飼用有機(jī)硒的制備及硒含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

彭軼楠，季 彬，鞏曉芳，穆永松，葉 澤，杜津昊，席 鵬，王治業(yè)

（1.甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；2.甘肅華瑞農(nóng)業(yè)股份有限公司，甘肅民樂 734502）

酵母是一種營(yíng)養(yǎng)保健為一體的生物活性添加劑，廣泛應(yīng)用于飼料中（付雙喜，2001），其可富集微量元素，具有穩(wěn)定性，能與飼料中其他成分很好地協(xié)同配伍，可避免飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的流失（肖競(jìng)等，2004)。酵母硒已被當(dāng)作天然硒源添加到飼料中，研究證明，酵母硒對(duì)畜禽硒的補(bǔ)充效果比硒酸鈉鹽高3～6 倍（白曉婷，2005）。硒酵母中除富含硒外，還含有易被畜禽吸收的必需氨基酸、維生素和礦物元素等各種營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育，縮短飼養(yǎng)期，節(jié)約精飼料（Bronzetti 等，2001），有效提高反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵功能（Wei 等，2019；Genther 等，2015），促進(jìn)反芻動(dòng)物泌乳功能（Sun 等，2017；呼顯生等，2012），提高肉產(chǎn)品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值（郭璐等，2020；劉阿云，2019）。

酵母細(xì)胞可以將通過硫代謝途徑進(jìn)入細(xì)胞的SeO32+轉(zhuǎn)化成硒代小分子有機(jī)化合物，包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒甲基半胱氨酸（Kieliszek等，2016）。硒代蛋氨酸被認(rèn)為是酵母硒中有機(jī)硒的主要形式（Kelly 等，1995），與無機(jī)硒相比，具有生物利用率高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物生產(chǎn)中，相同的添加水平可起到更為顯著的效果（張少濤等，2020；郭永清等，2019）。硒代蛋氨酸具有抗氧化作用，可提高畜禽硒的利用率（Kang 等，2015；袁施彬，2007），增加體內(nèi)抗體水平，從而促進(jìn)免疫功能（徐偉風(fēng)等，2018；Carlson 等，2011），具有抗腫瘤和防治心血管疾?。╖hao 等，2007；Waters 等，2003）等功效。

本試驗(yàn)通過研究不同時(shí)間添加不同濃度硒對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響，初步確定適宜的硒添加時(shí)間和添加濃度范圍，測(cè)定酵母細(xì)胞總硒和細(xì)胞內(nèi)蛋白硒，進(jìn)一步明確硒添加時(shí)間和添加量與酵母富集硒含量的關(guān)系。利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法HPLCMS 法測(cè)定酵母細(xì)胞硒代氨基酸的含量，旨在探明硒濃度對(duì)酵母細(xì)胞硒代氨基酸含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YEPD）：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL，pH 自然，121 ℃高壓滅菌20 min。

裂解液：50 mmol/L 磷酸二氫鈉，1 mmol/L EDTA-2Na，5%甘油，pH 7.4。

磷酸緩沖鹽（PBS）緩沖液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，溶于900 mL 雙蒸水中，鹽酸調(diào)pH 至7.4，加水定容至1000 mL，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和設(shè)備 亞硒酸鈉、硝酸、高氯酸、乙腈、3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（DBA）均為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、蛋白胨、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、甲酸、甲苯、硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1100 高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司）、6410 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（美國(guó)安捷倫公司），恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒），振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅），紫外分光光度計(jì)（上海普析），超聲破碎儀（寧波新芝），水浴鍋（上海赫田），電熱恒溫干燥箱（廣州康恒），冷凍高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 將菌種接于固體斜面YEPD 培養(yǎng)基活化24 h 后，取一環(huán)于YEDP 液體培養(yǎng)基搖瓶中，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 作為活化的菌種。

