基于“自洽調(diào)節(jié)”的葛根異黃酮類(lèi)成分對(duì)葛根素溶解性及滲透性影響研究

管詠梅，萬(wàn)鑫浩，鄒 斌，吳文婷，陳麗華，朱衛(wèi)豐

基于“自洽調(diào)節(jié)”的葛根異黃酮類(lèi)成分對(duì)葛根素溶解性及滲透性影響研究

管詠梅，萬(wàn)鑫浩，鄒 斌，吳文婷*，陳麗華，朱衛(wèi)豐*

江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

基于中藥整體觀，以葛根自身作為整體，考察葛根異黃酮類(lèi)成分對(duì)葛根素溶解度及滲透性的調(diào)節(jié)作用，探討單味中藥所含成分發(fā)揮作用時(shí)的“自洽性”。選取葛根中3種高含量黃酮類(lèi)成分3′-羥基葛根素、大豆苷元和染料木苷，設(shè)計(jì)人工多成分環(huán)境，采用平衡溶解度的研究方法考察pH 7.4磷酸鹽緩沖液中多成分環(huán)境下葛根素溶解度的變化；采用在體單向腸灌流模型考察葛根異黃酮類(lèi)成分對(duì)葛根素腸吸收的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同成分背景、不同成分組合及其不同比例的3′-羥基葛根素、大豆苷元、大豆苷和染料木苷對(duì)葛根素溶解度與滲透性均有一定的影響。采用遞進(jìn)式進(jìn)行2成分及3成分背景的溶解度研究，表明葛根素溶解度和滲透性變化均存在“疊加性”和“飽和性”的特點(diǎn)，溶解性方面：以葛根自身成分為整體，在水溶液體系中各異黃酮類(lèi)成分對(duì)葛根素溶解度提高了42.60%，在pH 7.4緩沖液體系中提高了18.62%。滲透性方面：葛根素的腸滲透性具有“疊加效應(yīng)”。以葛根自身成分為整體，主要異黃酮類(lèi)成分3′-羥基葛根素、染料木苷及大豆苷元對(duì)葛根素的腸滲透系數(shù)表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficients，app）、腸吸收速率常數(shù)（absorptive promoter，a）、腸吸收分?jǐn)?shù)（intestinal absorption fraction，a）分別提高220%、236%、213%，即對(duì)葛根素的腸滲透性提升了約220%。以上研究表明，葛根異黃酮類(lèi)成分在人體作用時(shí)可能存在“疊加效應(yīng)”，葛根素在葛根自身多組分環(huán)境中具有部分“自洽性”，從而改善了葛根素生物利用度。

葛根異黃酮；溶解性；滲透性；疊加效應(yīng)；自洽調(diào)節(jié)；自洽性；葛根素；大豆苷元；染料木苷；單向腸灌流

從生態(tài)學(xué)的角度出發(fā)，相互聯(lián)系的成分才能構(gòu)成一個(gè)整體，因此，中藥整體觀在開(kāi)展中藥相關(guān)研究中的重要性逐漸凸顯，一味地追求單體化合物而忽視中藥的多組分/多成分整體作用是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，不僅中藥復(fù)方如此，單味中藥亦如此，均離不開(kāi)整體作用的特點(diǎn)[1]，且這種整體作用不僅表現(xiàn)在臨床療效上，也會(huì)表現(xiàn)在發(fā)揮療效的前端性質(zhì)（如溶解性、滲透性等理化性質(zhì)）上。中藥自有成分之間必然存在某些相互作用，一種成分對(duì)另一種成分的性質(zhì)極有可能產(chǎn)生抑制或促進(jìn)的作用，進(jìn)而決定中藥整體表現(xiàn)出來(lái)的物性或藥性，這在自然界屬于邏輯合理，可認(rèn)為是物體在自然界存在的“自洽性”。

