濃縮蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌檢測及控制措施研究進展

張晨星，崔麗佼，于有偉，張少穎，崔美林，王東芹，程曉雯

（山西師范大學食品科學學院，山西臨汾 041004）

我國是蘋果生產(chǎn)大國，蘋果產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的65%。目前，隨著我國經(jīng)濟的高速發(fā)展，貿(mào)易機會不斷涌現(xiàn)，我國濃縮蘋果汁的生產(chǎn)加工已形成一定規(guī)模。我國蘋果汁出口量巨大，且多為濃縮蘋果汁，但由于地理位置和種植環(huán)境的不同，各地蘋果汁的質量參差不齊，且大部分蘋果汁存在著酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌含量超標的問題。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，好氧或兼性厭氧，對人體并無較大傷害，但因耐熱耐酸的特性使其無法在果汁加工過程中被消滅。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌存在于果汁中，其本身代謝產(chǎn)生的物質（如愈創(chuàng)木酚等）會影響果汁風味，降低果汁的產(chǎn)品質量及縮短果汁的貯藏時間。因此在生產(chǎn)過程中利用現(xiàn)有手段對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌進行檢測及控制非常重要。

目前對于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌檢測手段的分析，大多未從生產(chǎn)線這一源頭入手。因此本文基于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對果汁行業(yè)的危害，探討了當前微生物檢測及控制的各類手段應用于果汁生產(chǎn)線上的可能性，并探究了在生產(chǎn)過程中，如何控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，以期能夠促進濃縮蘋果汁行業(yè)的健康、快速發(fā)展。

1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的特性及對果汁行業(yè)的危害

1.1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的特性

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，好氧或兼性厭氧，細胞直或近直的桿狀，pH2～6可生長，菌體大小為（2.9～4.3）μm×（0.6～0.8）μm，在不利于菌體生長的條件下會形成芽孢，大小為（1.5～1.8）μm×（0.9～1.0）μm，41 ℃培養(yǎng)1～2 d，培養(yǎng)基上會形成邊緣不整齊、表面光滑黏稠、不易挑起的乳白色圓形菌落[1-4]。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢在典型的巴氏殺菌條件下（92 ℃、10 s）仍能夠存活，細菌菌體在41～60 ℃、pH3.5～4.5可以很好地生長繁殖。

1.2 對果汁行業(yè)的危害

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌本身對果汁及人體安全沒有較大的影響，但其耐熱、耐酸的特點，使之在果汁加工過程中難以控制和除去。目前研究人員已經(jīng)在各種果汁和飲料中分離出酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，例如蘋果、柑橘、藍莓、芒果、百香果、梨、西紅柿、香蕉、杏、桃子、葡萄、番石榴、柚子和獼猴桃等果汁[5]。此外，果醬、調(diào)味品中也有發(fā)現(xiàn)[5]。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在代謝時會產(chǎn)酸，但不會影響果汁本身的pH，僅在瓶子底部看到一定的濁度[6]。但其菌體在代謝過程中會產(chǎn)生一些次級代謝產(chǎn)物，如愈創(chuàng)木酚（鄰甲氧基苯酚）、2,6-二溴苯酚以及2,6-二氯苯酚。愈創(chuàng)木酚具有煙熏味，會對果汁風味、品質造成嚴重影響，使果汁腐敗，且容易通過嗅覺檢測到[7]。因此，抑制蘋果汁中的嗜熱耐酸芽孢桿菌是目前亟需解決的重大問題。

果汁被酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌感染后，產(chǎn)品不一定會變質，但酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的濃度、儲存溫度、熱處理方式等因素會影響該菌的腐敗作用[4]。

2 蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測方法進展

基于目前對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究，出現(xiàn)了很多該菌的檢測方法，之外還有利用光譜、基因的各種快速檢測方法，這些方法不僅提高了檢測的速度，還增加了準確率。

2.1 常規(guī)檢測

常規(guī)檢測主要包括微生物的形態(tài)特征、生長環(huán)境及生理生化特征等的測定。目前使用的常規(guī)檢測方法是平板計數(shù)法，即通過提取果汁中的微生物進行平板培養(yǎng)后，觀察微生物形態(tài)特征以判斷是否為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。平板檢測法目前較為常用，但耗時長、工作量大，無法進行實時監(jiān)控，但可以檢測產(chǎn)品是否帶菌。

