褪黑素緩解動物卵母細胞中細胞器氧化損傷的研究進展

田雅晴，王婉潔，郝海生，鄒惠影，龐云渭，趙學(xué)明，趙善江，朱化彬，杜衛(wèi)華

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團隊，北京 100193）

體外成熟卵母細胞的質(zhì)量及其發(fā)育潛力顯著低于體內(nèi)卵母細胞[1]，原因是在體外成熟過程中，卵母細胞易受培養(yǎng)液成分、代謝物、溫度、濕度、CO2濃度、氧濃度、光照等外界環(huán)境因素影響[2]；其中，代謝、光照、高氧濃度和體外操作等均能產(chǎn)生活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），而ROS 過量積累是卵母細胞損傷、成熟質(zhì)量差，甚至胚胎發(fā)育停滯的主要原因[3]。因此，多種抗氧化劑常被添加于卵母細胞的成熟和培養(yǎng)體系中以提高卵母細胞的成熟率和胚胎的體外發(fā)育率，以及胚胎質(zhì)量[4]。

褪黑素（Melatonin）是由哺乳動物和人類松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，是神經(jīng)-激素-免疫復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中的成員，參與疾病感染、炎癥、抗癌細胞增殖和自身免疫等過程[5]。同時，褪黑素也是一種強有力的內(nèi)源性抗氧化劑，能保護生物免受氧化應(yīng)激，提高機體的免疫力[6]和抗衰老[7]。對于卵母細胞，褪黑素不僅能通過顆粒細胞參與卵母細胞的成熟調(diào)控，而且能通過卵母細胞膜上的褪黑素受體（Melatonin Receptor 1a and 1b，MT1 和MT2）調(diào)控卵母細胞的成熟[8]。此外，褪黑素還能調(diào)控胞內(nèi)的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、紡錘體等細胞器的動態(tài)分布，改善其功能，最終促進卵母細胞的成熟及其胚胎的發(fā)育[9]。本文圍繞褪黑素的抗氧化特性，綜述其對卵母細胞及細胞器的保護作用和相關(guān)機制的研究進展，為其在動物胚胎生產(chǎn)和動物繁殖中更廣泛的應(yīng)用提供參考。

1 褪黑素概述

作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色氨酸）廣泛分布在大腦、視網(wǎng)膜和胃腸道等機體各部位[10-11]。除調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的功能外，褪黑素還具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和抗氧化等作用[12]。褪黑素是高親脂性和部分親水性的化合物，可穿過各種生理屏障[13]。褪黑素能有效清除ROS，增強細胞內(nèi)抗氧化酶活性，從而緩解過量ROS 對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 的損傷[14]，抵抗氧化應(yīng)激，維持細胞穩(wěn)態(tài)[15]。此外，褪黑素還可以通過其特異性受體MT1 和MT2 調(diào)節(jié)多種生理過程[16]。

2 褪黑素對卵母細胞及其細胞器的抗氧化保護

家畜卵母細胞的成熟對早期胚胎的發(fā)育至關(guān)重要，而卵母細胞的成熟包括核成熟和質(zhì)成熟，其中質(zhì)成熟分為細胞器成熟和分子成熟2 個方面。細胞器成熟是指在卵母細胞成熟過程中，細胞器的位置發(fā)生動態(tài)變化，如皮質(zhì)顆粒遷移到皮質(zhì)區(qū)、線粒體向胞質(zhì)中央?yún)^(qū)擴散、高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)消失等。褪黑素易于穿透細胞膜，分布在細胞器中清除ROS，發(fā)揮保護作用，并維護細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

2.1 褪黑素對卵母細胞的保護 已有研究表明，在牛、羊、豬和小鼠等動物的卵母細胞體外成熟過程中添加褪黑素會促進卵母細胞發(fā)育[17]，在小鼠卵母細胞的成熟液中添加10-6mol/L 褪黑素后卵母細胞的成熟率提高21%[18]。另外，褪黑素能保護卵母細胞免受有毒物質(zhì)產(chǎn)生的大量ROS 所造成的氧化損傷[19]。苯并芘（Benzo（a）perylene，BaP）是廣泛存在于環(huán)境中的致癌物，可使豬卵母細胞的體外成熟率從66%降低到23%，受精率從62%降低到27%；體外成熟液中添加褪黑素后，卵母細胞的成熟率和受精率分別提高到56%和47%，有效改善了暴露在BaP 環(huán)境中豬卵母細胞的質(zhì)量[20]。另外，褪黑素可清除豬卵母細胞衰老過程中產(chǎn)生的ROS，抑制促凋亡基因BAX和BAD的表達，減少卵母細胞凋亡，改善其質(zhì)量[21]。

2.2 褪黑素對線粒體的保護 線粒體是細胞中合成三磷酸腺苷（Adenosine Triphophate，ATP）的細胞器，參與細胞分裂、分化、凋亡等活動[22]。線粒體的分布、膜電位（Mitochondrial Membrane Potential，MMP）及其DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)是判斷線粒體功能和卵母細胞質(zhì)量的重要指標(biāo)。卵母細胞階段，早期的線粒體為圓形或橢圓形，主要分布于皮質(zhì)區(qū)；卵母細胞成熟后，線粒體向胞質(zhì)中心擴散，均勻分布于核周圍。

