LC-MS在中藥代謝組學(xué)中的應(yīng)用進展

劉榮華，俞洪華，殷茜茜，楊 麗，邵 峰，孟曉偉*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

中藥用于疾病的預(yù)防和治療具有悠久歷史，數(shù)千年來的臨床應(yīng)用已經(jīng)證明了中藥的有效性和安全性，但是由于中藥化合物種類多、靶點多、藥效物質(zhì)和作用機制模糊等因素制約著中藥的現(xiàn)代化發(fā)展，如何將傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論用現(xiàn)代生命科學(xué)闡明一直是制約中醫(yī)藥國際化的難題[1]。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后系統(tǒng)生物學(xué)的一門新興學(xué)科，通過對生物樣品(血漿，尿液，組織等)中的相對分子質(zhì)量小于1 000的內(nèi)源性代謝物進行系統(tǒng)的定性和定量分析，探索代謝物與機體生理、病理變化的相關(guān)性，以評價生物體復(fù)雜體系相互作用及對內(nèi)外因素刺激下的整體動態(tài)代謝反應(yīng)[2]，代謝組學(xué)以其獨特的整體、動態(tài)的表達特征與中醫(yī)藥的整體觀、辨證論治的診療思維不謀而合，與中藥多成分、多靶點、多途徑和整體性的特點相匹配[3]。

近些年來，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于闡明中藥的毒性機制[4]和療效[5]，其主要分析技術(shù)包括核磁共振(NMR)[4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)[6]和LC-MS[7]等。其中LC-MS技術(shù)在代謝組學(xué)領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢，因為質(zhì)譜的高靈敏度和高分辨率，并且LC-MS可以用相對較小體積(1～10 μL)的生物流體來檢測最大部分的代謝物。相比于GC-MS，LC-MS不需要對樣品進行繁瑣的衍生化預(yù)處理，也適用于熱穩(wěn)定性差、難揮發(fā)、難衍生化和分子量較大的樣品[8]。LC-MS極大推動了代謝組學(xué)的發(fā)展，特別是高分辨質(zhì)譜憑借其高普適性、高靈敏度和準(zhǔn)確度逐漸成為代謝組學(xué)研究中的主流方法[9]。本研究以LC-MS為切入點，闡述了LC-MS的常用類型和生物樣品的前處理方法，并綜述了近3年來LC-MS在中藥代謝組學(xué)中的具體應(yīng)用，以期為中藥代謝組學(xué)研究提供參考。

1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)梗概

LC-MS是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一門新的儀器分析方法[10]，主要由液相色譜和質(zhì)譜兩部分組成，通過LC色譜進行分離，以MS進行定性分析。LC-MS集LC的高分離能力、MS的高靈敏度和專屬性于一體，可以快速獲得巨大的信息量[11]。

1.1 液相色譜(Liquid chromatography，LC)

液相色譜對待測物起到分離作用，合適的色譜條件不僅可以獲得更好的檢測限，并且可以降低背景噪音獲得更高質(zhì)量的質(zhì)譜信息[12]。其中液相色譜的核心——色譜填料直接對色譜系統(tǒng)的分離效率和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響?，F(xiàn)有的色譜填料主要分為三大類：無機基質(zhì)填料、有機基質(zhì)填料和復(fù)合材料。無機基質(zhì)填料中的多孔二氧化硅微球填料，因其機械強度高、熱和溶劑穩(wěn)定性好、表面易于修飾和生物兼容性好等優(yōu)點，已成為應(yīng)用最廣泛的色譜填料[13]。近些年來分別有2-甲基咪唑[14]、碳量子點[15]、聚乙烯醇[16]、離子液體[17-18]和多孔石墨烯[19]等各種材料對二氧化硅微球進行表面官能化修飾進而改進固定相和提高色譜性能，得到了很好的選擇性和分離效果。除此之外有機基質(zhì)填料中的聚合物型色譜填料憑借化學(xué)穩(wěn)定性、易于被衍生化及負(fù)載能力強等特點，也越來越受到科研工作者們的重視[20]。