2.2 基因檢測法

目前16S rRNA是一種基于基因檢測的非?？焖偾异`敏度極高的檢測方法。Luo等[8]基于SHC的編碼基因（shc）建立了蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的Real-time PCR檢測體系，該方法在短時間內(nèi)即可實現(xiàn)對樣品中低濃度（＜10 cfu/mL）目標菌的檢測。還有學者利用RT-PCR檢測濃縮蘋果汁中的耐熱菌，在24 h得到檢測結果，達到了快速檢測的目的，但只能定性，不能定量[9]。張宇霞等[10]采用聚合酶鏈式反應（PCR）以及自動化核糖體基因分型RiboPrinter，對經(jīng)過分離、篩選和純化后的59株分離菌株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)脂環(huán)酸芽孢桿菌標準菌株基因組DNA進行PCR擴增時，擴增出目的條帶的最小模板量達到0.1 ng/mL。因此可以看出，應用基因檢測的方法可以快速準確地檢測出酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，但是僅僅適用于最終產(chǎn)品的檢測，無法應用于整條生產(chǎn)線。

2.3 儀器分析法

目前隨著科技的發(fā)展，越來越多的檢測儀器被開發(fā)出來，主要有高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）、氣相色譜-嗅覺測定（GC-O）、電子鼻技術和分光光度計法等。分光光度計法應用最普遍，但相比于其他方法準確性較差，且對于糖度較大的一些濃縮果汁檢測效果較差。

李二虎等[11]采用電子舌對7種市售果汁飲料以及接種脂環(huán)酸芽孢桿菌后的樣品進行測定，通過數(shù)據(jù)分析，可以將接種酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的果汁區(qū)分開。許燦等[12]利用電子鼻結合主成分分析，快速、準確地區(qū)分了正常產(chǎn)品與異常產(chǎn)品。Concina等[13]利用電子鼻檢測了軟飲料中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，進行早期診斷，該儀器能夠在極低的細菌數(shù)（Dozens/mL）下識別受污染的產(chǎn)品，具有極好的分類率（幾乎100%）。因此利用電子鼻、電子舌等技術來檢測其中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌及其產(chǎn)物是可行的。可見，采用現(xiàn)代檢測儀器可以快速準確地檢測出果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的污染，可以嘗試考慮將儀器與生產(chǎn)線結合，用于快速檢測、實時監(jiān)控生產(chǎn)過程中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的存在與污染。

2.4 代謝產(chǎn)物檢測法

研究報道，脂環(huán)酸芽孢桿菌主要的代謝產(chǎn)物是愈創(chuàng)木酚[5]，微量的愈創(chuàng)木酚即可帶來極不愉快的氣味。愈創(chuàng)木酚在H2O2和過氧化物酶的參與下可以轉化成褐色的四聚愈創(chuàng)木酚，通過測定反應混合液在470 nm下的吸光度變化，實現(xiàn)對愈創(chuàng)木酚的快速定性及定量檢測[14]。目前，已經(jīng)有企業(yè)研制出了商業(yè)化的愈創(chuàng)木酚檢測試劑盒。高效液相色譜法和GC-MS法是愈創(chuàng)木酚檢測中比較常用的方法[5]。劉新梅等[15]采用氣質聯(lián)用法（GC-MS/MS）和顯色法對愈創(chuàng)木酚含量進行測定，發(fā)現(xiàn)兩種方法均可用于快速檢測酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。但是代謝產(chǎn)物檢測的方法，只能用于加工完成的產(chǎn)品及其貯藏過程中的檢測，不能用于整條生產(chǎn)線的檢測。

2.5 酶聯(lián)免疫

通過抗原與抗體之間的特異性結合反應來確定某種物質的方法被稱為酶聯(lián)免疫法，這種方法簡單、快速、靈敏度高、特異性強，目前已被廣泛地用于食品中有害微生物的檢測。Li等[16]通過采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測濃縮蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)采用葡萄球菌蛋白可以檢測出最低濃度為105cfu/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。Li等[17]還采用了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)最低檢測限為5×103cfu/mL。酶聯(lián)免疫的方法可以快速高效地檢測出濃縮蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，但成本高、操作繁瑣，應用于生產(chǎn)線難度大，但可以用于產(chǎn)品的快速檢測。

目前，隨著科技的發(fā)展，大多數(shù)檢測手段的靈敏度和效率均不斷提高，但是針對整條生產(chǎn)線酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測手段還未有提出，因此如何將各種手段聯(lián)用，實時監(jiān)控整條生產(chǎn)線上的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌還有待于進一步的研究。

3 蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制措施

傳統(tǒng)的巴氏殺菌無法徹底將果汁及生產(chǎn)線上的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌殺滅，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢也極難消滅，芽孢會對生產(chǎn)用的蘋果及生產(chǎn)出的蘋果汁產(chǎn)生污染。因此在快速準確的檢測方法的基礎上，更需要研究出高效且對原材料及產(chǎn)品不會造成太大營養(yǎng)損失的控制措施。