在卵母細胞中，線粒體內(nèi)的褪黑素濃度最高，有維持線粒體正常功能的作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能使牛卵母細胞中線粒體的正常分布率提高10%，mtDNA拷貝數(shù)增加，線粒體活性增強[24]。魚藤酮（Rotenone）是一種廣泛應(yīng)用的農(nóng)業(yè)殺蟲劑，可誘導(dǎo)線粒體毒性，進而破壞生殖系統(tǒng)，影響卵母細胞成熟、排卵和受精；而褪黑素不僅可以增加線粒體MMP，促進ATP 的產(chǎn)生和降低ROS 水平，還可以提高線粒體發(fā)生基因沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent Information Regulator l，SIRT1）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorγCoacti vator-1α，PGC-1α）的表達，降低線粒體的氧化應(yīng)激和細胞凋亡率，最終消除魚藤酮誘導(dǎo)的線粒體功能異常、ATP 缺乏和胚胎發(fā)育障礙[25]。胞內(nèi)Ca2+含量是反映線粒體功能的重要指標(biāo)之一，MMP 和Ca2+的儲存與許多維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的線粒體過程密切相關(guān)，Ca2+含量過高會導(dǎo)致線粒體和細胞的損傷[26]。10-5mol/L 褪黑素處理可誘發(fā)人卵母細胞中Ca2+水平降低和MMP 升高，表明褪黑素對線粒體功能的保護作用[27]。豬卵母細胞成熟過程中褪黑素能逆轉(zhuǎn)黃曲霉素B 對mtDNA 復(fù)制和線粒體發(fā)生的抑制作用，進而恢復(fù)線粒體的正常功能和卵母細胞的正常成熟[28]。小鼠卵母細胞線粒體中合成的大量褪黑素通過提高mtDNA 拷貝數(shù)、MMP 值、線粒體正常分布率、ATP 合成和紡錘體的正常裝配來改善線粒體的功能，促進卵母細胞的體外成熟[29]。

2.3 褪黑素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保護 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞中重要的細胞器，包括滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[30]，前者負責(zé)Ca2+的儲存及調(diào)節(jié)、脂質(zhì)合成，后者負責(zé)蛋白質(zhì)的合成、折疊、修飾及轉(zhuǎn)運[31]。在卵母細胞成熟過程中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逐漸減少，成熟后完全消失，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布隨卵母細胞發(fā)育階段的不同而動態(tài)變化，在生發(fā)泡（Germinal Vesicle，GV）期卵母細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由微管和動力蛋白的作用均勻分布在細胞質(zhì)[32]；在第2 次減數(shù)分裂中期（Metaphase II，MII）期時，由微絲作用使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)延伸到整個細胞，但主要集中分布于皮質(zhì)區(qū)[33]。在脅迫條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)合成、運輸障礙或Ca2+的攝取/釋放紊亂時，其腔內(nèi)堆積的大量未折疊或錯誤折疊的蛋白將引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS），并誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response，UPR），導(dǎo)致卵母細胞老化、凋亡，降低動物繁殖力[34]。所以，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重新分布和結(jié)構(gòu)變化是卵母細胞胞質(zhì)成熟的標(biāo)志。

在體外培養(yǎng)過程中，多種因素都能影響卵母細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致ERS 和UPR 信號通路激活[35]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能促進牛卵母細胞成熟過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常分布，提高受精率和發(fā)育率[9]。另外，ERS 通常伴隨著其他應(yīng)激反應(yīng)，尤其是氧化應(yīng)激[36]。ERS 本身誘導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生，而ROS 也參與ERS 和UPR 信號激活[37]。豬卵母細胞內(nèi)ROS 增加會破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重新分布和Ca2+的動態(tài)平衡，影響卵母細胞的胞質(zhì)成熟[38]。在豬卵母細胞的體外成熟過程中，UPR基因的表達逐漸增強，激活UPR 信號通路；而褪黑素不僅通過調(diào)節(jié)UPR 信號通路來減輕ERS，促進豬卵母細胞成熟[39]，還可抑制ERS 標(biāo)志基因CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/Enhancer Binding Protein Homologous Protein，CHOP）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78，GRP78）的表達，緩解棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠顆粒細胞凋亡[40]。氧化應(yīng)激通過引起ERS 誘發(fā)人子宮內(nèi)膜異位癥患者中卵巢顆粒細胞的衰老，并造成不孕；而褪黑素處理能緩解顆粒細胞ERS、細胞衰老、MMP 和ATP 異常，可作為該不孕癥的輔助治療方法[41]。可見，褪黑素通過抑制ERS 來保護卵母細胞，減少細胞凋亡和死亡。