如今最常用的液相色譜技術(shù)是反相液相色譜(RPLC)、親水相互作用色譜(HILIC)和正相液相色譜(NPLC)。RPLC基于疏水性的差異實現(xiàn)分離，使用RPLC可以很好地分離除極性代謝物以外的所有化合物。HILIC與RPLC互補，可成為強極性和親水性代謝物的選擇方法[21]。在利用一維液相色譜技術(shù)(1DLC)如RPLC、HILIC或NPLC分離復(fù)雜的代謝產(chǎn)物時，因為只能利用代謝物的一種性質(zhì)，并且無法分離部分具有相似結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體，所以難以在適當(dāng)分析時間內(nèi)以有限的峰容量及分離能力達到復(fù)雜樣品的分離需求。多維液相色譜技術(shù)(MDLC)中的二維液相色譜技術(shù)(2DLC)將RPLC、NPLC和HILIC等不同的分離機理的色譜柱串聯(lián)，可極大增加色譜峰容量和提高分離能力，被認(rèn)為是分析復(fù)雜樣品的有力技術(shù)[22]。2DLC分離性能是由色譜維數(shù)和分離正交性的峰容量決定，峰容量是指色譜系統(tǒng)在適當(dāng)?shù)姆治鰰r間內(nèi)，相鄰色譜峰在滿足一定分離要求的基礎(chǔ)上能夠分離的最大組分?jǐn)?shù)。正交性是評價色譜系統(tǒng)分離能力的重要指標(biāo)，受二維色譜柱的選擇和流動相性質(zhì)的影響[23]，正交性越高則色譜峰容量越高。理論上2DLC的峰容量是一維色譜與二維色譜分離峰容量的乘積，實際分離過程中峰容量受限于正交性程度和兩維分離的實際效率[24]。2DLC可分為在線或者離線兩種模式，離線模式一般通過傳統(tǒng)高效液相色譜(HPLC)進行，將流經(jīng)第一維的組分收集，之后再注入第二維系統(tǒng)進行分離，同一儀器只需改變固定相和/或流動相，即可組成一個二維液相系統(tǒng)。離線模式的優(yōu)點是方便且無時間限制，缺點則是耗時較長、自動化和重復(fù)性很差并且存在樣品丟失或者污染的風(fēng)險。相比于離線模式，在線2DLC自動化和重復(fù)性都更高并且耗時較短，第一維的組分通過特定的接口連續(xù)轉(zhuǎn)移到第二維，以便進一步分離。在線2D-LC的峰容量通常低于離線2D-LC的峰容量，但是比1D-LC要高很多[25]。近些年來，2DLC憑借著高分離度和峰容量在代謝組學(xué)中被廣泛運用[26-27]。

1.2 質(zhì)譜(Mass spectrometry，MS)

質(zhì)譜是通過測量化合物質(zhì)荷比(m/z)進行定性定量的儀器。質(zhì)譜根據(jù)質(zhì)量分析器種類可分為低分辨質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜兩種，低分辨質(zhì)譜是有四極桿分析器(Quadrupole analyzer，Q)、離子阱(Ion trap，IT)、三重四極桿(Triple quadrupole，QQQ)和四極桿-線性離子阱(Q-Trap)等質(zhì)量分析器的質(zhì)譜儀，高分辨質(zhì)譜則有靜電場軌道阱(Orbitrap)、飛行時間(Time of flight，TOF)和傅立葉變換離子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，F(xiàn)T-ICR)等[28]。