3.1 物理措施

3.1.1 加熱處理

巴氏殺菌是應用于飲料產(chǎn)品殺菌的主要措施，同時也是控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的主要方法，但酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有獨特的耐熱性，其芽孢經(jīng)巴氏殺菌約92 ℃、10 s處理仍能存活。Vieira等[18]發(fā)現(xiàn)使用HTST（高溫短時殺菌）在115 ℃條件下處理8 s，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢數(shù)量減少了105cfu/mL。Lopez等[19]利用時間溫度積分儀，模擬工業(yè)加熱過程，將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢置于其中，迅速升溫至93 ℃，保持2 min，發(fā)現(xiàn)在緩沖液中芽孢數(shù)下降約102cfu/mL，在果汁中芽孢數(shù)下降約10 cfu/mL。但對果汁產(chǎn)品進行熱處理會導致果汁產(chǎn)品風味物質及營養(yǎng)成分損失、感官品質下降等問題。

3.1.2 超高壓處理

利用高壓滅菌是對無需加熱食品研發(fā)出的一種新型保鮮技術，通過高壓使微生物中的蛋白質、核酸變性，從而達到殺菌的目的。普通的高壓處理僅能殺滅酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體，對芽孢的殺滅效果較差[20]。Bevilacqua等[21]研究發(fā)現(xiàn)，50～170 MPa的高壓對脂環(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)菌體和芽孢的抑制效果均不顯著；而超高壓技術最高壓強可達400 MPa，可以在常溫甚至低溫下起到殺菌作用[22]。Roig等[23]使用300 MPa的壓強處理酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢，使芽孢數(shù)下降了105cfu/mL?？梢钥闯龀邏簩ρ挎吆途w的殺菌效果更加明顯，但是其滅菌效果會受到溫度、時間以及產(chǎn)品中糖和可溶性固形物的影響，因此如何控制各種因素，在保證滅菌效果的基礎上盡量不影響產(chǎn)品自身的理化性質是急需解決的一個問題。

3.1.3 紫外處理

紫外殺菌屬于冷殺菌技術，在殺菌過程中不需要加熱，因此對于果汁來說是一種非常好的殺菌方式，但紫外光譜的范圍為100～400 nm，對設備的要求比較高。Tremarin等[24]利用7種不同強度的紫外光分別處理酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體及芽孢，發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，菌體數(shù)量均呈線性遞減，說明利用紫外線進行殺菌可以破壞酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體和芽孢。但也有研究報道，紫外線對不同種類果汁中微生物的殺菌效果有很大區(qū)別，且對于一些產(chǎn)品因果汁內(nèi)含有的固體物質含量有差別，殺菌參數(shù)需要進行一定的調(diào)整[25]。因此，如何有效地利用紫外線殺滅蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌還需要進一步的研究。紫外殺菌受光譜的限制，對設備要求較高，成本也相應較高，因此對于中小型企業(yè)來說，實施紫外殺菌需要進一步探討。

3.1.4 歐姆加熱處理

歐姆加熱（ohmic heating）亦稱作電阻加熱、焦耳加熱、電力加熱等。20世紀初期，人們把鮮牛奶通過加有電壓的平行板，得到了“電力消毒牛奶”。歐姆加熱的基本原理是利用食品本身的介電性質，當電流通過時，引起食品溫度升高，從而達到直接均勻加熱殺菌的目的[26]。耿敬章等[27]對蘋果汁進行歐姆加熱處理，以嘗試消除蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，結果表明，在70 ℃、250 V、pH3.5的條件下，殺菌率高達90%以上，且歐姆加熱對蘋果汁的各項理化指標不會造成太大的影響，從而保證了產(chǎn)品的質量。但歐姆加熱對液體的黏度要求較高，黏度過小，顆粒會沉淀在加熱器底部，導致固液分離，受熱不均勻；黏度過大，固相與加熱器管壁以及不同固相之間的相互磨損都會破壞顆粒的結構完整，因此如何將歐姆加熱處理利用到生產(chǎn)線中還有待于進一步研究。

3.1.5 超聲波處理

超聲波是一種有效的滅菌方法，已成功用于廢水處理、飲用水消毒等領域，在液體食品滅菌中的應用也有較多的研究，如啤酒、橙汁、醬油等。相比于傳統(tǒng)高溫加熱殺菌工藝，超聲波殺菌既不改變食品的色、香、味，也不會破壞食品組分，而且超聲空化能提高細菌的凝聚作用，使細菌毒力喪失或死亡，從而達到殺菌的目的。但是超聲波殺菌的方法對于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌及其芽孢的抑制效果并不明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，用330 W、30 kHz的超聲波處理10 min后，濃度為105cfu/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢在數(shù)量上沒有產(chǎn)生明顯變化[28]。胡貽春[29]研究發(fā)現(xiàn)，用500 W超聲波處理蘋果汁30 min后，最高可殺死約80%的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，但會降低蘋果汁中的總糖含量；運用700 W超聲波處理蘋果汁60 min后，其透光度下降至無法達到質量標準（國標要求透光度不小于95%）。因此采用超聲波殺菌需在殺菌之后進行澄清處理，操作更加繁瑣；消毒不徹底，影響因素較多，一般只適用于液體或浸泡在液體里的物體，且處理量不能太大。對超聲波在食品非熱殺菌領域的應用研究還不夠系統(tǒng)和全面，對具體的食品成分以及最終導致的潛在安全性問題研究還不足，因此超聲滅菌在蘋果汁方面的應用還需要進一步的研究和討論。