藥物從口服到起效必先經(jīng)過(guò)溶解和吸收2個(gè)過(guò)程，而多成分是中藥臨床使用的基本特征[2]，因此某單一成分的溶解和吸收極大可能會(huì)受到多成分環(huán)境的影響，從而影響其體內(nèi)行為并影響生物利用度。葛根為豆科植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根，習(xí)稱野葛，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源的植物[3]。葛根素是其主要生物活性成分之一，具有廣泛的藥理效應(yīng)[5]，然而，葛根素屬BCS分類(lèi)系統(tǒng)IV類(lèi)化合物[4]，具有低水溶性和脂溶性，腸滲透性差，限制了其臨床應(yīng)用。本課題組在前期文獻(xiàn)研究[5]中發(fā)現(xiàn)愈風(fēng)寧心片中葛根素的生物利用度較低，但愈風(fēng)寧心片臨床確有其效。另有研究者考察了葛根提取物中黃豆苷元、染料木素對(duì)葛根素小腸吸收的影響，發(fā)現(xiàn)二者均能促進(jìn)葛根素的吸收、抑制外排[6]，也有學(xué)者對(duì)比考察了葛根提取物給藥與單體給藥時(shí)葛根素的體內(nèi)吸收效果差異[7]，發(fā)現(xiàn)提取物給藥的腸吸收效果優(yōu)于單體給藥，且葛根提取物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)在高劑量給藥時(shí)優(yōu)于葛根素[8]。綜上，可推測(cè)多成分環(huán)境背景對(duì)葛根素的溶解性與滲透性有著重要影響。目前，單一成分的溶解和滲透研究已經(jīng)有了較成熟的評(píng)價(jià)體系與研究方法，而以中藥自身為整體，研究多成分環(huán)境下某一成分溶解及吸收情況的研究仍舊少見(jiàn)，值得深入研究[9]。

中藥整體性可分為3個(gè)層次：第1層是單體成分，為中藥組成的基本單元；第2層是組分，是指結(jié)構(gòu)相似的單體成分按一定比例構(gòu)成的單元；第3層是提取物，是指不同的組分按一定比例構(gòu)成的集合體。因此，本研究選取葛根黃酮類(lèi)組分的3種高含量成分[10]，即3′-羥基葛根素、大豆苷元及染料木苷設(shè)計(jì)人工多成分環(huán)境，采用遞進(jìn)式方法，考察黃酮類(lèi)組分中的其他成分對(duì)葛根素溶解度及滲透性的影響規(guī)律，為后期葛根整體表征及多元釋藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供依據(jù)，也可為其他含有異黃酮類(lèi)組分的中藥間成分的溶解和吸收相互作用提供參考和借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CAP225型十萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius公司；Waters2695型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters科技有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；SIGMA3-18K型高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；QYC-200型恒溫?fù)u床，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EPED型超純水儀，南京易普達(dá)科技發(fā)展有限公司；BT100-1F型恒流泵，保定蘭格恒流泵有限公司；DL28-1000mL型移液槍?zhuān)?guó)Eppendorf公司；Vortex-Genius3型渦旋儀，德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司。

1.2 藥物

葛根素對(duì)照品，批號(hào)110752-201615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.4%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品3′-羥基葛根素（批號(hào)CHB170224，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%）、染料木苷（批號(hào)CHB170223，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%）、大豆苷元（批號(hào)CHB180717，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%），成都克洛瑪生物科技有限公司；原料藥葛根素原料（批號(hào)17112806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.4%）、3′-羥基葛根素（批號(hào)18102401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%）、染料木苷（批號(hào)18101603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%）、大豆苷元（批號(hào)17122504，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%），成都普菲德生物科技有限公司。

1.3 試劑

甲醇，乙腈，色譜純，美國(guó)Tedia公司；超純水，南京易普達(dá)科技發(fā)展有限公司；磷酸二氫鉀、鹽酸、氫氧化鈉，西隴科學(xué)股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，湖南斯萊景克達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK（贛）2017-0004。大鼠飼養(yǎng)和使用等符合中國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循江西中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶解度實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溶液的配制

（1）pH 7.4緩沖液配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液395 mL稀釋定容至1000 mL，即得。

（2）葛根素對(duì)照品溶液制備：精密稱取葛根素對(duì)照品10.27 mg于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.027 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取質(zhì)量濃度為1.027 mg/mL的葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度為154.05mg/mL的對(duì)照品溶液。

（3）空白對(duì)照品溶液制備：吸取甲醇溶劑適量，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.2 色譜條件 Silversil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5mm）；以乙腈-水（85∶15）為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10mL。

