江成英,劉曉蘭,王 松
(1.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院,廣西梧州 543000;2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)
玉米蛋白粉是玉米加工后的具有高能量、高蛋白質(zhì)的副產(chǎn)品,常作為一種飼料資源在畜禽飼料中使用(楊露等,2018)。但其氣味特殊、口感不好、水溶性差、缺乏必需氨基酸等缺點(diǎn),導(dǎo)致畜禽對(duì)玉米蛋白質(zhì)的利用率相對(duì)較低,從而限制了其在飼料中的應(yīng)用(趙謀明等,2019)。對(duì)玉米蛋白粉進(jìn)行加工處理,提高其蛋白的水溶性是解決這一問題的關(guān)鍵。目前,常用處理方法有物理法、酶解法和微生物法。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶類能夠?qū)⒌鞍追壑须y以被吸收利用的植物大分子蛋白質(zhì)降解為分子質(zhì)量較小的多肽、小肽或游離氨基酸,從而提高其蛋白的利用率(向麗蓉等,2019)。王念祥等(2009)利用好食脈孢霉發(fā)酵玉米蛋白粉,使蛋白粉的蛋白質(zhì)溶出率達(dá)到25.31%。魏炳棟等(2017)研究表明,利用復(fù)合菌發(fā)酵玉米蛋白粉后,其粗蛋白質(zhì)、多肽和總必需氨基酸含量均明顯增加。王松等(2019)采用紫外誘變的方法,篩選出一株枯草芽孢突變菌株,可將玉米蛋白粉飼料中的可溶性蛋白轉(zhuǎn)化率由原始菌株的37.39%提高到47.83%。
本試驗(yàn)以添加一定比例麩皮的玉米蛋白粉為原料,進(jìn)行多菌種混合固態(tài)發(fā)酵飼料的制備,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用4 因素3 水平的響應(yīng)面分析法,優(yōu)化發(fā)酵工藝,為玉米蛋白粉發(fā)酵飼料的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
1.1 菌種 枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌均由齊齊哈爾大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 原料 玉米蛋白粉:中糧生化能源(龍江)有限公司提供;麩皮:市售。
1.3 試劑 酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、氯化鈉、酚酞、鎢酸鈉、鹽酸、酵母粉、鉬酸鈉、磷酸、胰蛋白胨、硫酸鋰、液溴、葡萄糖、瓊脂等試劑均購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。
1.4 主要儀器 SYQ-DSK-280B 型手提式壓力滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),TU-1810 型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津儀器廠),PHS-25 型數(shù)顯pH 計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),ZHJH-C2109C 型超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器有限公司),BS224S 型電子天平(北京賽多利斯儀器廠),PYX-DHS-40×50-BS-I 型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)等。
1.5 試驗(yàn)方法
1.5.1 可溶性蛋白含量的測(cè)定 采用福林酚法測(cè)定可溶性蛋白含量(王永華,2010)。
1.5.2 單因素試驗(yàn) 將玉米蛋白粉與麩皮以一定比例混合,于121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫后接入混合菌種(枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以1∶1∶1 的比例混合)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,通過測(cè)定發(fā)酵物料中的可溶性蛋白含量研究物料比、料水比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)發(fā)酵飼料的影響。
1.5.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)原理,以可溶蛋白含量為響應(yīng)值,使用Design-Expert8.0.5 軟件,選取料水比(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)及發(fā)酵時(shí)間(D)為自變量,采用4 因素3 水平的響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化,以確定最佳的發(fā)酵工藝條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。
表1 試驗(yàn)因素與水平
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7:3 混合,料水比為1:1.1,于121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于30 ℃進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,48 h 后每隔12 h 檢測(cè)發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表2。
表2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)可溶性蛋白含量的影響
2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7:3 混合,料水比為1:1.1,于121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫后接入5%的混合菌種分別于28、30、32、34 ℃進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,84 h 后檢測(cè)發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表3。
表3 發(fā)酵溫度對(duì)可溶性蛋白含量的影響
2.1.3 物料比對(duì)可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮分別以4:6、5:5、6:4、7:3、8:2 的比例混合,料水比為1:1.1,于121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于32 ℃進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,84 h 后檢測(cè)發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表4。
