C型利鈉肽對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的影響

孫一丹，劉清揚(yáng)

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

0 引言

迄今為止，人們?cè)诓溉閯?dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)三種利鈉肽，包括心房利鈉肽(atrail natriuretic peptide，ANP)、腦利鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)及C型利鈉肽(C-type natriuretic peptide，CNP)。由利鈉肽及其受體構(gòu)成的3個(gè)內(nèi)源型配體系統(tǒng)稱之為利鈉肽家族。其中，ANP和BNP主要來源于心房和心室，在血管擴(kuò)張、調(diào)節(jié)體內(nèi)血壓、水及電解質(zhì)平衡以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用。CNP是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成一種新型的血管活動(dòng)調(diào)節(jié)肽，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及激素水平的作用。近年來人們發(fā)現(xiàn)，CNP在動(dòng)物生殖過程亦發(fā)揮著重要作用，CNP調(diào)控雌性哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的停滯和恢復(fù)功能，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)的技術(shù)體系。CNP能夠維持哺乳動(dòng)物性成熟前卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的阻滯，克服體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟不同步的挑戰(zhàn)，從而提高體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞的成熟率和后續(xù)胚胎的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，在CNP或NPR2突變小鼠中出現(xiàn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂過早恢復(fù)，證明CNP在維持雌性動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文主要對(duì)CNP及其受體結(jié)構(gòu)、CNP對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響及其調(diào)控機(jī)制、CNP在老齡雌性動(dòng)物IVM的應(yīng)用等進(jìn)行總結(jié)，旨在探究CNP改善老齡動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和受精能力的有效方法，為提高珍稀物種生育力的保存和高齡產(chǎn)婦人工輔助生殖提供理論支持。

1 C型利鈉肽

1.1 C型利鈉肽結(jié)構(gòu)

C型利鈉肽是由Tetsuji Sudoh于1990年首次在豬腦提取物中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)由22個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，廣泛存在于動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)中[1]，在保持心血管系統(tǒng)功能穩(wěn)定、調(diào)控細(xì)胞增殖及促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要作用[2]。過去的研究集中表明，CNP作為利鈉肽家族的第3個(gè)成員，其氨基酸序列及藥理學(xué)光譜與ANP、BNP具有明顯的相似性[3]；它們共有的核心結(jié)構(gòu)是通過二硫鍵連接形成的由17個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[4]，該結(jié)構(gòu)對(duì)CNP能夠刺激大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生cGMP有重要作用并對(duì)維持CNP生物活性具有重要意義[2]。

與ANP、BNP不同的是，CNP終止于第2個(gè)半胱氨酸殘基，缺乏羧基末端延伸[5]。現(xiàn)階段，多篇研究均表明CNP的氨基酸序列在不同物種中，如人、豬、小鼠等，具有高度保守性[6]。體內(nèi)CNP主要以CNP-22及CNP-53 2種形式存在。由126個(gè)氨基酸組成的CNP原經(jīng)剪切后產(chǎn)生由其氨基端23個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽和由其羧基端53個(gè)氨基酸組成的具有生物功能的多肽(CNP-53)，而CNP-53又可被細(xì)胞外酶分解為羧基端22個(gè)氨基酸組成的CNP-22[7]。CNP-22是其發(fā)揮生物學(xué)作用的主要形式[4]。此外，現(xiàn)有研究表明CNP預(yù)處理在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯及后續(xù)發(fā)育能力影響具有重要意義，CNP可作為生理性減數(shù)分裂抑制劑，通過與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮生理學(xué)作用，來維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。