2.1.3 方法學(xué)考察 實(shí)驗(yàn)建立了溶解度溶液中葛根素含量測(cè)定方法，專(zhuān)屬性試驗(yàn)表明，空白對(duì)照品溶液與各供試品溶液不會(huì)對(duì)葛根素測(cè)定產(chǎn)生干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1；線性范圍考察結(jié)果表明，葛根素在4.81～154.05mg/mL與其峰面積呈良好的線性關(guān)系；精密度試驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素日內(nèi)、日間精密度良好，日內(nèi)、日間精密度RSD值分別為3.72%和1.58%；重復(fù)性、穩(wěn)定性均符合規(guī)定；回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，高、中、低質(zhì)量濃度的平均回收率分別為95.23%、100.30%、98.67%，均符合規(guī)定。

A-空白對(duì)照品溶液 B-葛根素對(duì)照品溶液 C-葛根素＋3′-羥基葛根素供試品溶液 D-葛根素＋染料木苷供試品溶液 E-葛根素＋大豆苷元供試品溶液

2.1.4 固定比例下單體成分對(duì)葛根素溶解度的影響葛根中3′-羥基葛根素約占葛根素的15.08%，染料木苷約占葛根素的2%，大豆苷元約占葛根素的3%[10]。精密稱取葛根素原料適量，加入上述配比的3′-羥基葛根素原料、染料木苷原料及大豆苷元原料，置10 mL具塞試管中（平行3份），分別加入適量pH 7.4緩沖液，將試管置于恒溫振蕩器中，溫度保持（37±1）℃持續(xù)振蕩24 h，靜置后離心，取上清液，稀釋至適宜質(zhì)量濃度后過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行HPLC分析，色譜圖見(jiàn)圖1。

研究表明[9]葛根素在pH 7.4緩沖液中溶解度最高，在pH 7.4緩沖液中葛根素解離型所占比例增加，使實(shí)驗(yàn)測(cè)定的誤差減少，同時(shí)考慮到葛根素在體腸吸收實(shí)驗(yàn)中所用Krebs-Ringer’s緩沖液（K-R液）pH為7.4（腸道生理環(huán)境），2部分實(shí)驗(yàn)所選擇的pH背景應(yīng)保持一致，故選pH 7.4緩沖液為研究環(huán)境?？疾旄鸶S酮組分中4大主要成分（3′-羥基葛根素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷）與葛根素按照組分內(nèi)成分間比例組合后葛根素的溶解度變化情況。結(jié)果（表1）表明，在溶劑pH 7.4的緩沖液中，15.08% 3′-羥基葛根素、2%染料木苷、3%大豆苷元和18.24%大豆苷均能增加葛根素的溶解度，分別增加了11.06%、6.92%、2.13%和5.18%，可見(jiàn)組分內(nèi)3′-羥基葛根素對(duì)葛根素的促溶解效果最佳。

2.1.5 梯度比例下單體成分對(duì)葛根素溶解度的影響基于葛根中各成分比例，進(jìn)行各成分加入梯度比例實(shí)驗(yàn)。精密稱取葛根素原料適量，分別加入梯度比例為2%、5%、10%、20%、30%的3′-羥基葛根素原料、染料木苷原料及大豆苷元原料，精密稱取葛根素原料適量，加入上述配比的3′-羥基葛根素原料、染料木苷原料及大豆苷元原料，置10 mL具塞試管中（平行3份），分別加入適量pH 7.4緩沖液，將試管置于恒溫振蕩器中，溫度保持（37±1）℃持續(xù)振蕩24 h，靜置后離心，取上清液，稀釋至適宜濃度后過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行HPLC分析。

表1 pH 7.4緩沖液中加入不同比例單體成分后對(duì)葛根素溶解度的影響(, n = 3)

與葛根素組比較：*＜0.05**＜0.01，影響比＝(加入不同比例單體成分后葛根素溶解度－葛根素原始溶解度)/葛根素原始溶解度，下表同

*< 0.05**< 0.01puerarin group, influence ratio = (solubility of puerarin after adding different proportions of monomer components－original solubility of puerarin)/original solubility of puerarin, same as below tables

在pH 7.4的緩沖液中，考察組分內(nèi)各主要成分按梯度比例（2%、5%、10%、15%、20%、30%）加入后對(duì)葛根素溶解度的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著3′-羥基葛根素投入梯度比的增加，葛根素溶解度逐漸增加，分別提高了0.16%、2.57%、5.36%、11.07%、11.52%和12.22%，如表2所示。

隨著染料木苷梯度比例的增加，葛根素的溶解度也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，葛根素溶解度分別提高了6.92%、8.34%、11.73%、11.24%、11.71%、17.82%，如表3所示。