三重四級桿(QQQ)質(zhì)譜常用于定量檢測且應(yīng)用范圍不斷擴大，如用于藥物檢測[29]、農(nóng)藥殘留檢測[30]、抗體偶聯(lián)藥物檢測(Antibody-drug conjugates，ADCs)[31]、類固醇激素檢測[32]等。三重四級桿(QQQ)質(zhì)譜的多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式定量性能高，但MRM模式需要提供特定的反應(yīng)離子信息來選擇性地采集信號，因此對未知化合物的檢測性能不足，并且MRM模式需要耗時的預(yù)篩選步驟以便為質(zhì)譜分析優(yōu)化最佳條件[33]。相對而言，Q-TOF可以無需優(yōu)化、快速可靠地鑒定和定量大多數(shù)化合物，但Q-TOF定量分析相比QQQ儀器靈敏度降低，導(dǎo)致某些目標(biāo)分析物的檢測限更高。由于電離源和離子探測器技術(shù)的改進，最近開發(fā)的儀器提供了比過去更高的靈敏度及更寬的線性動態(tài)范圍，近年來已經(jīng)發(fā)表了一些Q-TOF/MS定量分析的研究[33-36]。Q-Trap可以通過子離子掃描(Product Ion Scan)、母離子掃描(Precursor Ion Scan)和中性碎片丟失掃描(Neutral Loss)等掃描模式用于定量和定性分析，使用比較多的是通過多反應(yīng)監(jiān)測掃描 MRM模式進行定量檢測和線性離子阱的增強子離子掃描模式 (Enhanced product ion scanning，EPI)獲得相應(yīng)的二級碎片圖進行定性確證。當(dāng)使用信息依賴性獲取技術(shù) (Information dependent acquisition，IDA)時，可將兩種掃描模式相結(jié)合，即多反應(yīng)監(jiān)測-觸發(fā)增強子離子掃描模式 (MRM-IDA-EPI)，該種模式一次進樣可以同時獲得高靈敏度MRM的定量數(shù)據(jù)和二級全掃描質(zhì)譜圖 (EPI)進行定性確認(rèn)[37-39]，在不降低定性和定量分析性能的同時，不僅實現(xiàn)準(zhǔn)確定量特定目標(biāo)化合物，而且只需一次進樣就能準(zhǔn)確定性鑒定化合物。FT-ICR具有超高的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確度、多級裂解和不需要色譜分離直接進樣進行代謝物檢測和鑒定等特點，可以更有效準(zhǔn)確地鑒定內(nèi)源代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此近些年來在代謝組學(xué)研究中顯示出巨大的優(yōu)勢[40]，盡管FT-ICR具備了超高的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確度，但TOF在廣泛的采樣率范圍內(nèi)更加穩(wěn)定，在高采樣率下，TOF的靈敏度可能超過FT-ICR[41]。由四極桿分析器(Quadrupole analyzer，Q)和軌道阱(Orbitrap)組成的串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-Orbitrap)可同時實現(xiàn)對母離子和質(zhì)譜二級碎片離子的高分辨數(shù)據(jù)采集，為化合物的鑒定提供了準(zhǔn)確的信息，具有高靈敏度、高分離度和高準(zhǔn)確度等優(yōu)勢，已被廣泛運用于中藥成分研究[42-44]。

2 生物樣品的前處理

在代謝組學(xué)的檢測分析中，往往需要生物樣品作為分析目標(biāo)進行檢測，生物樣品往往含有除了待測組分以外的許多干擾檢測內(nèi)源性或外源性的物質(zhì)，對質(zhì)譜信號產(chǎn)生增強或者抑制等基質(zhì)效應(yīng)[45]。根據(jù)文獻報道，在眾多生物基質(zhì)中，磷脂等分子是基質(zhì)效應(yīng)的主要來源[45-46]，其他成分如鹽類對于基質(zhì)效應(yīng)也有很強的影響，尤其是在這些物質(zhì)不易揮發(fā)的情況下[47]。因為生物樣品中待測組分的含量很低，因此想要提高檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度必須采取方法減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。樣品前處理可以有效減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，樣品前處理的方法有蛋白沉淀法、固相萃取法、液液萃取法、微透析技術(shù)和其他方法。

2.1 蛋白沉淀法(Protein precipitation，PPT)