1.2 C型利鈉肽受體結(jié)構(gòu)

目前，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)4種利鈉肽受體(Natriureticpeptidereceptor，NPR)，包括NPR1、NPR2、NPR3及新發(fā)現(xiàn)的NPR4，其中，CNP對(duì)NPR2的親和力明顯強(qiáng)于與NPR1及NPR3的親和力[4]。NPR2為鳥苷酸環(huán)化酶(Guanylyl cyclase，GC)偶聯(lián)受體，其配體結(jié)合區(qū)由大約450個(gè)氨基酸組成，其中Glu332對(duì)CNP結(jié)合特異性具有重要意義；其唯一的跨膜區(qū)域由20～25個(gè)氨基酸序列組成；胞內(nèi)結(jié)構(gòu)包括激酶同型區(qū)域(kinasehomologydomai，KHD)、卷曲螺旋狀的二聚體及鳥苷酸環(huán)化酶催化區(qū)域3個(gè)部分[6]。

1.3 C型利鈉肽信號(hào)傳導(dǎo)通路

CNP可與卵丘細(xì)胞中的NPR2受體特異性結(jié)合，使受體的 KHD構(gòu)象發(fā)生變化[2]，激活鳥苷酸環(huán)化酶，促使卵丘細(xì)胞產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸磷酸(Cyclic guanosine monophosphatec，cGMP)，上調(diào)cGMP濃度，cGMP通過縫隙連接進(jìn)入卵母細(xì)胞后抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)的活性來維持卵母細(xì)胞內(nèi)高水平的cAMP，從而來維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的阻滯直至排卵。

2 卵母細(xì)胞成熟及其調(diào)控機(jī)制

2.1 卵母細(xì)胞成熟

卵母細(xì)胞成熟包括細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟2個(gè)過程，二者均對(duì)受精過程及受精卵的成熟起著至關(guān)重要的作用。卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的同時(shí)，卵母細(xì)胞核也經(jīng)歷著成熟的過程。卵母細(xì)胞胞質(zhì)的成熟晚于核成熟，主要由于細(xì)胞核成熟時(shí)，胞質(zhì)發(fā)育所需必要的因子還未完全成熟。卵母細(xì)胞核成熟的標(biāo)志，通常是生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)和第一極體的排出[8]。停滯于第一次減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞，核呈泡狀，染色質(zhì)十分松散，又名生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)，當(dāng)其恢復(fù)減數(shù)分裂后，則不再形成rRNA，核膜破裂，核仁消散，細(xì)胞核更加致密，此過程稱為生發(fā)泡破裂(GVBD)，隨后第一極體排出[8]。卵母細(xì)胞進(jìn)入第二次減數(shù)分裂期且停滯在M Ⅱ期，即此時(shí)卵母細(xì)胞細(xì)胞核完全成熟。

卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的指標(biāo)較多，包括線粒體、皮質(zhì)顆粒的變化情況和GSH。未成熟卵子的線粒體在胞質(zhì)中多呈周邊分布，線粒體簇不大，在細(xì)胞逐漸成熟的階段中，線粒體從胞質(zhì)皮質(zhì)部遷移至胞質(zhì)內(nèi)部，數(shù)量增多[9]。在卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)過程中，線粒體著色加深，簇變大，在發(fā)育潛力較差的卵子中，仍呈周邊分布，而在發(fā)育能力良好的卵子中，則呈均勻分布[10]。胞質(zhì)成熟的重要標(biāo)志是線粒體重新分布與皮質(zhì)顆粒(cortical granules，CGs)分布。當(dāng)觀察到CGs位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中或在皮質(zhì)的中部或由中部向邊緣遷移，則胞質(zhì)沒有成熟或即將成熟，若位于皮質(zhì)下則說明細(xì)胞質(zhì)成熟[11]。研究表明，多種物質(zhì)能依靠提高谷胱甘肽(GSH)在細(xì)胞中的表達(dá)水平，來達(dá)到增強(qiáng)胚胎發(fā)育能力的目的。所以，谷胱甘肽同樣可視為卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的關(guān)鍵因素之一[12]。