而加入大豆苷元時(shí)，葛根素溶解度分別提高了2.13%、?2.06%、?3.51%、?29.79%、?34.21%和?24.80%，呈現(xiàn)出先升后降再升的趨勢(shì)，當(dāng)投入比例為20%時(shí)，葛根素溶解度降至最低，如表4所示。

表2 pH 7.4緩沖液中不同梯度比例3′-羥基葛根素對(duì)葛根素溶解度的影響(, n = 3)

表3 pH 7.4緩沖液中不同梯度比例染料木苷對(duì)葛根素溶解度的影響(, n = 3)

表4 pH 7.4的緩沖液中不同梯度比例大豆苷元對(duì)葛根素溶解度的影響(, n = 3)

按照梯度，逐漸增加大豆苷的比例，葛根素的溶解度先增后降。葛根素溶解度分別增加了1.95%、1.88%、3.17%、5.13%、6.08%、4.72%，見(jiàn)表5。

以實(shí)驗(yàn)中各成分的加入比例為橫坐標(biāo)（），實(shí)驗(yàn)結(jié)果葛根素溶解度為縱坐標(biāo)（），采用Excel 2010對(duì)表2～4進(jìn)行1元2次或1元3次多項(xiàng)式回歸模型擬合。結(jié)果表明，在pH 7.4緩沖液體系中，按照梯度，逐漸增加3′-羥基葛根素、染料木苷、大豆苷元和大豆苷的比例后，葛根素溶解度的變化趨勢(shì)符合多次項(xiàng)回歸方程。具體見(jiàn)表6。

表5 pH 7.4緩沖液體系中不同梯度大豆苷比例對(duì)葛根素溶解度的影響(, n = 3)

表6 pH 7.4緩沖液體系中葛根素溶解度試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合方程

2.1.6 多成分組合對(duì)葛根素溶解度的影響 參考文獻(xiàn)方法[10]，可知葛根中以葛根素為對(duì)象，3′-羥基葛根素約占葛根素的15.08%，染料木苷約占葛根素的2%，大豆苷元約占葛根素的3%。精密稱取葛根素原料適量，加入上述配比的3′-羥基葛根素原料、染料木苷原料及大豆苷元原料，同“2.1.4”項(xiàng)描述方法進(jìn)行在pH 7.4緩沖液中溶解度考察。

以葛根黃酮組分中各成分比例為基準(zhǔn)，考察2種或3種成分與葛根素組合后葛根素溶解度的變化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時(shí)加入15.08% 3′-羥基葛根素和2%染料木苷后，葛根素溶解度提高了13.0%；同時(shí)加入15.08% 3′-羥基葛根素和3%大豆苷元后，葛根素溶解度提高了8.7%；同時(shí)加入2%染料木苷和3%大豆苷元2種成分后，葛根素溶解度提高了16.79%。此外，當(dāng)3種成分（15.08% 3′-羥基葛根素、3%大豆苷元、2%染料木苷）同時(shí)與葛根素組合時(shí)，葛根素溶解度也提高了18.60%，見(jiàn)表7。

2.2 腸吸收實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溶液的配制

（1）葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液制備：精密稱取葛根素對(duì)照品10.15 mg，適量溶出介質(zhì)溶解并定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為1.015 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

表7 pH 7.4緩沖液中加入不同比例多種成分后對(duì)葛根素溶解度的影響(, n = 3)

（2）葛根素原料藥儲(chǔ)備液制備：取葛根素原料藥302.89 mg，精密稱定，用適量甲醇溶解，再用K-R液定容至100 mL量瓶，搖勻，即得質(zhì)量濃度為3.028 9 mg/mL的原料藥儲(chǔ)備液。同法制成含大豆苷元1.013 mg/mL、染料木苷1.063 mg/mL、3′-羥基葛根素1.060 mg/mL的原料藥儲(chǔ)備液。

（3）Kreb-Ringer’s營(yíng)養(yǎng)液（簡(jiǎn)稱K-R液）的制備：稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，CaCl20.37 g，葡萄糖1.4 g，加入超純水定容至1 L，即得。經(jīng)測(cè)定，K-R液pH值為7.4。

