AGR2對毒胡蘿卜素作用下人肺癌NCI-H460細胞增殖及凋亡的影響*

林志國， 劉 佳， 杜 娟， 劉振艷， 彭 瑤， 皮秀杰， 王玉鳳， 戰(zhàn)文娜， 李德海， 劉 穎， 鄧志會△

(齊齊哈爾醫(yī)學院 1附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 2附屬第二醫(yī)院藥劑科, 3醫(yī)藥科學研究院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

Anterior gradient 2(AGR2)基因是一種具有進化保守性的基因，最先在非洲蟾蜍中發(fā)現(xiàn)，局部性表達在原腸胚形成晚期背外胚層前部[1]。人和小鼠的AGR2主要在內(nèi)胚層來源的器官組織中表達，如肺、氣管、胃、結腸、小腸和前列腺等[2]。根據(jù)序列同源比對，AGR2屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶家族的成員，該家族蛋白對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白中二硫鍵的正確連接具有重要作用[3]。研究表明，AGR2基因是原癌基因，在多種上皮腫瘤中高表達，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和結腸癌等，并與腫瘤的發(fā)生、惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移密切相關[4]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的細胞器，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊與聚集、細胞對應激的反應，同時可識別錯誤的蛋白折疊，通過蛋白酶體途徑將其降解而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)以及細胞正常功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是一些理化因素引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊障礙，造成未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的堆積，從而引發(fā)細胞內(nèi)一系列自我保護適應性反應[5]。目前研究表明，ERS在腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及凋亡中發(fā)揮著重要作用[6]。毒胡蘿卜素(thapsigargin)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣ATP酶結合，致使鈣不能通過鈣泵進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣儲量，從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能引起ERS，是一種常用的細胞ERS誘導劑[7]。本研究以肺癌細胞系NCI-H460為模型，通過毒胡蘿卜素誘導ERS，觀察AGR2對細胞增殖和凋亡的影響，探討AGR2在肺癌發(fā)生發(fā)展以及藥物抵抗等方面可能發(fā)揮的作用，為AGR2作為肺癌診療的分子靶點提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌細胞NCI-H460和人腎上皮細胞293T均購自國家實驗細胞資源共享服務平臺。RPMI-1640、DMEM和OPTI-MEM培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自Clark Bioscience；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒、質(zhì)粒小提和大提試劑盒購自天根生化科技有限公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)和毒胡蘿卜素購自Sigma；Annexin V-FITC熒光標記抗體購自BD Bio-science；抗AGR2小鼠單克隆抗體和HRP標記的羊抗鼠IgG購自Santa Cruz；轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)購自Polysciences；引物合成及質(zhì)粒測序由上海生工生物工程有限公司完成，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1shRNA慢病毒介導的AGR2基因沉默穩(wěn)定細胞系的建立 (1)靶向AGR2基因的shRNA慢病毒表達載體的構建：應用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)在線設計軟件(http://sirna.wi.mit.edu/)根據(jù)AGR2基因序列設計2組針對人AGR2基因的特異性shRNA序列以及對照shRNA(shControl)序列。shControl為5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3’；shAGR2(A)為5’-GCCGATATCACTGGAAGATAT-3’；shAGR2(B)為5’-CCTTGAGACTTGAAACCAGAA-3’。通過DNA連接酶將合成的雙鏈DNA連接至線性化載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stable 3感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR篩選出重組陽性克隆后進行測序鑒定。(2)shRNA慢病毒的包裝及篩選：以PEI為轉(zhuǎn)染試劑，將鑒定正確的慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)?；旌衔?psPAX2和pMD2.G)共轉(zhuǎn)染到293T細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染3 h后更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，收集含慢病毒顆粒的細胞上清液，0.45 μm濾器過濾，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。胰酶消化處于對?shù)生長期的NCI-H460細胞接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞貼壁后加入1 mL病毒液和介導慢病毒轉(zhuǎn)染的終濃度為8 mg/L的polybrene。病毒感染24 h后更換含2 mg/L嘌呤霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，進行陽性篩選，1周后得到穩(wěn)定傳代的細胞克隆。 (3)Western blot檢測穩(wěn)定細胞系中AGR2蛋白的表達：收集各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，提取細胞總蛋白，Bradford法進行蛋白質(zhì)定量，取30 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE，常規(guī)Western blot操作、ECL發(fā)光并于AI600多功能成像系統(tǒng)(GE Heathcare)中成像，并進行灰度值分析。以GAPDH作為內(nèi)參照，分析目標條帶的表達變化。

