藏藥四味辣根菜湯散對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷炎癥因子的影響*

保善錄，李永芳，段雅彬，吉先才讓 ，曹志東，王津慧 △

1 青海省人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，青海 西寧 810001; 2青海大學(xué); 3 青海省藏醫(yī)院

藏藥四味辣根菜湯散系傳統(tǒng)藏成藥，藏藥名為索洛西湯，由高山辣根菜、紫草茸、狹葉紅景天及甘草組成?！端牟酷t(yī)典》記載其具有滋陰清熱和涼血止血的功效，主要用于治療發(fā)燒、氣短、目赤、唇舌及腮頰紫紺、喉堵聲不揚(yáng)、上體腔脹滿、呼吸喘急、咯吐血痰為主的胸腔內(nèi)惡血泛溢及心肺腫脹等癥［1-4］。青藏高原地區(qū)的人們由于地理環(huán)境、民俗民風(fēng)和膳食與平原地區(qū)不同，導(dǎo)致該地區(qū)心肌缺血疾病較平原地區(qū)多發(fā)。目前治療手段主要有冠脈內(nèi)溶栓術(shù)，冠脈內(nèi)球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)及體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)等。因缺血組織適應(yīng)性代償，冠狀動(dòng)脈經(jīng)外科手術(shù)再通后易造成再灌注損傷，會(huì)對(duì)組織造成缺血和再灌注雙重?fù)p傷。因此，尋找有效防治心肌缺血再灌注損傷、減少缺血發(fā)作、縮短冠脈再通時(shí)間、提高缺血再灌注心肌能量代謝的藥物迫在眉睫。本研究應(yīng)用現(xiàn)代藥理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，為藏藥四味辣根菜湯散的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組48 只 8 周齡 SPF 級(jí) Wistar 雄性大鼠，體質(zhì)量（240±20）g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（甘）2013-0002；每籠8 只飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；每日給足水和大鼠維持飼料；室溫（20±2）℃，光照明暗12 h 交替；適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天。隨機(jī)分為6 組：假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性丹參組及四味辣根菜湯散低、中、高劑量組。

1.2 藥物提取與給藥將四味辣根菜湯散（青海省藏醫(yī)院制劑科，散劑，批號(hào)：20130607）加水浸泡2 h，煎煮至沸騰后再煎30 min，過(guò)濾，加水重復(fù)上述過(guò)程2 次，合并2 次濾液，濃縮至50%濃度；丹參（毫州市遠(yuǎn)光中藥飲片廠，散劑，批號(hào)：20140701）水提液制備方法同四味辣根菜湯散；完成后4℃避光保存?zhèn)溆?。四味辣根菜湯散成人劑量為每? g/60 kg［即 0.2 g/（kg·d）］。低、中、高劑量等于成人劑量的5、10、15倍［即0.7、1.4、2.1 g/（kg·d）］，丹參粉成人每日 15 g/60 kg［即 0.25 g/（kg·d）］，大鼠灌胃量等于成人的7 倍［即1.75 g/（kg·d）］。假手術(shù)組和模型組灌胃等容積生理鹽水，劑量為1.4 g/（kg·d）。每只大鼠每日灌胃1 次，連續(xù) 10天。

1.3 儀器BL-420S 型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟公司）；HX-300S 型動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟）；DNW-960型酶標(biāo)分析儀（北京普朗有限公司）；UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；H-600IV 型透射電子顯微鏡（日本Hitach 公司）；自制三叉玻璃氣管插管和0.8 mm透明軟聚丙烯塑料管。

1.4 試劑白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β；批號(hào)：E-30418）、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6；批號(hào)：E-30644）、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α；批號(hào)：E-30633）、肌紅蛋白（myoglobin，Mb；批號(hào) ：E-30419）、超敏C 反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP；批號(hào)：E-3025）試劑盒均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（分裝型）。

1.5 模型制備1）大鼠術(shù)前禁食6 h，20%烏拉坦5 mL/kg對(duì)大鼠實(shí)施腹腔注射麻醉。仰臥位固定，用電腦及BL-420S 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)信號(hào)采集系統(tǒng)連接心電圖，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖［4-7］。2）分離出氣管，眼科剪倒T 剪開(kāi)氣管，自制三叉玻璃氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸機(jī)潮氣量和頻率與大鼠呼吸動(dòng)作一致。3）碘伏胸腹部消毒，胸骨左緣0.5 cm 處剪開(kāi)胸部皮膚，于2～4 肋間剪斷第3和第4 肋，鈍性分離肋間肌和胸膜，暴露心臟于視野，眼科鑷撕開(kāi)心包膜。穿5-0 號(hào)規(guī)格非吸收性縫合線從底部經(jīng)過(guò)左冠狀動(dòng)脈左前降支，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界處往下約1～2 cm處進(jìn)針，深1.0～1.5 mm，寬2～3 mm。適應(yīng)穩(wěn)定心率5 min，將一根直徑約0.8 mm，長(zhǎng)約1.5 cm 的透明軟聚丙烯塑料管置于結(jié)扎線與冠狀動(dòng)脈之間。貼緊并結(jié)扎縫合線，使透明軟聚丙烯塑料管壓迫冠狀動(dòng)脈造成冠脈閉塞，制作急性心肌缺血模型。4）肉眼觀察結(jié)扎部位以下心肌表面顏色由鮮紅變暗紅，心電圖QRS波群增高、增寬、ST段抬高為結(jié)扎成功表現(xiàn)［7］。5）缺血30 min 后用眼科剪剪斷透明軟聚丙烯塑料管及結(jié)扎線，形成再灌注狀態(tài)，以心臟表面顏色轉(zhuǎn)為鮮紅和抬高的ST段下降在1/2以上為再灌注成功標(biāo)志［8］，再灌注 90 min。6）假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)再灌注結(jié)束腹主動(dòng)脈取血5 mL以上，離心半徑 15 cm，4000 r/min 離心10 min，取上清液-80℃冰箱冷藏備用。用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定炎癥因子水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP及TNF-α含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，四味辣根菜湯散低、中、高劑量均能減少血清 IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP 及TNF-α含量（P＜0.05）；與陽(yáng)性丹參組比較，四味辣根菜湯散低劑量組血清IL-1β、IL-6、Mb含量升高（P＜0.01），中、高劑量組hs-CRP 及高劑量組TNF-α降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6及Mb、hs-CRP與TNF-α含量（） ng/L