1.3.2 硒添加濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響 配制亞硒酸鈉溶液，經(jīng)過濾除菌后添加至無菌YEPD 液體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中Se2+濃度分別為0、10、15、20、30、40 mg/L，酵母菌以1%接種量分別接種于含Se2+的YEPD 培養(yǎng)基中，溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)期間，采用分光光度計(jì)法，每6 h 于波長(zhǎng)600 nm 條件下測(cè)定不同Se2+濃度培養(yǎng)液的OD600nm值，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 硒添加時(shí)間對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響 酵母菌以1%接種量接種于YEPD 培養(yǎng)基中，分別在0、2、4、6、8、10 h 添加無菌亞硒酸鈉溶液，使培養(yǎng)基Se2+終濃度為20 mg/L，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min 條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)期間，采用上述方法測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm值，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 硒含量的測(cè)定 采用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法測(cè)定硒含量（婁興丹等，2017）。將含硒溶液添加于100 mL 燒杯中，加水補(bǔ)至40 mL。加入適量2 mol/L 甲酸，使溶液pH 為2.0～3.0，加入5% EDTA-2Na 溶液4 mL 掩蓋干擾離子。再加入0.5% 3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（DBA）溶液2 mL，搖勻后放置65 ℃恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)30 min。取出后用濃氨水調(diào)節(jié)pH 為7.0～7.5，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入10 mL 甲苯萃取，劇烈振蕩2 min，靜置3～4 min 待分層，棄水層，將甲苯層通過脫脂棉過濾到試管中待用。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)420 nm 處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3 次，計(jì)算吸光度的平均值，采用甲苯做空白對(duì)照。

1.3.5 酵母總硒含量的測(cè)定 稱取烘干的含硒酵母0.1 g 于燒杯中，加入10 mL 混酸溶液（硝酸：高氯酸=4：1，V/V），在電熱板上加熱消解，直至溶液變?yōu)橥该鞯S色為止，倒入25 mL 容量瓶，加去離子水補(bǔ)足，每次取10 mL 溶液作為待測(cè)樣品。測(cè)定方法同1.3.4，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品單位硒含量，計(jì)算公式為：

單位硒含量/（μg/g）=標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣液的硒濃度（μg/mL）×樣液體積（mL）/樣品質(zhì)量（g）；

總硒含量/（μg/L）=菌體生物量（g/L）×單位硒含量（μg/g）。

1.3.6 酵母生物量的測(cè)定 將酵母發(fā)酵液于轉(zhuǎn)速為5000 r/min 條件下離心20 min，收集菌體沉淀，用無菌蒸餾水洗3 次，將菌體沉淀放置烘箱85 ℃烘干至恒重，稱重記錄。

1.3.7 酵母硒蛋白的提取 稱取烘干的含硒酵母1.0 g，加入15 mL 裂解液中，振蕩混勻后，在冰浴條件下超聲30 min（30 W，20 KHz）后，在4 ℃條件下10000 r/min 離心20 min 收集沉淀，加入硫酸銨溶液直至飽和，在4 ℃條件下10000 r/min 離心10 min，將沉淀溶解到PBS 緩沖液，置于透析袋中，于去離子水中透析去除殘余硫酸銨，收集透析后的蛋白液為待測(cè)樣液。

1.3.8 酵母細(xì)胞硒代氨基酸的測(cè)定 采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）法對(duì)硒蛋白進(jìn)行分析，色譜工作條件：ZORBAX 300A SB-C 18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫20 ℃；流動(dòng)相為20%水＋80% 乙腈，流動(dòng)相水和乙腈中各含0.1%甲酸；流速為200 μL/min；進(jìn)樣量為10 μL。質(zhì)譜工作條件：電噴霧離子電離源，正離子電離方式，電離電壓3850 V；霧化器為高純氮?dú)?；離子源溫度300 ℃；霧化器壓力為300 psi；毛細(xì)管電壓為3800 V，掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒的添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響 不同硒濃度對(duì)酵母的生長(zhǎng)有很大影響。從圖1 可以發(fā)現(xiàn)，隨著硒濃度增加，酵母菌OD600nm值逐漸減小，表明硒濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)具有抑制效果。當(dāng)硒的濃度為10、15 mg/L 和20 mg/L 時(shí)，酵母OD600nm值接近，硒濃度為30 mg/L 和40 mg/L 時(shí)，OD600nm值明顯降低，表明培養(yǎng)基中硒濃度為10、15 mg/L和20 mg/L 時(shí)，對(duì)酵母的生長(zhǎng)影響最小。

圖1 不同濃度硒含量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.2 硒添加時(shí)間對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響 在培養(yǎng)基中分別在不同時(shí)間添加硒濃度為20 mg/L，對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響見圖2，隨著加硒時(shí)間的增加，酵母生長(zhǎng)具有正效應(yīng)。0～4 h 為酵母生長(zhǎng)適應(yīng)期，在0、2 h 和4 h 加硒對(duì)酵母生長(zhǎng)影響較大，其中0 h和2 h 加硒酵母OD600nm值最??；4～12 h 為酵母生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，在6、8 h 和10 h 加硒酵母生長(zhǎng)OD600nm值均較大，說明加硒時(shí)間在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)對(duì)酵母生長(zhǎng)影響最小。