藥物在體內(nèi)藥動學(xué)過程中，藥物的原型成分與代謝成分均可與內(nèi)源性蛋白形成蛋白結(jié)合物，為了檢測準(zhǔn)確度和靈敏度的需要，必須使藥物從蛋白結(jié)合物中分離。蛋白質(zhì)沉淀法(PPT)是目前使用最廣泛、簡單的樣品前處理方法，一般步驟是向樣品中加入有機溶劑(乙腈、甲醇等)、無機鹽和酸性物質(zhì)，或者采用加熱的方法使蛋白沉淀，然后高速離心分離得到待測液。其優(yōu)點是操作簡單快速、成本低廉，但是因為無法消除大部分不參與蛋白質(zhì)沉淀的內(nèi)源性成分[48]，因此靈敏度較低且不適合微量樣品的分析。

2.2 固相萃取法(Solid phase extraction，SPE)

固相萃取法基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、凈化，可看作一種類似色譜過程。根據(jù)固相萃取劑的不同固相萃取法可分為正相、反相和離子交換固相萃取三類。固相萃取法的基本操作步驟有三步：活化、上樣和洗脫，其優(yōu)點是自動化程度高，選擇性好；缺點主要是成本較高，重現(xiàn)性比較差。因此為了取得更好的檢測效果，減少基質(zhì)效應(yīng)的影響需要采取更為復(fù)雜的處理方法，比較常用的是混合SPE的方法[49-51]。

2.3 液液萃取法(Liquid-liquid extraction，LLE)

液液萃取法利用的是萃取的原理，因為大部分藥物都是親脂性的，血漿樣品中大部分內(nèi)源性物質(zhì)都是極性較大的水溶性物質(zhì)。通過加入與水不相溶的有機溶劑如(乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿等)，可將親脂性藥物萃取出來富集之后進行檢測。液液萃取法操作簡單，成本較低，但是極性化合物的提取率很差，且自動化程度較低。

2.4 微透析技術(shù)(Microdialysis technology，MD)

微透析技術(shù)是基于透析原理的活體取樣技術(shù)，近些年來越發(fā)受到人們的關(guān)注，該技術(shù)可以在維持生物生命體征正常的情況下進行在體、實時和在線取樣和檢測。微萃取系統(tǒng)主要由微量注射泵、探針、微量收集器、連接管和分離檢測裝置組成。一般操作步驟是將探針探入靶組織，微量注射泵將灌流液(濃度、組成與靶組織間液相似的生理溶液)以一定流速(一般1～5 μL /min)流經(jīng)探針，此時由于半透膜兩端藥物有濃度差，游離型藥物會擴散進入探針隨著灌流液不斷流出。探針是該系統(tǒng)的核心部分，起著半透膜的作用，目前常用的探針有柔性探針、同心圓形探針、線性探針和分流探針?biāo)姆N，可以根據(jù)不同的靶組織選擇不同的探針。與其他方法相比，微透析技術(shù)有以下優(yōu)點[52-53]：①對實驗動物的傷害較小，取樣過程不影響生物正常生命體征，可實現(xiàn)實時在線取樣；②可以在同一動物身上連續(xù)取樣，減少動物使用量，降低個體差異帶來的影響；③自動篩選游離型藥物，由于探針半透膜的存在使得灌流液中的樣品無需直接檢測，減少了樣品的損失和誤差，提高了樣品穩(wěn)定性。雖然微透析技術(shù)能夠完全除去蛋白質(zhì)和其他大分子，但是依然無法除去鹽類物質(zhì)[48]，應(yīng)通過其他樣品制備技術(shù)或適當(dāng)?shù)纳V分離來消除鹽類物質(zhì)[54]。

2.5 其他方法

在生物樣品的前處理方法中還有其他的處理方法，比如液相微萃取(Liquid phase microextraction，LPME)[55]、固相微萃取(Solid phase microextraction，SPME)[56-57]、分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technology，MIT)[58]、柱切換技術(shù)(Column switching technology，CS)[59]和超臨界流體萃取(Supercriticalfluid extraction，SFE)[60]等方法。為了提高樣品前處理的質(zhì)量，以上所有方法也可以互相結(jié)合起來[61]。