2.2 卵母細(xì)胞成熟調(diào)控機(jī)制

卵母細(xì)胞從胎兒期至青春期一直阻滯在第一次減數(shù)分裂前期。物種不同，則卵母細(xì)胞阻滯時(shí)間也不相同，且多種細(xì)胞因子共同調(diào)控，才使少部分初級(jí)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂。卵母細(xì)胞長(zhǎng)期阻滯于第一次減數(shù)分裂前期的雙線期，是由細(xì)胞內(nèi)信使分子——環(huán)磷酸腺苷(cAMP)升高導(dǎo)致。目前人們普遍認(rèn)可，有兩條途徑可使cAMP升高：一是通過自身活化的 GPR3-Gs-ADCY 級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成環(huán)磷酸腺苷，使卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高；二是存在某種物質(zhì)能夠水解環(huán)磷酸腺苷，如PED3。蔡姣等[13]研究發(fā)現(xiàn)，作為組成MPF的亞基，Cyclin B的降解與CDK1的磷酸化均可降低MPF的活性，這也有助于在LH 峰的出現(xiàn)前，始終維持減數(shù)分裂阻滯于第一次減數(shù)分裂前期的雙線期。

體內(nèi)多種物質(zhì)均可誘導(dǎo)初級(jí)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)信號(hào)。下丘腦分泌的促黃體素(LH)對(duì)CNP/NPR2信號(hào)通路的改變、cGMP動(dòng)力學(xué)變化以及MAPK3/1/MPF信號(hào)，均對(duì)促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)起著重要意義。目前研究揭示，由LH誘導(dǎo)的EGF可通過多種途徑引起EGFR的反應(yīng)，不僅降低了CNP和NPR2的表達(dá)，而且誘導(dǎo)活化了MAPK3/1信號(hào)[13]。LH不僅可以通過降低顆粒細(xì)胞中的cGMP的水平，進(jìn)而使卵母細(xì)胞內(nèi)cGMP 水平也降低，而且還可誘導(dǎo)cAMP-PDE的活化來同樣降低cAMP的水平。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，正是因?yàn)榈退降腸AMP會(huì)活化MPF。此外，縫隙連接或由卵泡液通過的顆粒細(xì)胞可以傳導(dǎo)抑制減數(shù)分裂的信號(hào)，表明抑制細(xì)胞間的縫隙連接也可恢復(fù)減數(shù)分裂[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，由CNP抑制的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，肌苷單磷酸脫氫酶(inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH)抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)該過程并使其恢復(fù)[15]。除此之外，雌性減數(shù)分裂阻滯蛋白(meiosis arrest female 1，MARF1)、CRL4(Cullin ring-finger ubiquitin ligase 4)、Zar1(Zygote arrest-1)等物質(zhì)也在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制還需深入研究[16]。

3 C型利鈉肽對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的作用

CNP與其受體的結(jié)合對(duì)維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯具有重要作用。在胎兒時(shí)期，雌性哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞便開始進(jìn)行減數(shù)分裂，并阻滯于第一次減數(shù)分裂前期的雙線期長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月至幾十年，直至促性腺激素激活其受體引發(fā)一系列生理活動(dòng)來恢復(fù)第一次減數(shù)分裂。而在體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞的過程中，由于其脫離了體內(nèi)卵泡液環(huán)境，缺乏LH峰等促性腺激素的刺激，導(dǎo)致細(xì)胞核會(huì)迅速地自發(fā)啟動(dòng)減數(shù)分裂，而此時(shí)細(xì)胞質(zhì)不完全成熟，出現(xiàn)核質(zhì)成熟不同步的現(xiàn)象。許多研究表明，卵泡中顆粒細(xì)胞上表達(dá)CNP的信使RNA，而卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞上能夠檢測(cè)到CNP受體NPR2信使RNA的表達(dá)[17]，而在CNP或NPR2基因突變小鼠，卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂會(huì)提前恢復(fù)。