2.2集落形成實驗 取對數(shù)生長期的各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。每組取1.5×106個細胞接種于6 cm皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，分別更換含有1 μmol/L的毒胡蘿卜素藥物培養(yǎng)基作用24 h。0.25%胰蛋白酶消化各組加藥處理過的細胞，利用Cellometer Mini自動細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，以每孔500個的細胞數(shù)分別接種于6孔板中，每組細胞設置3個復孔。將6孔板置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。用PBS稀釋甲醇配制的0.5%結晶紫至0.1%，染色15 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，肉眼直接計數(shù)。

2.3流式細胞術(Annexin V-FITC/PI雙染法)檢測毒胡蘿卜素誘導的細胞凋亡 采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法進行流式細胞術檢測。取對數(shù)生長期的細胞以每孔3×105個細胞接種于6孔板中，待細胞80%融合時加入5 μmol/L的毒胡蘿卜素作用24 h，然后分別收集各組上清和0.25%胰酶消化后的各組細胞于離心管中。預冷的PBS充分洗滌收集的細胞(4 ℃、1 800×g，5 min)， 100 μL結合緩沖液(0.01 mol/L pH 7.4 HEPES、0.14 mol/L NaCl和2.5 mmol/L CaCl2)重懸細胞并使其濃度為1×109/L；向各個細胞懸液樣品中加入5 μL Annexin V-FITC和2 μL的PI(100 mg/L)溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min；每管樣品中加入 400 μL結合緩沖液，輕輕混勻后放置冰上，流式細胞儀分析，每個樣品檢測10 000個細胞。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間差異的比較進行單因素方差分析，并用Bonferroni校正的t檢驗進行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Western blot檢測AGR2蛋白的表達

收集篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，提取細胞總蛋白，Wes-tern blot檢測AGR2的蛋白表達，以目的蛋白AGR2與GAPDH條帶的灰度比值代表AGR2蛋白相對表達量。結果顯示，與shControl組細胞相比，shAGR2(A)和shAGR2(B)組基因沉默細胞中AGR2蛋白表達量明顯下調(diào)(P<0.01)，見圖1，表明AGR2基因沉默穩(wěn)定細胞系構建成功。

2 毒胡蘿卜素對AGR2基因沉默細胞增殖能力的影響

在未加藥處理時，與shControl對照細胞相比，2組AGR2基因沉默細胞的集落形成數(shù)沒有明顯的變化,見圖2A；而在毒胡蘿卜素作用24 h后，shAGR2(A)和shAGR2(B)組基因沉默細胞的集落形成數(shù)和shControl細胞相比明顯減少，見圖2B(P<0.05)。這些結果表明AGR2基因缺失不影響正常條件下NCI-H460細胞的增殖能力，但在毒胡蘿卜素作用下能夠顯著地降低細胞的增殖能力。

Figure 1. Establishment ofAGR2 gene konckdown cell line. Western blot was used to detect AGR2 expression in stable cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl group.

圖1AGR2基因沉默細胞系的建立

Figure 2. The effect ofAGR2 gene knockdown on proliferation ability of NCI-H460 cells detected by colony formation assay in the absence or presence of thapsigargin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖2AGR2基因缺失對NCI-H460細胞增殖能力的影響

3 流式細胞術檢測AGR2對毒胡蘿卜素誘導細胞凋亡的影響

在未加藥物處理時，各組細胞的凋亡率(Anne-xin V陽性率)很低，均在5%以內(nèi)，且各組間的差異無統(tǒng)計學顯著性,見圖3A；在毒胡蘿卜素作用各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系24 h后，shAGR2(A)和shAGR2(B)細胞凋亡率較shControl明顯增高(P<0.05)，見圖3B。這表明AGR2基因缺失使NCI-H460細胞對毒胡蘿卜素的作用更為敏感，凋亡率提高。

Figure 3. The effect ofAGR2 gene knockdown on apoptosis of NCI-H460 cells detected by flow cytometry in the absence or presence of thapsigargin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖3AGR2缺失對NCI-H460細胞凋亡的影響

討 論

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的的惡性腫瘤之一。發(fā)病率在中國呈上升和年輕化趨勢，其死亡率居各類腫瘤的第一位。然而，肺癌的發(fā)生及調(diào)控機制非常復雜，肺癌細胞易于增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等機制尚未闡明。本項目通過慢病毒介導的shRNA建立AGR2基因沉默穩(wěn)定細胞系，在毒胡蘿卜素誘導ERS后，我們發(fā)現(xiàn)AGR2能夠增強肺癌NCI-H460細胞的增殖能力，同時降低其誘導的細胞凋亡。這些結果表明在ERS條件下，AGR2具有促增殖以及抗凋亡能力，在肺癌的發(fā)生發(fā)展、藥物抵抗中可能發(fā)揮重要作用。