3 LC-MS在中藥代謝組學(xué)中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)中一個快速發(fā)展領(lǐng)域，代謝組學(xué)通過分析生物樣品中的整體代謝情況，研究體內(nèi)內(nèi)源性代謝物應(yīng)對外部刺激的潛在生物標(biāo)志物和代謝途徑，揭示病理機制和藥物療效機制。代謝組學(xué)的整體性和動態(tài)性的特點，與中醫(yī)藥理論的整體性和統(tǒng)一性原則相契合，為中藥疾病診斷、藥物評價和機制解釋提供了一種有前景的方法。中藥的多成分、多靶點的特點對于中藥的分析技術(shù)提出了很高的要求。近些年來，LC-MS憑借高靈敏度和準(zhǔn)確度以及分析效率高等優(yōu)點逐漸成為中藥代謝組學(xué)領(lǐng)域的主要方法，LC-MS在中藥代謝組學(xué)中的應(yīng)用主要有單味中藥研究、中藥復(fù)方配伍規(guī)律研究、生物標(biāo)志物研究和中藥復(fù)方作用機制研究等四個方面，生物樣品的選取也從傳統(tǒng)的血清、尿液和糞便樣品擴展到了組織、細(xì)胞等樣品。見表1。

3.1 單味中藥研究

單味中藥是中醫(yī)預(yù)防和治療疾病的最主要載體，也可以看作是一個小復(fù)方，對單味中藥的研究不僅關(guān)乎中藥的臨床療效和合理用藥，也可以為中藥資源的合理應(yīng)用提供依據(jù)。劉子菡等[62]基于代謝組學(xué)技術(shù)研究硫熏麥冬影響大鼠體內(nèi)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的相關(guān)過程，應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive 軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)分別對空白組、麥冬提取物組和硫熏麥冬提取物組的SD大鼠血漿樣本進行分析，篩選和鑒定出35 個差異性生物標(biāo)志物和15個潛在的生物標(biāo)志物，通過對大鼠血漿生物標(biāo)志物進行代謝通路分析，得到6條代謝通路，結(jié)果顯示硫熏麥冬組主要影響了大鼠體內(nèi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路，推斷硫熏麥冬擾亂了正常大鼠體內(nèi)氨基酸的生物合成及代謝相關(guān)過程。該研究不僅為硫熏麥冬的毒性機理提供了科學(xué)解釋，也為硫磺熏蒸法炮制的中藥研究提供了參考。王夏雷等[63]通過分析大鼠空白組和土三七給藥組血清、肝組織差異代謝通路，從多方面揭示土三七致肝毒性的作用機制；將大鼠連續(xù)給藥14天后處死，取血和肝臟組織測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、白蛋白 (ALB)水平，并通過液質(zhì)聯(lián)用法分析大鼠代謝譜變化；發(fā)現(xiàn)與空白組相比，土三七給藥組的ALT和AST水平顯著升高，并分別從血清和肝臟組織中篩選出13種和14種差異代謝物，推斷土三七致肝毒性機制可能與甘油磷脂、膽汁酸代謝紊亂有關(guān)；該研究利用代謝組學(xué)方法從內(nèi)源性代謝物變化角度初步探討了土三七致大鼠肝毒性的毒性機理，為毒性中藥的毒性機制研究提供了一種新的視角。除此之外，植物代謝組學(xué)作為代謝組學(xué)的重要組成部分，植物代謝組學(xué)也逐漸成為中藥資源領(lǐng)域研究的有效途徑[91]。WU等[64]基于植物代謝組學(xué)方法對虎杖的6個不同部位組織(根、莖、葉、花、根莖和種子)的代謝譜進行了分析檢測，鑒定了虎杖的主要活性成分二苯乙烯類化合物、蒽醌類化合物和黃酮類化合物，并測定了各組織間化合物的相對含量，發(fā)現(xiàn)根和根莖中二苯乙烯類和恩醌類化合物的含量遠高于其他組織，為虎杖的傳統(tǒng)根與根莖入用藥提供了科學(xué)依據(jù)；并且篩選了13個化合物作為鑒別虎杖不同組織的潛在化學(xué)標(biāo)志物，為虎杖不同組織的不同用途提供了化學(xué)依據(jù)，對虎杖藥材資源的進一步開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