（4）空白腸灌流液的配制：取K-R液適量，取禁食16 h（不禁水）的SD大鼠，10%水合氯醛溶液麻醉，手術(shù)剪在腹部開(kāi)3～4 cm小口，并從胃幽門(mén)下1 cm處開(kāi)始小心分離出待考察的腸段，取腸段約10 cm，于兩端切小口，插管結(jié)扎，注意腸段小心放平并盡可能避免卷曲和扭結(jié)。用事先預(yù)熱至（37.0±0.5）℃的生理鹽水緩慢的將腸道內(nèi)容物沖洗干凈，再用空氣將生理鹽水排空。用等滲生理鹽水浸濕的紗布覆蓋以保持腸組織的生理活性，并定時(shí)補(bǔ)滴生理鹽水以維持，于紅外燈下使大鼠保持體溫。試驗(yàn)時(shí)取一定質(zhì)量濃度的含藥腸灌流液［預(yù)熱至（37.0±0.5）℃］灌流，將體積流量調(diào)至0.2 mL/min，預(yù)平衡30 min后，進(jìn)口處用已知質(zhì)量的裝有含藥腸灌流液的小瓶進(jìn)行灌流，體積流量0.2 mL/min，在出口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集流出液，即得。

（5）各含藥灌流液的制備：①葛根素灌流液的制備：精密吸取葛根素原料藥儲(chǔ)備液1 mL，用K-R液稀釋并定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為30.289mg/mL的灌流液。②葛根素＋3′-羥基葛根素灌流液的制備：精密吸取葛根素原料藥儲(chǔ)備液適量，按照梯度比例（2%、5%、10%、20%、30%）加入3′-羥基葛根素原料藥儲(chǔ)備液，用K-R液稀釋并定容至100 mL，即得。③同法制成葛根素＋大豆苷元灌流液、葛根素＋染料木苷灌流液。

2.2.2 色譜條件 同“2.1.2”項(xiàng)。

2.2.3 方法學(xué)考察 實(shí)驗(yàn)建立了腸灌流液中葛根素含量測(cè)定方法，專(zhuān)屬性試驗(yàn)表明，空白腸灌流液與各供試品溶液不會(huì)對(duì)葛根素測(cè)定產(chǎn)生干擾，結(jié)果見(jiàn)圖2；進(jìn)行了線性范圍考察，結(jié)果表明葛根素在6.34～203.00mg/mL線性關(guān)系良好；精密度試驗(yàn)結(jié)果表明葛根素日內(nèi)、日間精密度良好（日內(nèi)、日間精密度RSD值分別為0.34%和0.29%）；重復(fù)性、穩(wěn)定性均符合規(guī)定；回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素高、中、低質(zhì)量濃度樣品的平均回收率分別為93.97%、90.92%、89.06%，均符合規(guī)定。

A-空白腸灌流液 B-葛根素腸灌流液 C-空白腸灌流液加葛根素對(duì)照品

2.2.4 大鼠在體單向腸灌流試驗(yàn)步驟 有研究表明葛根素在十二指腸吸收最好[11]，故實(shí)驗(yàn)選取十二指腸為考察腸段。取禁食16 h（不禁水）的SD大鼠，質(zhì)量濃度10%水合氯醛溶液麻醉（3.4 mL/kg），沿腹中線打開(kāi)腹腔，小心分離出待考察的腸段，取腸段約10 cm，于兩端切口插管結(jié)扎，插管后將腸段小心放平，盡可能避免卷曲和扭結(jié)。用預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水將腸道內(nèi)容物沖洗干凈，在用空氣將生理鹽水排空。用等滲生理鹽水覆蓋以保持腸組織的生理活性，于紅外燈下使大鼠保持體溫。實(shí)驗(yàn)時(shí)取一定質(zhì)量濃度的含藥腸灌流液（預(yù)熱至37 ℃）灌流，將體積流量調(diào)至0.2 mL/min，預(yù)平衡30 min后，進(jìn)口處用已知質(zhì)量的裝有含藥腸灌流液的小瓶進(jìn)行灌流，體積流量0.2 mL/min，在出口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集（每隔15 min同時(shí)迅速更換下一個(gè)含藥腸灌流液小瓶和收集液小瓶），稱定質(zhì)量，計(jì)算灌入和收集的藥液質(zhì)量。分別從上述藥液中各吸取0.5 mL，置于已知質(zhì)量的小錐形瓶中，稱定質(zhì)量，求算藥液密度。實(shí)驗(yàn)后，測(cè)定腸段的長(zhǎng)度，小心攤放避免拉伸。取腸灌流液1 mL于1.5 mL離心管中，離心10 min（12 000 r/min），取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按照“2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄葛根素峰面積，計(jì)算各個(gè)時(shí)間段腸段灌流液樣品中葛根素的含量。

