超級增強子驅動致癌轉錄機制的研究進展

顧 鵬，孫 星

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院普外科，上海 201620

基因表達程序異常會導致癌細胞持續(xù)增殖、復制永生化、逃避凋亡及轉移等［1］，由遺傳學和表觀遺傳學改變驅動的轉錄失調是癌癥的重要發(fā)生機制［2-3］。決定癌細胞狀態(tài)的轉錄激活程序受細胞類型特異的近端調控元件啟動子和遠端調控元件增強子的控制。

1981年，Benoist等［4］在猿猴空泡病毒早期基因的5'端上游發(fā)現(xiàn)了首個增強子，由72 bp的重復序列構成，插入該序列的載體能使HeLa細胞中兔β球蛋白基因的表達量增加200多倍［5］。與啟動子不同，增強子調控基因轉錄的模式不具有方向性，且不受距離限制［6］。增強子區(qū)域通過與啟動子區(qū)域的直接相互作用形成三維環(huán)狀結構［7］，激活遠處的基因轉錄。有研究［8］發(fā)現(xiàn)，單個增強子甚至能調控多個基因的表達。

除普通增強子（typical enhancers，TEs）外，基因組上還存在大段緊密相連的增強子，即超級增強子（superenhancers，SEs）。2013年，研究［9］發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細胞的關鍵轉錄因子，如OCT4、SOX2和NANOG結合在一些特殊的增強子上，后者對于維持胚胎干細胞的干性十分重要，由此將其定義為SEs。同年，Whyte等［9］用關鍵轉錄因子PU.1、MyoD等進行染色質免疫共沉淀測序（chromatin immunoprecipitation sequence，ChIP-Seq）分析，在多種小鼠細胞中鑒定出了SEs。本文闡述SEs的基本結構與功能特征、相分離凝集體的形成，重點分析SEs驅動致癌轉錄的機制及拓撲相關結構域的形成及意義。

1 SEs的基本結構與功能

SEs是具有轉錄活性的增強子的一個大簇。在長度上，SEs橫 跨DNA的 長 度 比TEs高 一 個 數(shù) 量 級［9］。ENCODE（encyclopedia of DNA elements）數(shù)據(jù)庫［10］中，SEs長度的中位數(shù)一般介于10～60 kb，而TEs為1～4 kb。在數(shù)量上，SEs卻比TEs少1～2數(shù)量級。

1.1 SEs結合轉錄因子

增強子和SEs的核心特征是兩者所含有的結合位點簇能結合多個轉錄因子，包括關鍵轉錄因子、信號通路轉錄因子。此特征令SEs作為一個“平臺”，匯集與發(fā)育相關的內外環(huán)境信號通路來控制基因的時空表達［11］。與TEs相比，SEs以組織特異性轉錄因子的差異結合為特征［12］。

增強子及SEs激活的第一步均是結合先鋒轉錄因子，隨后招募共激活因子（coactivator）如組蛋白修飾蛋白、ATP依賴的染色質重塑因子和中介體復合物（mediator complex）［11］。上述組分在SEs中的結合密度平均比TEs高10倍［9］。研究［13］發(fā)現(xiàn)，在每個細胞周期中，DNA完成復制后，核小體立即重新定位到啟動子和增強子上，然后在數(shù)小時內迅速建立由轉錄因子和染色質重塑劑介導的DNA可接近性（DNA accessibility）。這種可接近性由DNA對DNA核酶如DNase Ⅰ的高敏感性界定［14］，包含上述轉錄因子結合位點的核小體具有特殊的染色質標志——H3K4me1、H3K27ac［10］。Hnisz等［15］進一步分析發(fā)現(xiàn)H3K27ac最適于鑒定SEs，以此特征在人乳腺癌細胞MCF-7中鑒定出了位于ESR1基因座（編碼雌激素受體α）的SEs，且雌激素受體α可結合此SEs區(qū)域的多個位點從而傳遞雌激素信號［16］。研究［17］發(fā)現(xiàn)，轉錄因子RUNX 3能夠增加乳腺癌細胞抑癌基因RCAN1.4相關SEs的H3K27ac修飾水平，RUNX3低表達與較差的總生存期（overall survival，OS）、無 復 發(fā) 生 存 期（relapse-free survival，RFS）、遠處無轉移生存期（distant metastasisfree survival，DMFS）相關，這也提示了關鍵癌基因相關SEs的染色質修飾水平可用來評估癌癥的預后。根據(jù)基礎的生物化學和遺傳特征，成神經(jīng)管細胞瘤分為4個主要亞型。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中受SEs調控的轉錄因子促進了細胞類型特異的核心調控環(huán)路的重建，鑒定出LMX1A為4型成神經(jīng)管細胞瘤的關鍵轉錄因子［18］。