3.2 中藥復(fù)方配伍規(guī)律研究

中藥在臨床應(yīng)用中常以單味藥成方或以四氣五味、君臣佐使等藥性搭配成為中藥復(fù)方來發(fā)揮最佳療效，數(shù)千年的實際運用已證實中藥復(fù)方的療效和安全性，但是由于其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和療效機制仍未明了，嚴(yán)重限制了中藥現(xiàn)代化和國際化，代謝組學(xué)的出現(xiàn)為闡明中藥復(fù)方配伍的科學(xué)性提供了一種強有力的方法。

當(dāng)歸四逆湯(DSD)是我國傳統(tǒng)治療血虛寒厥、溫血養(yǎng)經(jīng)的名方，由當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、通草、甘草和大棗七味藥組成，其中當(dāng)歸和桂枝為君藥起到溫經(jīng)驅(qū)寒、活血化瘀等作用，白芍和細(xì)辛為臣藥，甘草和大棗能減輕細(xì)辛、桂枝的副作用，通草能通絡(luò)活血均作為輔助用藥。由于血虛寒厥證病理的復(fù)雜性和當(dāng)歸四逆湯組成的多樣性，使得對其療效機制及其配伍規(guī)律的研究比較困難。WU等[70]將48只大鼠分為對照組、模型組、當(dāng)歸四逆湯組、除去君藥組(NJ)、除去臣藥組(NC)、除去輔助用藥組(NZ)6組，連續(xù)給藥2周后取血進行分析測定，發(fā)現(xiàn)DSD組的全血黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著降低，這兩項指數(shù)評價DSD對于血瘀證的治療效果最好；然后使用UPLC-Q-TOF/MS法對血清樣品在正負(fù)離子模式下的代謝譜進行分析，得到結(jié)論：經(jīng)DSD及治療后，血瘀證模型大鼠的代謝特征趨向于對照組，篩選出20種成分作為血瘀證的潛在生物標(biāo)志物并鑒定出13種代謝物；給藥DSD后9種生物標(biāo)志物被調(diào)節(jié)(2種未鑒定)，調(diào)節(jié)途徑主要是調(diào)控了甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、膽汁酸生物合成和丙酮酸代謝的功能障礙；NJ組對血瘀證有一定的治療效果，但與DSD組相比有5種代謝物均未被調(diào)節(jié)，表明君藥當(dāng)歸和桂枝組調(diào)節(jié)的是異常的甘油磷脂代謝和花生四烯酸代謝；NC組對血瘀證有一定的治療效果，但與DSD組相比有5種代謝物未被調(diào)控，表明臣藥白芍和細(xì)辛主要調(diào)控的是甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝和丙酮酸代謝的失調(diào)；NZ組相比于DSD組有5種代謝物未被調(diào)節(jié)，表明輔助用藥通草、大棗和甘草調(diào)節(jié)了甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝和丙酮酸代謝。以上結(jié)果顯示DSD對血瘀證的療效均優(yōu)于其他組，并且通過多種中藥和多種活性成分同時作用于多個靶點，證實了中藥的君臣佐使理念的正確性。該方法利用代謝組學(xué)平臺，發(fā)現(xiàn)了血瘀證相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，并使用拆方法來揭示DSD的各味藥的協(xié)同作用和調(diào)控機制，證實了代謝組學(xué)是闡明中藥復(fù)方配伍規(guī)律的有效方法。甘遂-甘草是2000年前中藥理論“中藥十八反”之一，因為它們合用時會產(chǎn)生毒性，而中藥方劑甘遂半夏湯包含了甘遂和甘草以及半夏和芍藥共四味藥，CUI等[76]從代謝組學(xué)的角度研究了甘遂-甘草配伍對肝、腎毒性的作用及甘遂半夏湯的減毒作用；共鑒定甘遂甘草肝毒性和腎毒性生物標(biāo)志物20種，芍藥的添加通過磷脂代謝、脂肪酸代謝、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、鞘脂代謝、花生四烯酸代謝和磷酸肌醇代謝途徑減弱了配伍不相容中藥甘遂-甘草的肝毒性和腎毒性，證明了甘遂半夏湯的減毒作用。馬榮等[77]基于代謝組學(xué)方法研究厚樸遠志配伍對大鼠尿液中代謝物的影響，借以探討厚樸緩解遠志所致胃腸動力障礙的療效機制，共鑒定出16個特征代謝標(biāo)志物并對特征代謝標(biāo)志物進行通路分析，發(fā)現(xiàn)酪氨酸代謝、色氨酸代謝、初級膽汁酸生物合成和維生素B6可能是厚樸配伍遠志緩解遠志所致胃腸動力障礙的主要相關(guān)代謝通路。