注：*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與陽(yáng)性丹參組比較，P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性丹參組四味辣根菜湯散低劑量組四味辣根菜湯散中劑量組四味辣根菜湯散高劑量組TNF-α（ng/L）30.63±0.73*59.27±0.61 46.04±0.38*49.79±0.45*44.93±0.30*37.78±0.47*#鼠數(shù)8 8 8 8 8 8 IL-1β 2.77±0.11*8.89±0.20 3.58±0.08*4.63±0.11*#3.53±0.06*#3.26±0.04*#IL-6 16.43±0.09*26.14±0.15 14.05±0.13*18.38±0.19*#12.52±0.06*10.46±0.08*#Mb（ng/L）250.98±5.03*718.79±7.15 408.15±8.49*558.28±6.97*#355.34±7.22*#324.80±6.25*#hs-CRP（μg/L）0.60±0.01*3.09±0.03 1.29±0.06*1.75±0.09*0.93±0.01*#0.82±0.05*#

3 討論

心肌缺血再灌注損傷的原因較為復(fù)雜，目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)與再灌注后細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧自由基大量生成、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞/血小板之間的相互作用關(guān)系密切。IL-1β在炎癥級(jí)聯(lián)的上段，心肌缺血初期血清中有IL-1β表達(dá)［9］。本研究結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注模型組血清IL-1β含量高于假手術(shù)組，四味辣根菜湯散各藥物組中IL-1β表達(dá)低于模型組，表明四味辣根菜湯散阻礙cAMP升高，抑制IL-1β釋放，減輕心肌缺血再灌注損傷引起的炎癥反應(yīng)。血清IL-6 水平的變化與左冠狀動(dòng)脈阻塞引起的心肌梗死范圍關(guān)聯(lián)較大，更是后續(xù)嚴(yán)重并發(fā)癥的預(yù)測(cè)因子［9］。本研究模型組中IL-6 含量較高，說(shuō)明心肌缺血梗死后IL-6 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體成分“糖蛋白130”導(dǎo)致心肌細(xì)胞釋放IL-6增多。四味辣根菜湯散各劑量組血清IL-6 含量較模型組低，表明在心肌缺血再灌注損傷時(shí)四味辣根菜湯散通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)cAMP 濃度或腺苷和阿片受體延遲途徑，抑制心肌細(xì)胞對(duì)IL-6的合成和釋放。

急性心肌缺血再灌注損傷時(shí)，心肌中Mb 最先被釋放入血液中，1～4 h 血液中Mb 超出正常上限，因此測(cè)定血清Mb 可作為急性心肌梗死診斷的早期項(xiàng)目［10］。模型組Mb 濃度高于假手術(shù)組，四味辣根菜湯散各劑量組Mb 含量降低，說(shuō)明四味辣根菜湯散能抑制心肌缺血再灌注損傷Mb 釋放入血，降低心肌耗氧量，減少炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。hs-CRP 是全身性炎癥反應(yīng)急性期的非特異性標(biāo)志物之一，在心血管危險(xiǎn)事件中具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)性。模型組hs-CRP 含量高于假手術(shù)組，四味辣根菜湯散各劑量組hs-CRP 含量低于模型組，說(shuō)明四味辣根菜湯散能有效抑制由心肌缺血再灌注損傷引起的炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌和心肌細(xì)胞。TNF-α參與組織損傷引起的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)［11-12］。心肌缺血再灌注模型組大鼠血清中TNF-α含量高于假手術(shù)組，四味辣根菜湯散各劑量組大鼠血清TNF-α含量低于模型組，說(shuō)明四味辣根菜湯散能降低心肌成纖維細(xì)胞分泌TNF-α。

可見(jiàn)，四味辣根菜湯散能夠干預(yù)Akt/NF-κB信號(hào)途徑的激活，抑制心肌成纖維細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6、Mb、hs-CRP 及 TNF-α等炎癥因子，減輕心肌缺血再灌注過(guò)程中的旁分泌炎癥因子釋放，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有間接保護(hù)作用。