表4 物料比(玉米蛋白粉:麩皮)對(duì)可溶性蛋白含量的影響
2.1.4 接種量對(duì)可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7:3 的比例混合,料水比為1:1.1,于121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫后分別接入1%、5%、8%、10%、15%的混合菌種于32 ℃進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,84 h 后檢測(cè)發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表5。
表5 接種量對(duì)可溶性蛋白含量的影響
2.1.5 料水比對(duì)可溶性蛋白含量的影響 將玉米蛋白粉與麩皮以7:3 的比例混合,料水比分別為1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6,于121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫后接入5%的混合菌種于32 ℃進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,84 h 后檢測(cè)發(fā)酵底物中的可溶性蛋白含量。結(jié)果見表6。
由單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出,可溶性蛋白含量最高的單因素條件分別為:物料比7:3,料水比1:1.2,發(fā)酵時(shí)間84 h,發(fā)酵溫度32 ℃,接種量15%。但15%接種量與5%接種量的可溶性蛋白提高不是很大,綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素,初步確定多菌種固態(tài)發(fā)酵玉米蛋白飼料的工藝條件為:物料比(玉米蛋白粉:麩皮)7:3,料水比1:1.2,發(fā)酵時(shí)間84 h,發(fā)酵溫度32 ℃,接種量5%。
2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝
2.2.1 模型的建立與顯著性分析 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計(jì),選取原料物料比例為7∶3、混菌比例為1∶1∶1,以料水比例(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時(shí)間(D)為影響因子,以可溶蛋白含量(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn),以優(yōu)化發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的工藝參數(shù),結(jié)果見表7。
表7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果
采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型方差分析,結(jié)果見表8。
表8 回歸模型方差分析
用Design-Expert.V8.0.5 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸方程擬合,獲得以感官評(píng)分為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸擬合方程:
Y=12.56 +1.11A +0.25B +0.098C +0.30D +0.13AB-0.055AC-0.025AD+0.080BC-0.035CD-0.29A2-0.034B2+0.051C2-0.31D2。
由表8 可知,用響應(yīng)面法建立的二次回歸模型極顯著(P <0.0001),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0892>0.05),說明所得模型擬合程度較好,該回歸模型能夠很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)B、一次項(xiàng)D、二次項(xiàng)A2和二次項(xiàng)D2為顯著(P <0.05),一次項(xiàng)A 為極顯著(P <0.01),交互項(xiàng)不顯著(P >0.05)。各因素對(duì)發(fā)酵玉米蛋白粉飼料可溶蛋白含量的影響強(qiáng)弱次序?yàn)榱纤壤ˋ)>發(fā)酵時(shí)間(D)>接種量(B)>發(fā)酵溫度(C)。
2.2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果 各因素交互作用對(duì)可溶性蛋白影響的響應(yīng)面圖見圖1。
圖1 各因素交互作用對(duì)可溶性蛋白影響的響應(yīng)面
2.2.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證結(jié)果 經(jīng)Design-Expert8.0.5 軟件優(yōu)化處理后,得到發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的最佳工藝條件為:原料物料比例7∶3、混菌比例1∶1∶1、料水比例1:1.3、接種量6%、發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時(shí)間87.08 h。
為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的可行性,將響應(yīng)面優(yōu)化方案修約后的工藝條件進(jìn)行3 組平行發(fā)酵試驗(yàn),3 個(gè)試驗(yàn)組發(fā)酵飼料中可溶蛋白含量平均值可以達(dá)到13.77%,與理論預(yù)測(cè)值13.8894%的相對(duì)誤差為0.85%,與試驗(yàn)結(jié)果相符。
以多菌種組合進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵玉蛋白粉飼料的制備,通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)確定了最佳發(fā)酵工藝條件為:將玉米蛋白粉與麩皮以7:3 的比例混合,料水比為1:1.3,于121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫后接入6%的混合菌種(枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌以1∶1∶1 的比例混合),于33 ℃條件下固態(tài)發(fā)酵87.08 h。在此條件下,發(fā)酵飼料中可溶蛋白含量可達(dá)13.77%,可用于發(fā)酵玉米蛋白粉生產(chǎn)飼料。