3.1.6 其他措施

目前在食品行業(yè)中除了以上幾類物理殺菌方式之外，還有其他一些殺菌方式，如利用超濾系統(tǒng)過濾果汁進行除菌滅菌，可以有效去除水中的微粒、膠體、熱源以及各種有機物質，與傳統(tǒng)的分離技術相比，超濾處理工藝是在常溫下進行，適合對藥物、酶、果汁等進行分離，且處理過程中不需要加熱和添加化學試劑，不會產(chǎn)生污染，操作簡單。章樟紅等[30]采用孔徑為0.1 μm的鈦合金膜超濾系統(tǒng)過濾除菌，效果基本達到商品果汁的衛(wèi)生安全要求。微波殺蟲滅菌是使食品中的微生物同時受到微波熱效應與非熱效應的共同作用，使其體內(nèi)蛋白質和生理活性物質發(fā)生變異，而導致微生物體生長發(fā)育延緩和死亡，達到食品滅菌、保鮮的目的；具有時間短、速度快、營養(yǎng)成分和風味損失少等特點。但這些措施對于設備要求很高，對中小型企業(yè)來說想要實現(xiàn)大規(guī)模處理比較困難，因此如何能夠有效地利用這些措施抑制蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌還需要進一步的研究探討。

3.2 化學措施

3.2.1 防腐劑

目前在食品中常用的防腐劑主要有苯甲酸及苯甲酸鹽、山梨酸及山梨酸鹽、脫氫乙酸及鈉鹽類、雙乙酸鈉、乳酸鈉等。Cai等[31]對多種防腐劑進行研究，發(fā)現(xiàn)只有脫氫乙酸、肉桂酸及ε-聚賴氨酸可以有效抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長及因其次級代謝產(chǎn)生的愈創(chuàng)木酚，增加270 mg/L脫氫乙酸、108 mg/L肉桂酸、100 mg/Lε-聚賴氨酸，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌數(shù)量分別減少了3.43、3.17、4.78 cfu/mL，且貯藏14 d后未檢測到愈創(chuàng)木酚。Kawase等[32]在研究中發(fā)現(xiàn)，在果汁中添加用超臨界技術處理過的苯甲酸微粒，發(fā)現(xiàn)其對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢殺滅效果遠大于未經(jīng)處理的苯甲酸鈉和苯甲酸顆粒，但此方法較費時，不適合工廠加工使用。目前消費者對食品防腐劑這一類物質認可度不高，如何開發(fā)出讓消費者接受且對食品本身及其營養(yǎng)物質沒有影響或影響不大的新型防腐劑是目前研究的熱點。

3.2.2 氯及其化合物

氯氣與水反應生成次氯酸，次氯酸具有強氧化性。除了氯氣之外，氯的各種化合物也同樣具有殺菌效果，亞氯酸可以有效抑制沙門氏菌與李斯特菌等食源性病原菌的生長[33]。Lee等[34]在研究中發(fā)現(xiàn)，通過控制二氧化氯的流速對蘋果表面的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢處理后進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)芽孢暴露在高、中流速情況下，其數(shù)量降低到無法檢測的水平，暴露在低速釋放情況1、2、3 h后，芽孢數(shù)量分別減少102.7、103.7、104.5cfu/mL。之后Lee等[35]將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢接種于蘋果表面，使用2.68×10-4mg/L濃度的亞氯酸處理20 min后，蘋果表面的芽孢數(shù)下降至102cfu/mL。但是由于亞氯酸很不穩(wěn)定，室溫下極易分解，產(chǎn)生氯氣、二氧化氯和水，對人體有害，所以導致其應用范圍受到限制。因此利用氯及其化合物可以有效抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的生長，但吸入過量的氯氣對人體健康有極大的影響。所以如何通過氯及其化合物抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，同時對人體不會造成傷害是食品行業(yè)需要進一步研究的問題。

3.2.3 臭氧

臭氧是一種強氧化劑，能夠破壞微生物的膜結構，作用于蛋白和脂多糖，改變細胞的通透性，從而導致細菌死亡[14]。臭氧具有殺菌作用強、不存死角、無殘留和無污染的優(yōu)點，廣泛地應用于食品及制藥中。臭氧雖然無毒無害，但要求被處理環(huán)境的相對濕度達到60%以上，才能保證良好的消毒效果；當臭氧濃度達到一定量時，會對人體呼吸系統(tǒng)等造成一系列傷害；且臭氧發(fā)生器大多使用高頻高壓供電，因此對于操作人員有嚴格的要求。可見，如果想在生產(chǎn)線上使用臭氧滅菌，必須對操作人員進行培訓，且在產(chǎn)品的后續(xù)加工過程中采取一定的脫氧措施，以脫去產(chǎn)品內(nèi)的臭氧，否則臭氧的強氧化性可能會引起產(chǎn)品內(nèi)營養(yǎng)成分的氧化及口感的劣變。

