分的BLG，羊奶也能被更多原本不能適應(yīng)羊奶的消費(fèi)者所接受。人乳鐵蛋白（hLF）是一種參與腸道鐵吸附和非特異性免疫反應(yīng)的糖蛋白。Cui 等[53]利用TALEN 技術(shù)把山羊BLG基因敲除，使該山羊作為乳腺生物反應(yīng)器，用于大規(guī)模生產(chǎn)hLF，他們利用經(jīng)TALEN 誘導(dǎo)的同源重組靶向載體，將hLF基因?qū)隑LG 位點(diǎn)，在山羊基因組中分別以13.6% 和6.09% 的頻率進(jìn)行了基因修飾，發(fā)現(xiàn)基因修飾后雜合子山羊乳中hLF 大量存在而B(niǎo)LG 含量較低，純合子山羊乳中完全不含BLG，并且山羊體細(xì)胞中TALEN 所介導(dǎo)的這種基因修飾可以通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)（SCNT）傳遞給后代。Oishi 等[54]使用CRISPR/Cas 系統(tǒng)敲除了產(chǎn)生卵清蛋白和卵黏蛋白的基因，旨在從蛋清中去除這兩種致敏成分，使得對(duì)雞蛋過(guò)敏的人可以放心吃雞蛋。

4.4 建立動(dòng)物模型 基因編輯技術(shù)大大提高了基因的突變效率，降低了基因修飾動(dòng)物模型的造模成本，利用基因編輯技術(shù)（或與其他技術(shù)相結(jié)合）可以成功建立人類疾病模型。外異蛋白A 受體（EDAR）調(diào)控著動(dòng)物毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，在小鼠中該基因突變導(dǎo)致毛發(fā)的缺失。Hao 等[55]使用CRISPR-Cas9 編輯生成了攜帶EDAR基因的突變體山羊，該品種山羊毛囊異常，頭頂沒(méi)有毛發(fā)，這項(xiàng)研究為EDAR基因相關(guān)表型和毛囊生長(zhǎng)與發(fā)育的未來(lái)研究提供了有價(jià)值的動(dòng)物模型。Lee 等[56]使用TALEN 技術(shù)編輯豬重組激活基因2（RAG2）產(chǎn)生了免疫缺陷型豬，該模型可用于醫(yī)學(xué)上對(duì)免疫缺陷疾病的研究。Kang 等[57]使用 CRISPR/Cas9 靶向編輯了豬腫瘤抑制基因RUNX3，RUNX3-KO 豬可作為模型為人類腫瘤疾病和癌癥的研究做貢獻(xiàn)。

5 總結(jié)與展望

基因編輯技術(shù)解決了家畜育種周期長(zhǎng)和遺傳資源少等問(wèn)題，大大縮短育種周期，降低育種成本并迅速增加了遺傳多樣性。當(dāng)前，已經(jīng)產(chǎn)生了許多基因編輯的家畜，如抗PRRS 的基因編輯豬、MSTN基因編輯的豬和對(duì)結(jié)核病不敏感的轉(zhuǎn)基因牛等。一些經(jīng)過(guò)基因編輯的家畜在瘦肉率、抗病性和其他有利性能方面也得到顯著提高。不同的基因編輯工具各有優(yōu)缺點(diǎn)，選擇特定系統(tǒng)似乎更多地取決于研究人員的專業(yè)知識(shí)，而不僅僅是這項(xiàng)技術(shù)本身。另外，當(dāng)前的基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9）還面臨著脫靶問(wèn)題，具有在基因組中誘導(dǎo)脫靶突變的潛力，這些突變也許不會(huì)對(duì)動(dòng)物個(gè)體健康產(chǎn)生影響，但仍然不可忽視。最近科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了新的CRISPR 相關(guān)蛋白，其中Cas12a 介導(dǎo)的基因編輯可以顯著降低脫靶率，這也是基因組編輯技術(shù)向前邁出的一步?？偠灾?，基因編輯是有價(jià)值的工具，這些技術(shù)的擴(kuò)展激發(fā)了研究者探索和改變家畜基因組的潛力，借助基因編輯工具，家畜育種將進(jìn)入新的發(fā)展機(jī)遇，并為人類提供更高質(zhì)量、更健康、更低成本的品種和更豐富的產(chǎn)品。