1.2 SEs募集轉錄中介體

轉錄中介體（Mediator）是一種多蛋白共激活因子，其頭部和中部模塊形成核心中介體（core Mediator，cMed），結合核心轉錄前起始復合物（core transcription pre-initiation complex，cPIC），而尾部和激酶模塊起主要的調控作用。增強子/SEs與轉錄因子的結合募集高密度的Mediator，后者結合轉錄前起始復合物，促進了增強子/SEs-啟動子形成三維環(huán)狀結構［19］，以基因特異的方式與基礎轉錄元件和啟動子上的RNA聚合酶Ⅱ發(fā)生作用［20］。研究［21］表明，在形成上述結構的增強子和啟動子上均有黏連蛋白（cohesin）的富集，免疫沉淀分析顯示此三維環(huán)由黏連蛋白與Mediator構成，Mediator還與相分離凝集體（phase separated condensates）的形成相關，這些特性對于Mediator調控轉錄的功能至關重要。

關鍵轉錄因子通過結合位于增強子的結合位點，進一步招募Mediator、黏連蛋白及RNA聚合酶Ⅱ等蛋白轉錄復合體組分調控靶基因的表達，這些組分在SEs的結合密度平均比TEs高10倍。

2 相分離凝集體

除了在SEs的組裝和激活過程中有序地招募轉錄因子和共激活因子這一經(jīng)典模式外，Hnisz等［22］還提出了一種相分離的模型，將SEs特異的基因調控設立在無膜細胞器的范圍內。流體的相分離是一種物理化學過程，可將分子分離為密相和稀相。相分離的生物分子凝集體包含核仁、核小點、應激顆粒等，能劃分和集中細胞內的生物化學反應［23］。由液-液相分離產(chǎn)生的生物分子凝集體可以讓其組成部分快速移入或移出密相，并且具有液滴的融合或裂變等特性［24］。

2.1 相分離凝集體的形成

共激活因子BRD4、MED1的固有無序區(qū)（intrinsically disordered region，IDR）介導相分離凝集體的形成［25］，在某些條件下MED1-IDR能形成液滴而BRD4-IDR不能，且MED1-IDR形成的液滴能通過分子的相互吸引作用招募BRD4-IDR以及RNA聚合酶Ⅱ。類似地，關鍵轉錄因子OCT4、GCN4的轉錄激活域［26］、RNA聚合酶Ⅱ的C端結構域的IDR［27］都能介導相分離凝集體的形成。

2.2 相分離凝集體對SEs活性的影響

在Hnisz等［22］提出的轉錄調控動力學模型中，“N”表示相互作用的大分子數(shù)，如增強子及其相關因子，設定SEs N為50而TEs N為10；用“f”來表示“價態(tài)”，即每個分子中能被修飾并與其他鏈發(fā)生交聯(lián)的殘基數(shù)；轉錄活性由最大交聯(lián)鏈簇的大小來表示。SEs在達到一定轉錄活性時，所需“價態(tài)”水平比TEs更低，提示在相同條件下SEs更容易形成相分離凝集體，這即是SEs調控轉錄的作用大于組成性TEs作用之和的一種解釋。另一種解釋是Mediator及關鍵轉錄因子與SEs的結合過程增加了相應的啟動子緊靠活性聚合酶簇的時間［28］。