3.2.4 天然化合物

目前廣大消費者對于食品安全問題越來越重視，采用各類食品添加劑來抑制食品中的有害微生物逐漸不被廣大群眾所接受，在這一背景下，科研人員逐漸轉向開發(fā)天然化合物及其提取物來抑制食品中的有害微生物。

（1）香料提取物

科研人員發(fā)現(xiàn)，我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｓ玫亩囝愊懔系奶崛∥镉休^好的殺菌作用，科研人員開始將香料提取物應用于食品保鮮的效果研究。Piskernik等[36]分別將兩種迷迭香的萃取物添加于含有105cfu/mL酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的蘋果汁中，8 h后，芽孢數(shù)量分別下降100.6、101.5cfu/mL，并且果汁本身的理化性質沒有發(fā)生明顯的變化。Ruiz等[37]研究發(fā)現(xiàn)，胡椒提取物對于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的最低抑菌濃度（MIC）及殺菌濃度（MBC）均為7.8 μg/mL，相同濃度下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢數(shù)與對照組相比下降約10 cfu/mL。

雖然香料提取物對食品中的各類有害微生物有較好的抑制作用，但是香料提取物濃度較高，氣味較重，對肉制產(chǎn)品的影響不大。而將香料提取物置于果汁類產(chǎn)品中，對果汁本身的風味卻有極大的影響。因此添加各類香料提取物但不會對產(chǎn)品本身造成影響是目前果汁產(chǎn)業(yè)需要研究的重點。

（2）其他提取物

除了各類香料以外，還有一些天然物質及其提取物有較好的抑菌效果。Molva等[38]將石榴提取物加入無菌蘋果汁中，并接種酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體與芽孢，調(diào)整菌液濃度達到105cfu/mL，10 d后，試驗組菌體數(shù)下降了約103cfu/mL，芽孢數(shù)下降了約101.6cfu/mL，且菌體與芽孢表面均有不同程度的凹陷。還有學者將葡萄籽提取物添加到無菌蘋果汁中并接種濃度為105cfu/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體與芽孢，結果發(fā)現(xiàn)14 d后，試驗組菌體數(shù)量下降約103.5cfu/mL，芽孢數(shù)下降約102cfu/mL，且菌體與芽孢表面均受到不同程度的損傷[39]?？梢钥闯銎咸炎烟崛∥锬芤欢ǔ潭鹊匾种扑嵬林h(huán)酸芽孢桿菌的營養(yǎng)菌體，但其抑菌效果較差且比較費時。因此雖然提取物可用于抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，但效果并不明顯，是否能夠通過其他物理、化學措施或與多種提取物結合的方式來提高其抑菌效果，還有待研究。

3.3 生物措施

乳酸鏈球菌素亦稱乳鏈菌肽（Nisin），是利用生物技術提取的一種純天然、高效、安全的天然生物活性抗菌肽。Nisin對包括食品腐敗菌和致病菌在內(nèi)的許多革蘭氏陽性菌具有強烈的抑制作用，是目前世界上唯一被允許用作食品添加劑的細菌素。所以目前很多學者開始研究將Nisin應用于食品貯藏行業(yè)。日本研究人員Komitopoulou等[40]研究發(fā)現(xiàn)，溫度為25 ℃時，Nisin對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的MIC為5 IU/mL，在80～95 ℃，Nisin可使酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的D值下降40%。基于目前的研究發(fā)現(xiàn)，Nisin對蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制作用并不明顯，但是因為乳酸鏈球菌素有良好的熱穩(wěn)定性，在生產(chǎn)中經(jīng)常與加熱處理結合使用，以達到更好地抑制有害微生物的目的。

3.4 綜合措施

基于目前的抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的措施效果并不顯著，因此有學者研究將兩種抑菌方法結合起來抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，以達到更好的效果。Luma等[41]將高溫和高壓相結合來處理酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的芽孢，以觀察這種方法是否對芽孢的失活和萌發(fā)存在影響，結果表明，在70 ℃下，芽孢數(shù)量減少了102.5cfu/mL（300 MPa）和102.4cfu/mL（600 MPa）。Gálvez等[42]將UV-C和超高壓均質（UHPH）結合以抑制蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢的活性，他們發(fā)現(xiàn)當入口溫度為80 ℃時，300 MPa超高壓處理可以使澄清蘋果汁中104.8cfu/mL的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌失活。UV-C處理在20 ℃下以21.5 J/m2的劑量能殺滅105.5cfu/mL濃度的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。與UV-C單次處理相比，在14.3、21.5 J/m2劑量下，先應用UHPH有助于獲得更高的酸桿菌孢子減少率。