AGR2在非小細胞肺癌中高表達，特別是肺腺癌中高表達。Fritzsche等[8]研究顯示，AGR2在66.3%的非小細胞肺癌組織中高表達；Pizzi等[9]通過免疫組化研究表明，在人肺腺癌組織中有30%病例AGR2為中度表達，70%為高度表達；而在人肺鱗癌中55%病例不表達AGR2，33%為弱表達，12%為中度表達。前期研究還顯示肺腺癌病人血清AGR2的水平顯著高于非腫瘤對照人群，且血清AGR2水平增高與手術后復發(fā)和不良預后顯著相關[9]。我們檢測了5種人肺癌細胞系AGR2的表達情況，包括小細胞肺癌細胞NCI-H446以及非小細胞肺癌細胞H1299、A549(肺腺癌細胞)、NCI-H460(大細胞肺癌細胞)、NCI-H226(肺鱗癌細胞)，其中只有NCI-H460細胞中AGR2高表達(結果未顯示)。本研究以AGR2高表達的非小細胞肺癌細胞NCI-H460為模型，通過靶向AGR2基因的shRNA慢病毒表達載體的構建、病毒的包裝和篩選，建立AGR2基因沉默穩(wěn)定細胞系，與對照細胞系相比AGR2蛋白表達下降90%以上。為深入研究原癌基因AGR2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，將來還需要在其它高表達AGR2的肺癌細胞中進行驗證性研究。

AGR2基因作為一種原癌基因具有促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移以及增加細胞存活的能力，但分子機制不十分清楚。AGR2能夠通過調(diào)節(jié)組織蛋白酶B和D的表達促進胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。AGR2在乳腺癌細胞內(nèi)可調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1、雌激素受體和存活素的表達促進乳腺癌細胞的生長和存活[11]。Dong等[12]研究顯示AGR2通過影響Hippo通路YAP1在細胞核內(nèi)的定位調(diào)控雙調(diào)蛋白(amphiregulin，AREG)的表達，而AREG是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的配體，繼而激活AKT磷酸化促進肺癌NCI-H460細胞的增殖；同時發(fā)現(xiàn)AGR2與EGFR在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)相互結合，促進其成熟使之轉(zhuǎn)移到細胞膜上，調(diào)控EGFR的信號轉(zhuǎn)導[13]。研究還發(fā)現(xiàn)AGR2可以與低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)結合，AGR2表達增多可以增加HIF-1α的穩(wěn)定性而延遲其在蛋白酶體的降解，促進氯化鈷誘導的新霉素耐藥性，促進乳腺癌細胞的存活[14]。AGR2還參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發(fā)生，促進腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)移[15]。我們的研究結果顯示AGR2能夠促進毒胡蘿卜素作用下的肺癌細胞抗凋亡及增強存活的能力，具體的分子機制可能與上述提及的Hippo、EGFR-AKT及HIF-1α等通路相關。

研究表明，AGR2既分布在細胞內(nèi),又分布在細胞外。AGR2是一種分泌型蛋白，細胞外AGR2與細胞膜受體C4.4A相互作用[2]，AGR2-C4.4A單克隆抗體能夠降低胰腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，從而提高胰腺癌細胞異種移植小鼠的存活率[16]。最新研究結果顯示，細胞外AGR2與血管內(nèi)皮生長因子和成纖維細胞生長因子2結合，并促進這些因子的同二聚體形成而使其活性增加，AGR2單克隆抗體能夠降低內(nèi)皮細胞的遷移及成纖維細胞的纖維化[17]。AGR2也是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，其羧基端具有KTEL序列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)KDEL樣受體結合，使其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)并維持其穩(wěn)定[18]；在ERS條件下促進AGR2表達并參與胰腺癌的早期發(fā)生[19]。AGR2與ERS反應關鍵蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78相互作用，維持ERS反應通路的活化，增強細胞的存活能力[20]。我們的研究結果顯示AGR2可以促進ERS狀態(tài)下NCI-H460細胞的增殖以及抗凋亡作用。盡管這些結果不能說明AGR2發(fā)揮功能的具體途徑，但提示AGR2能夠在ERS狀態(tài)下促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的穩(wěn)定，有利于腫瘤細胞在復雜的生長微環(huán)境中生長以及在抗腫瘤藥物作用下的存活，進一步證實AGR2在肺癌發(fā)生發(fā)展及藥物抵抗中發(fā)揮的重要作用，為AGR2作為肺癌早期診斷、治療、藥物研發(fā)新的分子靶點提供理論基礎。