2.3 SEs對微擾（perturbation）高度敏感

橫跨數(shù)萬堿基對的SEs會因某個輔因子受干擾而導致整體的破壞，組成性增強子基因片段的缺失也可能導致其余部分的功能喪失［16］。Whyte等［9］發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠胚胎干細胞特異的轉錄因子OCT4和Mediator亞單位Med12會導致與SEs關聯(lián)的基因表達量急劇下降。此外，JQ1（BRD4的競爭抑制劑）選擇性地結合BRD4的乙酰賴氨酸識別區(qū)域，即干擾了BRD4與SEs H3K27ac位點的結合，抑制啟動子和增強子的相互作用［29］。類似地，針對細胞周期素依賴性激酶7（cyclin-dependent kinase 7，CDK7）的高度特異的共價抑制劑THZ1也能干擾SEs，有效抑制相應癌基因的轉錄［30］。利用ChIP-seq技術還發(fā)現(xiàn)1，6-己二醇能同時減少與增強子結合的BRD4、MED1及RNA聚合酶Ⅱ的量。值得注意的是，SEs比TEs對此類抑制劑更敏感［26］。上述抑制劑JQ1、THZ1的作用已分別在彌漫大B細胞淋巴瘤、急性髓系白血病、成神經(jīng)細胞瘤、三陰性乳腺癌等多種腫瘤類型中得以驗證［31-34］。除此之 外，ABBV-774［35］、ABBV-705［36］、cortistatin A（CA）［37］等抑制劑抗腫瘤效應的發(fā)現(xiàn)也展現(xiàn)出針對SEs治療策略的強大潛力?？傊琒Es對微擾高度敏感的特性為深入探討SEs的組成、功能及腫瘤靶向治療等提供了新的切入點，未來的研究應進一步深入分析SEs的各個組成部分如何分別調控SEs的功能。

3 SEs驅動致癌轉錄的機制

多數(shù)腫瘤細胞依賴SEs驅動的異常轉錄調控。目前研究發(fā)現(xiàn)，SEs與腫瘤的上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）［38］、代謝重編程［39］、免疫逃逸［40］、凋亡抵抗［41］等過程密切相關，此外，SEs還可通過促進m iRNA加工從而產(chǎn)生細胞類型特異的m iRNA來控制細胞“身份”［42］。SEs在很多腫瘤中標志著譜系特異的轉錄因子和癌基因［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，在未發(fā)生癌變的細胞中明顯缺乏與關鍵癌基因關聯(lián)的SEs，提示SEs是在腫瘤發(fā)生過程中形成的，并發(fā)揮著維持腫瘤特性的作用［15］，且與較高的腫瘤臨床分期和病理分級相關［43］。目前，SEs驅動致癌轉錄的機制主要涉及2個方面［44］：影響SEs核心成分的基因突變；基因組3D結構的改變“劫持”SEs。

3.1 影響SEs核心成分的基因突變

3.1.1 插入突變 位點在SEs內的生殖細胞或體細胞突變?yōu)殛P鍵轉錄因子創(chuàng)造了新的結合位點，結合后通過招募共激活因子激活SEs，從而導致相鄰原癌基因的轉錄上調。Mansour等［45］發(fā)現(xiàn)，急性T淋巴細胞白血病Jurkat細胞中高表達轉錄因子TAL1，并在TAL1啟動子附近觀察到了一個活化的SEs區(qū)域。對這個區(qū)域進行基因測序，顯示這個致癌變化僅僅是由一段12 bp長的插入突變導致的，從而形成了新的MYB結合位點。進一步研究發(fā)現(xiàn)MYB的結合募集了CBP/p300乙酰轉移酶、TAL1以及其他轉錄因子如RUNX1、GATA-3，驅動與白血病相關的關鍵基因的異常表達。

3.1.2 單核苷酸多態(tài)性 除了插入突變外，一些特定腫瘤相關的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與致癌SEs活性的調控也有直接關系。在成神經(jīng)細胞瘤中，G＞T的SNP突變發(fā)生于LMO1癌基因第一個內含子的SEs區(qū)域，致癌等位基因位點“G”落在保守的GATA3（GATA binding protein 3）結合位點上，與SEs的活化狀態(tài)有關；而保護性的等位基因位點“T”阻礙GATA3的結合，減少H3K27ac的募集，SEs活性以及LMO1表達量明顯下降［46］。另一方面，SNP還可以通過破壞抑癌基因相關的SEs而促進腫瘤發(fā)生［47］。在慢性淋巴細胞白血病中，一種SNP抑制了轉錄因子RELA與促凋亡蛋白即BH3-only蛋白——BM F（Bcl2 modifying factor）相關的SEs的結合（此蛋白通過與抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xL結合，釋放beclin-1，促進自噬/凋亡［1］）。上述過程導致了BMF表達量的下降，Bcl-2/BclxL抗凋亡功能增強，從而促進腫瘤發(fā)生。