圖2 不同加硒時(shí)間對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.3 不同時(shí)間添加不同濃度硒對(duì)酵母富集硒的影響 培養(yǎng)基中添加硒不僅對(duì)酵母生物量產(chǎn)生影響，對(duì)酵母富集硒也具有影響。表1 表明，隨著硒濃度的增加，酵母均表現(xiàn)出生物量降低，酵母總硒含量增加，酵母中蛋白硒含量增加的趨勢(shì)，說明雖然硒對(duì)酵母的生長(zhǎng)有相對(duì)抑制作用，但酵母對(duì)硒的富集能力有所增強(qiáng)，表現(xiàn)為酵母細(xì)胞總硒和細(xì)胞內(nèi)蛋白硒含量增加。當(dāng)硒添加量為20 mg/L 時(shí)，酵母富集硒含量最高。

表1 不同時(shí)間添加不同濃度硒對(duì)酵母富集硒的影響

隨著加硒時(shí)間的增加，酵母也均表現(xiàn)出生物量增加，酵母總硒含量降低，酵母中蛋白硒含量降低的規(guī)律，說明較晚時(shí)間添加硒雖然有益于酵母生長(zhǎng)，但酵母富集硒含量卻明顯降低，當(dāng)在6 h 添加硒時(shí)，酵母總硒和細(xì)胞內(nèi)蛋白硒含量最高。由于在6～12 h 為酵母生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，因此選擇在6 h為最佳添加硒時(shí)間。

2.4 酵母細(xì)胞中硒代氨基酸的測(cè)定 提取酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)透析后采用HPLC-MS 聯(lián)用儀測(cè)定硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代甲基半胱氨酸。質(zhì)譜掃描在m/z184、198 和337 分別出現(xiàn)硒代甲基半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的信號(hào)峰，經(jīng)過計(jì)算得到各氨基酸含量（表2）。在培養(yǎng)基中添加不同濃度硒，酵母經(jīng)過富集后細(xì)胞內(nèi)三種硒代氨基酸的含量均有明顯升高，進(jìn)一步說明酵母細(xì)胞具有富集硒的能力，并在細(xì)胞內(nèi)將無機(jī)的亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為硒代氨基酸，外源無機(jī)硒含量增加，促進(jìn)酵母細(xì)胞將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為硒代氨基酸。硒濃度為10、15 mg/L 和20 mg/L 時(shí)，均為硒代蛋氨酸含量最高，其次為硒代胱氨酸，硒代甲基半胱氨酸含量最低，外源硒的添加主要促進(jìn)了酵母細(xì)胞內(nèi)硒代蛋氨酸的形成，是酵母細(xì)胞內(nèi)含量最高的硒代氨基酸。從表中可以看出，硒添加濃度為20 mg/L 時(shí)，三種硒代氨基酸含量均為最高，該濃度為最佳添加量。

表2 不同硒添加量對(duì)硒代氨基酸含量的影響 μg/g

3 討論

酵母菌具有來源廣泛、繁殖周期短、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的特點(diǎn)，是較好的微量元素富集載體菌種（白曉婷，2005）。酵母菌富集微量元素硒，是指將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，便于動(dòng)物機(jī)體吸受。酵母富集硒的能力受培養(yǎng)過程中硒的添加量、硒添加時(shí)間及發(fā)酵條件等的影響（丁嵐峰等，2009）。李勤等（2009）和孫海云等（2007）研究硒對(duì)酵菌生長(zhǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，微量的硒對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，然而過量的硒會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)并且隨著硒濃度的增加抑制作用不斷增強(qiáng)。Stabnikova 等（2008）研究酵母富集硒指出，在培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉5 mg/L 不會(huì)對(duì)酵母生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，10 mg/L時(shí)酵母生長(zhǎng)受到抑制，酵母菌析出紅色的單質(zhì)硒，稱為紅硒現(xiàn)象。石?。?013）研究表明，發(fā)酵液中硒濃度低于10 mg/L 時(shí)對(duì)酵母生長(zhǎng)沒有影響，大于該濃度時(shí)酵母生長(zhǎng)受到抑制。吳梅（2016）發(fā)現(xiàn)，硒添加濃度為15 μg/mL 時(shí)開始變紅，且富硒能力較強(qiáng)，當(dāng)添加量到20 μg/mL 時(shí)，酵母的顏色變成磚紅色，說明亞硒酸鈉抑制酵母的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中結(jié)果與上述結(jié)論相似，硒濃度高于20 mg/L 時(shí)，酵母菌OD600nm值減小，說明菌株生長(zhǎng)受到抑制，硒濃度為20 mg/L 時(shí)，酵母總硒含量和細(xì)胞內(nèi)蛋白硒含量均高于10 mg/L 和15 mg/L 硒濃度。