Nisin可用于食品行業(yè)的滅菌處理，但是目前也有研究發(fā)現(xiàn)Nisin對于蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制作用并不明顯，因此有學者開始將Nisin與其他處理方式結合起來以抑制果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌[37]。

3.5 小結

目前的研究表明，各類抑制措施都有一定的抑制效果，但是目前并不能全部應用于實際生產(chǎn)中，應用于生產(chǎn)中的主要還是物理方式，且臭氧、超高壓等技術還均處于實驗室研究階段，無法大規(guī)模應用于工廠生產(chǎn)。兩種措施相結合的抑制措施可以更好地抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌及其芽孢的生長、萌發(fā)，但就目前情況來說，有些方法以當前的儀器設備還不能達到在生產(chǎn)上的大規(guī)模使用的程度。因此，應加快研究快速高效且對食品本身的營養(yǎng)成分及風味無太大影響的控制措施，來提高果汁行業(yè)的經(jīng)濟效益。

4 生產(chǎn)工藝控制措施

濃縮蘋果清汁的生產(chǎn)工藝流程為蘋果驗收→流水輸送（清洗）→揀選→破碎→榨汁→前巴氏滅菌（95～98 ℃、30～60 s）→酶解（50～53 ℃、2 h、約11.5°Bx）→超濾→樹脂吸附→濃縮（≥70°Bx）→后巴氏殺菌（95～98 ℃、30～60 s）→無菌灌裝→貯存（0～5 ℃）等。

從生產(chǎn)線的總體角度來看，11.5°Brix果汁的pH在3.6～4.3之間，生產(chǎn)線的物料溫度在50 ℃左右，從微生物生長的營養(yǎng)角度和物理條件看，生產(chǎn)線上的果汁非常適合微生物的生長。原料、樹脂吸附和設備管路死角是菌源，一旦把酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌引入生產(chǎn)線，就必然污染果汁，卻不一定泛濫。酶解工序、貯存罐緩沖等工序為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長提供了時間，此時，如果果汁受到污染，極易爆發(fā)泛濫。

4.1 原料控制

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌來源于土壤而非蘋果本身，蘋果原料在采摘過程中極易受到菌體的污染。采摘的蘋果原料在向果汁廠運輸?shù)倪^程中，通常先裝在包裝袋中，然后運往果汁廠。如果包裝袋沒有清洗干凈，也會產(chǎn)生污染。原料進入工廠后，在果槽邊卸車，工人將包裝袋劃破，蘋果直接倒入果槽。如果工人的工服或果槽沒有有效清洗，也會使蘋果感染酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。果槽中的蘋果通過流水輸送到車間進行壓榨取汁。因此，原料入廠環(huán)節(jié)是控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的第一道防護，對于整個果汁的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌控制至關重要。

原料從采摘到進入車間，要歷經(jīng)許多環(huán)節(jié)，完全不接觸酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌從理論上講幾乎是不可能的。問題的關鍵是在采摘、運輸和裝卸過程中，盡量確保包裝袋、車廂和果槽干凈，每完成一輪作業(yè)過程，徹底清洗車廂和包裝袋。落地的蘋果要丟棄或徹底洗凈之后再使用。蘋果從果槽向車間用流水輸送的過程中，逐級換用清水，避免輸送的水流被污染。目前在果汁廠一般采用逆向逐級換水的方式，在即將入車間的一段用最干凈的水清洗，然后依次向前一工序換水，將第一工序的水排放掉。這樣在整個輸送過程中，始終保持水的清潔，將耐熱菌的量控制在最低水平。

4.2 生產(chǎn)線清洗

生產(chǎn)線是酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長最主要的位置，生產(chǎn)線的干凈與否決定著果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的數(shù)量。在濃縮果汁生產(chǎn)企業(yè)，一般是24 h洗一次生產(chǎn)線。以超濾為界，超濾以前的濁汁段和以后的清汁段要分開清洗。清洗工序為水洗→1%的氫氧化鈉清洗→水洗→1%的殺菌劑清洗→水洗，在果汁廠俗稱“5步法”。清洗的水溫為75 ℃，清洗時間為15～25 min，清洗劑的濃度、溫度、清洗時間等可根據(jù)生產(chǎn)線酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的污染情況進行適當調(diào)整。

正常情況下清洗，理論上可以控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。但是上述清洗方式對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制極其有限，許多工廠受酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染嚴重。工廠生產(chǎn)線在進行安裝時，往往留下一些易忽視且不易清洗的死角，這些死角逐漸的成為生產(chǎn)線的菌源。同時，由于原料季節(jié)性的特點，果汁廠分為榨季和非榨季，非榨季進行技術改造或安裝新設備，又容易引入新的死角。