2.4 褪黑素對紡錘體的保護 紡錘體是由微管、著絲粒和染色體組成的細胞器，負責(zé)細胞分裂時染色體的準確分離[42]。在有絲分裂中，紡錘體由中心體成核的微管形成，而減數(shù)分裂中的紡錘體沒有中心體，因此卵母細胞中紡錘體的形成由著絲粒和微管組織中心主導(dǎo)[43]。紡錘體對卵母細胞染色體的排列、分離和極體的排出具有重要意義[44]，同時紡錘體出現(xiàn)是卵母細胞成熟的標(biāo)志[45]。

由脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）引起的氧化應(yīng)激使小鼠卵母細胞中乙?；⒐艿鞍椎乃斤@著降低，進而破壞動粒與微管的附著和紡錘體形成，誘發(fā)同源染色體排列和分離異常；而褪黑素能改善DON 誘發(fā)的各種異常表現(xiàn)，紡錘體正常形成[46]。廣泛存在于食物中的赭曲霉毒素（Ochratoxina，OTA）通過阻滯細胞分裂周期蛋白（Cell Division Cycle 2，CDC2）介導(dǎo)的細胞周期進程而影響卵母細胞極體的排出，同時通過降低絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）的表達而破壞紡錘體的形成；褪黑素處理后豬卵母細胞的紡錘體正常形成，細胞周期進程也恢復(fù)正常[47]。小鼠的重復(fù)超數(shù)排卵誘發(fā)卵母細胞的氧化應(yīng)激，影響紡錘體組裝，顯著降低成熟率；而褪黑素能有效改善卵母細胞質(zhì)量[48]。另外，褪黑素能緩解冷凍-解凍過程導(dǎo)致的小鼠卵母細胞中紡錘體形態(tài)異常，提高紡錘體組裝檢驗點相關(guān)基因的表達，例如單極紡錘體蛋白激酶1（Monopolar Spindle 1，MPS1）、苯并咪唑出芽抑制解除物蛋白1 相關(guān)激酶（Budding Uninhibited by Benzimidazoles 1 Related Protein Kinase，BUBR1）、有絲分裂阻滯缺陷蛋白1（Mitotic Arrest-Deficient Protein 1，MAD1）和MAD2，提高解凍后卵母細胞的體外成熟率[49]。再者，褪黑素通過SIRT2調(diào)控的H4K16 去乙酰化途徑改善豬老化卵母細胞中紡錘體和染色體的異常裝配，及異倍體后代的產(chǎn)生[47]。所以，褪黑素是保護紡錘體免受氧化應(yīng)激損傷的重要物質(zhì)。

2.5 褪黑素對皮質(zhì)顆粒分布的影響 皮質(zhì)顆粒是卵母細胞特有的細胞器，來源于高爾基體或滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[50]，圓形、外包質(zhì)膜，其中含多種酶和糖基化物質(zhì)，與防止多精受精有關(guān)[51]。GV 期的牛卵母細胞中，皮質(zhì)顆粒成簇分布在胞質(zhì)，在MII 期則遷移至皮質(zhì)區(qū)[52]。所以，皮質(zhì)顆粒的正常分布是卵母細胞成熟的特征，其異常分布會降低胞質(zhì)成熟的質(zhì)量，造成多精受精而導(dǎo)致流產(chǎn)。

皮質(zhì)顆粒遷移和分布依賴于微絲的結(jié)構(gòu)蛋白——肌動蛋白、肌球蛋白及微絲的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[53]。暴露于百草枯（Paraquat，PQ）的牛卵母細胞中，皮質(zhì)顆粒分布異常的比例增加，胞質(zhì)成熟質(zhì)量下降，導(dǎo)致受精時無法進行正常的皮質(zhì)顆粒胞吐，受精能力和胚胎發(fā)育能力降低；而褪黑素能夠有效改善皮質(zhì)顆粒的異常分布，提高卵母細胞的成熟率和胚胎發(fā)育能力[54]。老化的小鼠卵母細胞存在皮質(zhì)顆粒密度顯著減少、透明帶硬化程度增加和受精能力下降等問題，而褪黑素能夠顯著改善上述情況，同時降低胞內(nèi)ROS 水平，抑制細胞凋亡，提高其受精能力，延緩卵母細胞老化[55]；褪黑素也能夠顯著降低紡錘體的異常組裝和皮質(zhì)顆粒異常分布的老化牛卵母細胞的比例，改善卵母細胞質(zhì)量[56]。BaP 通過損傷減數(shù)分裂相關(guān)的細胞器如紡錘體的裝配、肌動蛋白的動力特性和線粒體的完整性等造成豬卵母細胞不能恢復(fù)減數(shù)分裂，同時引發(fā)皮質(zhì)顆粒和卵磷脂的異常分布，導(dǎo)致卵母細胞的受精率低下；而褪黑素能減輕BaP 帶來的負面影響，提高卵母細胞的體外成熟質(zhì)量，減輕環(huán)境對動物繁殖系統(tǒng)的毒害作用[20]。

3 小 結(jié)

綜上，褪黑素可減少氧化應(yīng)激對線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、紡錘體和皮質(zhì)顆粒等細胞器造成的損傷，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進動物卵母細胞的體外成熟和胚胎發(fā)育，為褪黑素在動物胚胎生產(chǎn)和家畜繁殖領(lǐng)域中更廣泛的應(yīng)用提供參考。