在發(fā)酵初期添加亞硒酸鈉會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)，過晚添加會(huì)影響硒的富集量，微生物發(fā)酵的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期是酶活性和代謝水平旺盛的時(shí)期，該時(shí)期細(xì)胞吸收能力最強(qiáng)，隨著細(xì)胞增殖富硒能力也隨之增強(qiáng)。Wang 等（2010）研究酵母富硒能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加硒的最佳時(shí)間是生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。吳競(jìng)等（2012）發(fā)現(xiàn)，在酵母生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期8 h 添加亞硒酸鈉，有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率高于其他添加時(shí)間。楊麗華等（2006）建議在對(duì)數(shù)期添加硒，有助于提高酵母生物量和富硒量。本試驗(yàn)在0、2、4、6、8、10 h 添加相同濃度硒，在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期6～10 h 酵母OD600nm值高于穩(wěn)定期0～4 h，說明在對(duì)數(shù)期添加硒適宜酵母生長(zhǎng)；通過測(cè)定酵母富集硒含量發(fā)現(xiàn)，在6 h添加硒時(shí)，酵母總硒含量和細(xì)胞內(nèi)蛋白硒含量最高，結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果相同。

富硒酵母中硒沉積在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、氨基酸和蛋白質(zhì)中，其中主要與氨基酸絡(luò)合成蛋白質(zhì)，包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代甲基半胱氨酸。這些硒蛋白毒性小，生物利用率高，是動(dòng)物獲得硒的主要來源，對(duì)富硒酵母含硒蛋白的研究主要集中在硒代蛋氨酸（謝小雪等，2020）。Whanger（2002）研究酵母富集硒發(fā)現(xiàn)，酵母硒中硒代蛋氨酸含量為23%～63%，硒代胱氨酸含量為13%～21%，硒代甲基半胱氨酸含量為6%～20%。朱昌雄（2007）對(duì)酵母菌誘變后進(jìn)行富硒研究，結(jié)果為誘變株細(xì)胞內(nèi)硒代蛋氨酸含量為1650 μg/g。高愈希等（2013）采用反相離子對(duì)高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定富硒酵母中硒代蛋氨酸含量為921.04 μg/g，硒代半胱氨酸含量為15.41 μg/g。本試驗(yàn)通過HPLC-MS 聯(lián)用法，測(cè)定不同時(shí)間添加不同濃度硒條件下酵母細(xì)胞硒蛋白含量，其中酵母培養(yǎng)6 h 后添加20 mg/L 硒，最終酵母細(xì)胞內(nèi)硒代蛋氨酸含量為1044.57 μg/g，硒代胱氨酸含量108.33 μg/g，硒代甲基半胱氨酸含量72.2.1 μg/g。硒代蛋氨酸含量最高，這與其他學(xué)者研究結(jié)果一致，但是各氨基酸含量差異較大，可能的原因是菌種和培養(yǎng)環(huán)境不同。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，加硒時(shí)間為6、8、10 h 和加硒濃度為10、15、20 mg/L 時(shí)，酵母生長(zhǎng)較好。采用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法測(cè)定酵母總硒和細(xì)胞內(nèi)蛋白硒含量，表現(xiàn)出隨加硒時(shí)間的增加，酵母生物量增加，總硒和蛋白硒含量降低，隨加硒濃度的增加，酵母生物量降低，總硒和蛋白硒含量增加的規(guī)律。最佳加硒時(shí)間6 h，最佳濃度20 mg/L時(shí)，酵母總硒含量為1566.30 μg/g，細(xì)胞內(nèi)蛋白硒含量為1336.82 μg/g。通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）法測(cè)定酵母細(xì)胞內(nèi)硒代氨基酸含量進(jìn)一步確定加硒濃度與硒代氨基酸的關(guān)系，隨著加硒濃度的增加，硒代氨基酸含量隨之增加，且均表現(xiàn)為硒代蛋氨酸含量最高，加硒濃度為20 mg/L 時(shí)，硒代蛋氨酸含量為1044.57 μg/g，硒代胱氨酸含量為108.33 μg/g，硒代甲基半胱氨酸含量為72.21 μg/g。