生產(chǎn)線上的交叉作業(yè)也會引起污染。例如不同的工序之間由于工具的串用引起的污染。比如一個機修工在巡檢時，在衛(wèi)生比較差的破碎工序使用了扳手等工具，然后在包裝工序使用同一個工具進行檢修，則可能會帶來交叉污染。為此，果汁廠一般要求電工、機修工逆生產(chǎn)工序進行巡檢，將污染降低到最小。另一種情況是車間的水蒸汽有時在不同的工序之間漂移，會從有菌區(qū)飄向無菌區(qū)，在無菌區(qū)的上方冷凝，水滴下落，剛好滴入有清汁的貯存罐，則相當于給果汁接種了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，短時間內(nèi)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌泛濫。為此，生產(chǎn)線上的物料盡量不要裸露在空氣中，貯存罐上部的孔蓋通常是合著的。不同工序之間盡量用格擋完全隔開，避免空氣、水汽等串聯(lián)。

保持車間環(huán)境衛(wèi)生也是非常重要的。車間要經(jīng)常開通風設備，保持正壓換氣，風機上的過濾設備要勤于檢查。車間爭取不積水，不積塵，物料擺放有序（可借助于5S管理）。通過GMP（良好操作規(guī)范）和SSOP（標準衛(wèi)生操作程序）措施，保持車間良好的衛(wèi)生，避免空氣中可能含有的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對生產(chǎn)線上的設備或物料造成污染。

4.3 物料在線時間的控制

濃縮果汁的物料在線時間從原料進入車間開始，歷經(jīng)一系列工序，到最終成品下線，一般需要15～25 h。物料在線時間越短，感染酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的機會就越少。如壓榨、殺菌、超濾等工序，用時較短；而酶解、濃縮（等待一個大罐滿）等工序，物料通常有一個在線作用時間，恰好為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長創(chuàng)造了有利條件。即使污染了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，如果在線時間短、菌體數(shù)量有限，殺菌工序可以有效殺滅酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。反之，微生物泛濫，殺菌工序也無能為力。

近年來，果汁廠原料緊張，在此情況下，生產(chǎn)線需要頻繁開機，生產(chǎn)線上容易發(fā)生斷料或積料。斷料時，生產(chǎn)線不能連續(xù)運行，如果不及時清洗，死角區(qū)會導致微生物泛濫。積料時，主體物料也會大面積發(fā)生微生物泛濫。在上述情況下，評估每日的原料采購量，通過調(diào)整生產(chǎn)線的單位時間進料量。原料充足時可在最大參數(shù)下進行，原料不足時則降至最低參數(shù)后進行，或者2～3 d開一次機，以確保生產(chǎn)線連續(xù)運行。

此外，停水停電或設備故障，也會造成物料在線時間延長，這種現(xiàn)象在果汁廠較常見。對于停水停電，盡量與供水供電部門協(xié)調(diào)，在停水停電以前，按照既定的方案有秩序地將物料安排好，避免積壓在線上。加強設備巡檢，爭取提早發(fā)現(xiàn)問題，在清洗生產(chǎn)線等時間方便時進行維修維護。對于突然停水停電或設備故障，一旦發(fā)生，則采取應急響應預案，根據(jù)具體情況對生產(chǎn)線進行酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染狀況的有效合理評估，爭取在酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌受控的情況下做到生產(chǎn)效益最大。

4.4 高溫殺菌

濃縮蘋果汁生產(chǎn)時，有兩個工序涉及到高溫處理。第一個是酶解前的濁汁（95～98 ℃、30～60 s），主要目的是滅酶，防止果汁過分褐變，兼有殺菌作用。第二個是灌裝前的濃縮汁（95～98 ℃、30～60 s），主要目的是殺菌。另外，果汁進行濃縮時，第一個工序也是一個溫度比較高的過程（90 ℃左右），這是便于高溫減壓濃縮。這幾個工序的高溫殺菌對于控制霉菌、酵母菌、細菌、大腸桿菌等普通的有害微生物是完全滿足要求的；對于少量耐熱菌，從微生物的殺菌曲線角度而言，一般的高溫處理也是有一定效果的；但對于生產(chǎn)線上泛濫后的耐熱菌，控制效果極其有限，幾乎不起任何作用。

為有效控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，有的生產(chǎn)線在灌裝前嘗試采用大約120 ℃、30～60 s的高溫處理果汁，對于控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的效果非常明顯。但是，如此高的溫度處理也會造成一系列問題：一是容易造成濃縮果汁營養(yǎng)損失，果汁中的維生素、多酚、黃酮等營養(yǎng)物質都是熱敏性的，損失非常大。其次，高溫處理的濃縮果汁會過度發(fā)生非酶褐變，果汁的顏色加深，商品性降低；再者，過分高溫處理導致濃縮果汁中的羥甲基糠醛（羥甲基糠醛是葡萄糖經(jīng)過一系列脫水形成的產(chǎn)物）含量升高，產(chǎn)生焦糊味；最后，過度高溫處理加速殺菌設備的橡膠墊老化，容易發(fā)生殘渣剝落，最終進入成品果汁，導致果汁產(chǎn)生異物。