3.1.3 局部擴增 拷貝數(shù)量突變如SEs的擴增是致癌激活的一種常見機制。在12種不同腫瘤中，Zhang等［48］利用體細胞拷貝數(shù)分析聯(lián)合組織特異性表觀遺傳分析鑒定出了SEs在癌基因KLF5、USP12、PARD6B和MYC附近的擴增。在某些情況下，這些擴增的致癌SEs表現(xiàn)出細胞類型特異的定位。例如，在MYC基因座的3′端，SEs的局部擴增在急性T淋巴細胞白血病、急性髓系白血病、肺腺癌和宮頸癌中表現(xiàn)出獨特的定位，從而可能通過種系特異的染色體環(huán)來調控MYC基因表達［48-49］。類似地，在成神經(jīng)細胞瘤中，一段長350～2 000 kb的基因組區(qū)域包含MYCN癌基因和其同源擴增的SEs，因而導致MYCN高表達并驅動致癌過程［33］。

3.1.4 染色體重排 染色體重排能夠將癌基因與原來不相關的SEs并列起來，促使癌基因高表達，這種現(xiàn)象也被稱為“增強子劫持（enhancer hijacking）”。在腺樣囊性癌中，染色體易位產(chǎn)生了一段融合基因，即在MYB癌基因附近形成了新的嵌合的SEs，進一步通過染色質構象捕獲分析證實了此SEs與MYB基因啟動子之間能夠相互作用，而且這個異常易位的SEs包含MYB結合位點，構成一種正反饋來維持自身表達［50］。又如有研究［51］在3型和4型髓母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)了一系列導致癌基因異常激活的高度變化的基因組重排。一段原先相距400 kb的DNA序列被放置到癌基因GFI1/GFI1B附近，在斷點處檢測出了SEs活性，證明GFI1/GFI1B基因的過表達與此重排密切相關。目前研究顯示，導致GFI1/GFI1B激活的染色體結構變異大多不包括此基因本身，因此凸顯了重新分析現(xiàn)有測序數(shù)據(jù)中基因組非編碼區(qū)的重要性，且據(jù)此可推測此種“增強子劫持”現(xiàn)象在其他實體腫瘤中也同樣普遍存在。

3.2 基因組3D結構的改變“劫持”SEs

染色質在分裂間期的細胞核中組成一系列有層次的三維結構域，包括能發(fā)生自身相互作用的區(qū)域，稱為拓撲相關結構域（topologically associating domains，TADs）［52］。TADs的結構在不同的細胞類型中大致保持穩(wěn)定且在相關物種中進化高度保守［53］，是更高級別染色體結構的基礎。該結構能使增強子與原來與之相距數(shù)百堿基的靶基因在位置上更接近，這可能也是TADs內DNA之間相互作用頻率更高的原因［54］。TADs的邊界由與結構蛋白如轉錄阻抑物CTCF（CCCTC binding factor）、黏連蛋白結合的區(qū)域劃定，通常包含成對的CTCF結合位點，其基序方向相反，呈匯聚趨勢［53］。Dowen等［55］在鼠胚胎干細胞內發(fā)現(xiàn)細胞身份基因不僅出現(xiàn)在“基因沙漠”（gene desert），而且還被限制在由黏連蛋白介導的CTCFCTCF環(huán)所包圍的“絕緣區(qū)域”內，并定義為SEs域（SE domains，SDs）。此“絕緣區(qū)域”中位長度約為200 kb，包含一段平均長度約為30 kb的基因，并被認為是組成約1Mb大小的TADs基本單位，限定了增強子、SEs、轉錄阻抑物的有效作用范圍。上述結構印證了2種猜想：細胞身份基因需要精準地表達，因此不能受到除相關SEs以外的信號干擾；SEs調控轉錄的功能強大，需要防止其激活不相關的鄰近基因。近年來，一些研究表明TADs邊界的破壞能夠導致細胞內癌基因的過表達從而誘發(fā)腫瘤［56］。