3.1 C型利鈉肽在哺乳動(dòng)物體內(nèi)維持減數(shù)分裂阻滯的機(jī)制

當(dāng)哺乳動(dòng)物性成熟后出現(xiàn)第一次LH峰時(shí)，顆粒細(xì)胞上CNP表達(dá)降低，同時(shí)受體NPR2活性迅速下降，cGMP濃度迅速降低，解除PDE3A抑制，使得卵母細(xì)胞中cAMP濃度下降，啟動(dòng)減數(shù)分裂并排卵。

夏國(guó)良等[17]通過原位雜交方式檢測(cè)了小鼠卵泡中CNP的基因表達(dá)在貼近卵泡壁的顆粒細(xì)胞上，而其鳥苷酸環(huán)化酶受體Npr2的基因主要表達(dá)在卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞上，卵母細(xì)胞上不表達(dá)CNP 或 NPR2 基因。CNP通過與其受體NPR2結(jié)合，具有促進(jìn)卵丘細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生的作用，這在倉鼠卵母細(xì)胞間情期維持較高的cGMP水平得到證實(shí)。在卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)之間的縫隙連接的輔助下，高濃度的cGMP進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)來抑制磷酸二酯酶3A(PDE3A)的活性[18]，從而達(dá)到維持卵母細(xì)胞內(nèi)高水平的cAMP的目的。而cAMP作為維持減數(shù)分裂雙線期的關(guān)鍵分子，其濃度的下降會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂恢復(fù)。研究表明，cAMP能夠激活蛋白激酶 A(Protein kinase A，PKA)，后者通過磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，Cdk1)使之與細(xì)胞周期蛋白(CyclinB1)結(jié)合形成無活性的復(fù)合體，即成熟促進(jìn)因子前體(pre-MPF)[19]。MPF活性受抑制，從而維持卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的阻滯。因此，CNP與NPR結(jié)合誘導(dǎo)cGMP產(chǎn)生來抑制卵母細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶水解cAMP，以通過cAMP-PKA信號(hào)使MPF亞基發(fā)生磷酸化，抑制其活性，從而阻滯減數(shù)分裂，這表明CNP是維持減數(shù)分裂阻滯的關(guān)鍵分子，能間接影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂。

3.2 C型利鈉肽在卵母細(xì)胞體外成熟中的應(yīng)用

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)是動(dòng)物克隆技術(shù)、醫(yī)學(xué)輔助生殖技術(shù)及農(nóng)業(yè)基因編輯育種等的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而現(xiàn)階段卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系尚不能完全模擬哺乳動(dòng)物體內(nèi)生理?xiàng)l件下卵子發(fā)生和卵泡發(fā)育過程，導(dǎo)致獲得的成熟卵母細(xì)胞數(shù)量少、質(zhì)量差，直接制約了生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)用途的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)試驗(yàn)。1935年，科學(xué)家們成功在家兔的未成熟卵母細(xì)胞上建立了卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)，但其培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟，體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞的質(zhì)量遠(yuǎn)不及體內(nèi)[20]。諸多研究證明，離開卵泡環(huán)境的卵母細(xì)胞能夠在體外自發(fā)成熟，引起核質(zhì)不同步成熟，表明體內(nèi)卵泡液中含有某種抑制卵母細(xì)胞核成熟的物質(zhì)來維持卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂阻滯，這種物質(zhì)被稱之為卵母細(xì)胞成熟抑制因子(OMI)[14]。OMI是一種由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到卵泡液中的環(huán)腺苷酸、卵巢固醇類物質(zhì)或熱穩(wěn)定性多肽[15]，而CNP是人們廣泛認(rèn)可的一種體內(nèi)OMI。