3.3 生物標(biāo)志物研究

生物體是一個統(tǒng)一和動態(tài)的系統(tǒng)，其體內(nèi)的代謝系統(tǒng)會保持在一種動態(tài)平衡的狀態(tài)。運用代謝組學(xué)平臺可以定量檢測生物體內(nèi)的代謝情況變化，鑒定證候相關(guān)的生物標(biāo)志物并確定其所涉及的代謝通路。陰虛證(YDS)是一種中醫(yī)學(xué)常見的亞健康狀態(tài)，病因復(fù)雜。YU等[80]應(yīng)用代謝組學(xué)方法分析健康對照組、YDS組和知母治療組三組大鼠血清代謝產(chǎn)物，比較發(fā)現(xiàn)YDS大鼠處于高能量消耗狀態(tài)，其雄性激素、免疫系統(tǒng)活性和能量代謝均顯著增加，并鑒定了6種代謝物作為YDS的潛在生物標(biāo)志物，為YDS的診斷和治療提供了參考。LIN等[83]基于代謝組學(xué)平臺，使用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對脾陽虛證(SYDS)患者和健康志愿者的血漿代謝譜進行了比較分析，共成功鑒定出15個代謝物作為SYDS的潛在生物標(biāo)志物，分析結(jié)果表明SYDS患者存在明顯的亞油酸代謝紊亂情況導(dǎo)致的能量代謝障礙，還可能存在如花生四烯酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及類固醇激素合成等代謝紊亂，為 SYDS的診斷和理解SYDS病理機制提供了一種方法。使用代謝組學(xué)方法研究傳統(tǒng)中醫(yī)證候發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物，為中醫(yī)證候的診斷及中藥方劑療效評價提供了新的方法，也為中醫(yī)治療提供了新的靶點。