3.2.1 體細胞結構變異Hnisz等［57］發(fā)現(xiàn)，與急性T淋巴細胞白血病發(fā)病機制相關的復發(fā)性微缺失（recurrent microdeletions）能夠消除包含關鍵癌基因的絕緣區(qū)域的邊界。該團隊利用CRISPR/Cas9技術在人胚腎成纖維細胞中敲除部分上述TADs邊界，發(fā)現(xiàn)此變化足以激活原癌基因TAL1和LMO2。Weischenfeldt等［58］利用順式表達結構變化映射（cis expression structural alteration mapping，CESAM）的計算框架進行了泛癌分析，在肉瘤和鱗癌中識別出了與IRS4基因過表達相關的TADs邊界缺失；在結直腸癌細胞11號染色體上進一步研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因的串聯(lián)復制讓拷貝后的IGF2基因和SEs片段頭尾相接，延伸到下一個TAD的邊界，在原先存在的TADs結構之間形成了新的3D染色體區(qū)域，將SEs包含其中，造成癌基因的轉錄調節(jié)異常。Dixon等［59］用一個整合了光學圖譜、高通量染色質構象捕獲技術（high-throughput chromosome conformation capture，Hi-C）和全基因組測序的框架，系統(tǒng)地檢測了多種正?；虬┌Y樣本及細胞系中基因的結構變異，發(fā)現(xiàn)PANC1細胞9號和18號染色體的融合導致了新TADs的形成，又在成神經(jīng)細胞瘤中證實了新TADs包含關鍵癌基因MYC，促使其高表達。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)很多種由結構變異誘導的新TADs都包含已知的癌癥驅動基因，如TERT、ETV1、ETV4和ERBB2。在前列腺癌細胞中，基因結構變異使一個包含TP53抑癌基因的TAD裂解成2個小的TAD，導致多個基因的表達失調［60］。綜上所述，相鄰TADs的融合可以讓鄰近TADs內的增強子激活癌基因，即出現(xiàn)“增強子劫持”現(xiàn)象；反之，一個TAD裂解成多個子域也可隔離啟動子和增強子，阻礙兩者的相互作用。

3.2.2 表觀遺傳學改變 組蛋白賴氨酸的甲基化修飾能夠調節(jié)染色質結構，表觀遺傳學改變驅動的轉錄失調是癌癥發(fā)生的一個重要機制。膠質瘤可由IDH基因功能獲得型突變引起，突變的細胞積聚2-羥基戊二酸，抑制TET蛋白，導致突變細胞的CpG甲基化程度升高［61］，從而可能引起抑癌基因的轉錄失活。突變細胞中CTCF與黏連蛋白的結合位點的超甲基化會減少甲基化敏感的絕緣蛋白的結合，從而破壞TADs邊界，使得常規(guī)情況下定位在包含PDGFRA基因的TADs外的增強子驅動PDGFRA的異常轉錄。該研究還指出TADs邊界的失活是DNA甲基化依賴的。關于在更多腫瘤類型中表觀遺傳學的改變如何影響TADs結構從而導致轉錄調控異常，仍有待進一步研究闡明。

4 結語

近年來，隨著Hi-C等技術的飛速發(fā)展，人們對SEs的功能、內在特性、生物物理學結構及其在3D基因組結構下對靶基因的調控機制有了新的認識。多個不同種類的突變包括重復、缺失、倒位和易位等可共同導致單個靶基因的激活，且通常不伴有該基因的拷貝數(shù)變化［51］。因此，利用CRISPR基因編輯技術、單細胞測序技術結合ChIP-seq、轉座酶探究可接近性染色質高通量測序技術（assay for transposase-accessible chromatin with highthroughput sequencing，ATAC-Seq）［62］和靶向剪切及轉座酶 技 術 （cleavage under targets and tagmentation，CUT＆Tag）［63］等綜合新技術，深入研究轉錄調控元件增強子尤其是SEs意義十分重大，并將為研究SEs調控轉錄和腫瘤發(fā)生的作用以及針對SEs的藥物研發(fā)提供新的見解。

SEs為具有轉錄活性增強子的一個大簇，促進致癌轉錄的同時使癌細胞高度依賴此過程，在多種癌癥類型中起到維持癌細胞“身份”的作用，可用以鑒定細胞類型特異的關鍵轉錄因子，尋找關鍵致癌基因，以此區(qū)分癌癥的不同亞型。近年來，對SEs的研究不僅涉及線性結構的基因組，而且逐漸聚焦于基因組3D結構的形成及意義。液-液相分離凝集體的形成是SEs基因座最顯著的特征之一，能夠將SEs結構與其他染色質區(qū)域分隔開，解釋了SEs調控轉錄的作用大于組成性普通增強子作用之和。此外，真核基因組內還存在TADs結構，其邊界的破壞與SEs的激活、腫瘤的發(fā)生密切相關；但關于致癌信號通路如何通過終端轉錄因子影響染色質從而影響SEs的裝配和功能，還有待進一步探究?？傊瑢Es功能進行深入研究對于發(fā)現(xiàn)新的生物標志物，以及提出針對這種強大的基因組調控結構的治療新策略至關重要。

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