張通，張峻鴻等人的研究揭示，CNP在各種動(dòng)物，如牛[21]、山羊[22]、綿羊[23]等的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯均發(fā)揮重要作用。CNP能夠通過與NPR2受體結(jié)合活化下游cAMP-PKA信號(hào)通路，阻滯卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CNP預(yù)處理能有效將卵母細(xì)胞阻滯于GV期，抑制其減數(shù)分裂進(jìn)程，且能顯著提高胚胎的囊胚率[1]。因此，C型利鈉肽在體外環(huán)境下誘導(dǎo)卵母細(xì)胞核質(zhì)同步成熟，提高成熟卵母細(xì)胞的質(zhì)量及后續(xù)發(fā)育能力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。將其引入IVM體系中，可以有效維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，促進(jìn)核質(zhì)同步成熟，以達(dá)到提高IVM卵母細(xì)胞質(zhì)量的目的。

4 生殖衰老

細(xì)胞衰老是真核生物中普遍存在的一種現(xiàn)象，而卵母細(xì)胞衰老是影響雌性不孕、胚胎發(fā)育不良的主要原因之一。目前隨著社會(huì)發(fā)展，農(nóng)藥化學(xué)殘留、環(huán)境污染、醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)以及生活壓力等因素導(dǎo)致女性生殖系統(tǒng)的加速衰老及高齡女性生育現(xiàn)象的增多，使不孕癥、流產(chǎn)及卵巢功能早衰成為影響當(dāng)今社會(huì)人類繁衍與女性身心健康的主要疾病[24]。卵母細(xì)胞質(zhì)量下降是由衰老引起的母源性生育力下降的關(guān)鍵因素，近年研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞衰老的主要分子生物學(xué)機(jī)制有端?？s短、DNA 損傷修復(fù)、線粒體功能和細(xì)胞代謝紊亂等[25]。

衰老動(dòng)物卵母細(xì)胞質(zhì)量較青年動(dòng)物差這一現(xiàn)象已被諸多研究證實(shí)，其主要體現(xiàn)在其卵巢卵母細(xì)胞數(shù)量顯著減少、端?？s短、凝聚力喪失、減數(shù)分裂紡錘體異常和染色體錯(cuò)位等[20]，還會(huì)導(dǎo)致非整倍體增多和衰老雌性哺乳動(dòng)物不孕不育。因此，探究衰老卵母細(xì)胞染色體異常分離和錯(cuò)誤組裝紡錘體的發(fā)生機(jī)制，通過分子生物學(xué)的方法，探尋能夠有效遏制卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的手段，從而解決高齡產(chǎn)婦流產(chǎn)或畸形胚形成的這一醫(yī)學(xué)難題。目前有研究表明，C型利鈉肽能夠有效阻滯體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞核成熟并能通過某種信號(hào)通路促進(jìn)紡錘體組裝關(guān)鍵基因表達(dá)，來降低衰老卵母細(xì)胞紡錘體異常率，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。因此，揭示C型利鈉肽對(duì)衰老雌性哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和減數(shù)分裂紡錘體組裝的影響及其調(diào)控關(guān)系是本研究的主要目的。

5 結(jié)語

雌性哺乳動(dòng)物出生后卵母細(xì)胞數(shù)量不再增加，這些卵母細(xì)胞以未成熟的形式儲(chǔ)存在卵巢中，其結(jié)構(gòu)被稱為原始卵泡。性成熟后，卵母細(xì)胞才隨卵泡周期性發(fā)育而啟動(dòng)成熟分裂。大量研究發(fā)現(xiàn)CNP在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂阻滯與恢復(fù)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，已被廣泛用于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系。CNP可以維持哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯，使卵母細(xì)胞核成熟和胞質(zhì)成熟同步化，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞的成熟率和后期胚胎的發(fā)育能力。

本文對(duì)CNP及其受體結(jié)構(gòu)，CNP在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)揮的作用以及CNP在衰老動(dòng)物卵母細(xì)胞的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，分析CNP在卵母細(xì)胞成熟過程中的作用。旨在通過研究探討CNP提高衰老動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和受精能力的分子機(jī)制，為完善卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)體系，珍稀物種繁殖力保存和高齡產(chǎn)婦人工輔助生殖提供理論支持。