3.4 中藥復(fù)方作用機制研究

從古至今，在中醫(yī)的臨床治療中常常使用中藥復(fù)方進行治療，因此研究治療病證的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和療效機制必須以完整的中藥復(fù)方進行研究。DU等[84]通過連續(xù)20天給雄性大鼠腹腔注射氫化可的松建立腎陽虛證模型，研究大鼠腎上腺和睪丸組織的代謝譜以探討龜齡集對于腎陽虛證大鼠的治療作用，從腎上腺組織中和睪丸組織中分別確定了19種和31種代謝物作為腎陽虛證大鼠的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)服用龜齡集后，大鼠的體重、行為指標(biāo)和生化指標(biāo)較模型組增加，腎上腺和睪丸組織的形態(tài)異常得到了改善，發(fā)現(xiàn)龜齡集通過調(diào)節(jié)類固醇激素的生物合成、抗氧化劑和抗氧化劑的平衡以及能量的獲取起到對腎陽虛證大鼠的保護作用。WU等[85]通過綜合代謝組學(xué)研究麝香保心丸(SBP)對急性心肌梗死(AMI)大鼠模型的潛在保護機制，通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立AMI大鼠模型，分析給藥SBP后的大鼠血清、尿液、糞便和心臟組織代謝組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)不同組織的代謝譜存在顯著差異，共鑒定出217種代謝產(chǎn)物，AMI引起氨基酸代謝、甘油磷脂代謝和嘧啶代謝的全面代謝變化，SBP逆轉(zhuǎn)了一半以上的差異代謝變化，主要影響氨基酸代謝、丁酸代謝和甘油磷脂代謝，進一步分析發(fā)現(xiàn)SBP可顯著改變AMI相關(guān)的6種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物(5-羥基吲哚乙酸、甘油磷酸膽堿、PS(20∶4/0∶0)、黃嘌呤核苷、腺苷和L-苯丙氨酸)的代謝活性，表明SBP可通過調(diào)節(jié)氨基酸、脂質(zhì)和能量代謝途徑有效保護心臟功能。馮彥等[86]基于16S rRNA基因測序和代謝組學(xué)方法，探討逍遙散低極性部位對慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激 (CUMS)大鼠的抗抑郁作用機制，一共從盲腸內(nèi)容物中鑒定出20種抑郁癥的生物標(biāo)志物，逍遙散低極性部位干預(yù)后可回調(diào)17種，涉及的通路為亞油酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、初級膽汁酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝，并且顯著回調(diào)了CUMS模型大鼠腸道微生物中羅思氏菌屬 (Rothia)、普雷沃氏菌屬 (Prevotella)等腸道菌群，推斷逍遙散低極性部位可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成及盲腸內(nèi)容物的代謝物及通路發(fā)揮抗抑郁作用。中藥代謝組學(xué)為中醫(yī)證候的客觀診斷、療效評價和作用機制闡明提供了一種新的視角，成為了國際上研究中藥復(fù)方的通用方法。

4 總結(jié)與展望

中藥被運用于臨床的預(yù)防和治療時，往往因其多靶點、多成分等特性給藥效機制研究帶來困難。中藥代謝組學(xué)以“中藥-證候-生物標(biāo)志物-藥效機制”的對應(yīng)關(guān)系從生物體整體的角度出發(fā)，通過對體內(nèi)總體代謝物的分析來揭示疾病的生物標(biāo)志物及病理機制和中藥及中藥復(fù)方的藥效機制[92]，用現(xiàn)代科學(xué)方法解釋了傳統(tǒng)中藥的藥效機理和配伍規(guī)律，為中醫(yī)藥國際化提供了一個重要的方法。

從目前的應(yīng)用來看，LC-MS技術(shù)已廣泛用于中藥代謝組學(xué)中并以分析時間短、準(zhǔn)確度高等獨特的優(yōu)勢得到越來越多研究者的認(rèn)可。目前比較先進的LC-MS技術(shù)(如UPLC-Q-TOF-MS)尤其適用于多種化學(xué)成分的非靶向化合物和未知化合物篩選，為探索中藥多組分活性成分的協(xié)同作用、藥物在分子水平上發(fā)揮藥效的機制提供了可能。從目前的應(yīng)用來看，該方法還存在著如下的一些不足：①實際測定時由于不同實驗室使用的實驗條件的差異，即使差異相對較小會導(dǎo)致液相色譜保留時間和質(zhì)譜圖的重復(fù)性差[93]，因此對化合物的鑒定是LC-MS的難題之一；②大樣本的代謝組學(xué)研究需要更加快速、穩(wěn)定、重復(fù)性更高的分析方法，從而更加準(zhǔn)確地定性定量分析代謝譜；③微量樣本的代謝組學(xué)研究需要發(fā)展超高靈敏度的檢測方法以實現(xiàn)代謝物的廣泛覆蓋；④準(zhǔn)確定性的代謝物仍需結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過對多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合才能獲得所傳達出的生物學(xué)信息。對以上存在的不足進行改良和創(chuàng)新會是LC-MS技術(shù)未來的發(fā)展方向。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，代謝物與機體整體的功能狀態(tài)之間的聯(lián)系也會被人們更加了解。伴隨LC-MS技術(shù)的進一步發(fā)展和成本降低以及代謝組學(xué)研究的更加完善，將LC-MS技術(shù)與中藥代謝組學(xué)更有機地結(jié)合起來會成為促進中藥現(xiàn)代化的重要方法。