有專家建議將酶解前的濁汁進行高溫殺菌，因為此時的果汁濃度約為11.5°Bx，將果汁進行預濃縮（21°Bx左右），可以避免發(fā)生一些濃縮汁（70°Bx）殺菌可能出現(xiàn)的副作用，如嚴重褐變、羥甲基糠醛升高、營養(yǎng)損失等。即使可能有橡膠墊殘渣，后面還有幾道過濾工序可以有效去除。從食品化學反應的動力學角度看，果汁濃度低時，各種成分相對含量也低，化學反應不劇烈，因此這種建議是可行的。但是，前提條件是前面高溫處理后，到灌裝前，還有很多工序，一定要確保這些工序完全無菌。否則，一旦果汁再次被酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染，前面的高溫處理將功虧一簣。在實際的生產(chǎn)線上，果汁經(jīng)歷多個工序而沒有接觸酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，通常是不可能的。

因此，盡管高溫殺菌能夠有效控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，生產(chǎn)中還是慎重選用。在第一道高溫處理時建議采用，在灌裝前的濃汁段是不宜采用的。

4.5 過濾除菌

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的形體大小為（2.9～4.3）μm×（0.6～0.8）μm，在不利于菌體生長的營養(yǎng)條件下會形成大小為（1.5～1.8）μm×（0.9～1.0）μm近端或終端橢圓形芽孢，采用孔徑小于0.22 μm的濾材可以有效去除酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。生產(chǎn)中目前一般在果汁灌裝之前過濾。通常采用板框壓濾機，孔徑為0.22 μm的紙板濾材。過濾的是濃縮汁，濃度高，阻力大，過濾速度慢。紙板在過濾前需要清洗，一般過濾幾個批次后，紙板需要更換。過濾時要特別關注壓力，如果壓力過大，容易發(fā)生紙板擊穿，引起果汁污染。壓力過小，則過濾速度慢，影響生產(chǎn)效率。紙板的成本比較高，生產(chǎn)中如果通過衛(wèi)生條件能有效控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，一般不使用紙板過濾。當然，如果有客戶提出果汁中的菌體數(shù)量必須小于一定數(shù)值，不論菌的死活，此時只能通過過濾來除菌。

紙板是一次性使用的，成本比較高，且有擊穿風險。為了克服這些缺陷，有專家建議采用陶瓷膜過濾，陶瓷膜可以重復使用，降低成本；膜的材質也比紙板結實，減少擊穿的危害。但是，陶瓷膜在過濾時，一旦被堵死，特別是一些無機鹽堵死，疏通比較困難。果汁中的礦物質含量比較高，極易發(fā)生堵膜現(xiàn)象。

4.6 小結

實際生產(chǎn)中可通過消除菌源，或改變環(huán)境條件，達到抑制耐熱菌的生長或消除耐熱菌的目的。保持原料干凈、徹底清洗生產(chǎn)線、縮短物料在線時間這三項措施也是為了確保生產(chǎn)線的干凈衛(wèi)生，基本無酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌或其沒有泛濫，通過一般的加工措施可以有效控制。因此保持生產(chǎn)線的干凈衛(wèi)生和正常生產(chǎn)運行對于控制耐熱菌而言是非常有利的。而高溫殺菌或過濾除菌，通常是在耐熱菌泛濫時才使用。此時生產(chǎn)成本加大，生產(chǎn)的果汁質量也降低。但基于目前的技術來看，其是一種相對有效的補救措施。企業(yè)在生產(chǎn)過程中基于當前現(xiàn)有的技術只能盡量地減少酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的數(shù)量，沒有辦法將其完全殺滅。在整條生產(chǎn)線上使用各類技術處理果汁，可以有效地抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長繁殖，以達到果汁的生產(chǎn)要求及行業(yè)標準。

5 展望

作為果汁產(chǎn)業(yè)中的關鍵控制因子酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的研究歷史已有30多年。隨著我國果蔬產(chǎn)品貿(mào)易量的增大及全球各國對食品安全問題的關注，減少或殺滅濃縮蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌是非常重要的。目前看來，能夠應用于控制和檢測蘋果汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌及其芽孢的方法有很多，不論是物理、化學、生物還是各類方法相互結合起來，都可以有效地對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌進行檢測和控制，但是我國產(chǎn)出的濃縮蘋果汁產(chǎn)品還是存在一系列問題?；谔O果汁從源頭到產(chǎn)品整個復雜的產(chǎn)業(yè)鏈，結合科學研究和生產(chǎn)實際，以保障果汁產(chǎn)品的質量，提高果汁行業(yè)的整體水平，是現(xiàn)階段果汁加工過程中的新趨勢。