2.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用重量法對(duì)腸灌流液流入和流出的體積進(jìn)行校正，并計(jì)算表觀滲透系數(shù)（app）、腸吸收速率（a）及腸吸收分?jǐn)?shù)（a）[11]。

in＝in/in

out＝out/out

app＝?·ln(outout/inin)/2π

a＝(1－outout/inin)/π2

a＝1－outout/inin

in和out分別為腸道進(jìn)出口灌流液的質(zhì)量（g），in和out分別為腸道進(jìn)出口灌流液的密度（g/mL），in和out分別為腸段灌入的灌流液和收集液的體積（mL）；和分別為灌流腸段的長(zhǎng)度（cm）和橫截面半徑（cm）；為腸道灌流液的體積流量（0.2 mL/min）；in和out分別為灌流液和收集液的葛根素質(zhì)量濃度（g/mL）

2.2.7 固有比例下單體成分對(duì)葛根素滲透性的影響 考慮大豆苷在腸道會(huì)轉(zhuǎn)化為大豆苷元，故在腸吸收考察中，以葛根黃酮類(lèi)組分中各成分比例為基準(zhǔn)，考察葛根素灌流液中分別加入15.08% 3′-羥基葛根素、2%染料木苷和3%大豆苷元后葛根素滲透性的變化，考查和計(jì)算的指標(biāo)主要是與吸收特征相關(guān)的關(guān)鍵特征指標(biāo)，包括app、a、a，如表8所示。研究發(fā)現(xiàn)，3′-羥基葛根素分別提高了葛根素的app、a、a至單體的1.23、1.27、1.23倍。然而，染料木苷對(duì)葛根素的app基本無(wú)影響，卻降低了葛根素的a，僅將a提高了1.10倍。而3%大豆苷元對(duì)葛根素的app、a基本無(wú)影響，僅提高了a1.21倍。

表8 加入不同比例單體成分后對(duì)葛根素腸吸收(吸收參數(shù))的影響(, n = 5)

2.2.8 不同梯度比例單體成分對(duì)葛根素滲透性的影響 考察組分內(nèi)各主要成分按不同梯度比例（2%、5%、10%、15%、20%、30%）加入后對(duì)葛根素滲透性的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2% 3′-羥基葛根素略微降低了葛根素的a，對(duì)app和a基本無(wú)影響，但隨著3′-羥基葛根素加入比例的增加，葛根素的app、a和a呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，當(dāng)加入比例為5%、10%、20%和30%時(shí)，app分別為葛根素單體的1.12、1.34、1.64、1.69倍，a為原來(lái)的1.17、1.44、1.75、1.71倍，a則為1.00、1.20、1.28、1.48倍，如表9所示。其中，加入20%的3′-羥基葛根素后葛根素的app顯著增加（＜0.05）且a極顯著增加（＜0.01）；30% 3′-羥基葛根素也顯著增加了葛根素的app（＜0.01）和a（＜0.05）。當(dāng)加入大豆苷元的比例為2%、5%、10%、20%、30%時(shí)，app分別提高為單體的1.08、1.19、1.29、1.27、1.62倍，a分別是葛根素單體的1.20、1.31、1.41、1.34、1.77倍，a分別是葛根素的a的1.02、1.01、1.07、1.03、1.24倍，如表10所示，其中30%大豆苷元極顯著提高了葛根素的app和a（＜0.01），顯著提高了a（＜0.05）。當(dāng)按梯度比例加入染料木苷后，app分別是葛根素單體的0.96、1.14、1.26、1.27、1.30倍，a分別是葛根素單體的1.1、1.34、1.35、1.49、1.40倍，a分別是原來(lái)的0.85、1.01、1.13、1.07、1.17倍，見(jiàn)表11。

2.2.9 多成分組合對(duì)葛根素滲透性的影響 以葛根黃酮組分中各成分比例為基準(zhǔn)，在葛根素灌流液中分別加入2成分及3成分比例即15.08% 3′-羥基葛根素＋2%染料木苷、15.08% 3′-羥基葛根素＋3%大豆苷元、3%大豆苷元＋2%染料木苷和15.08% 3′-羥基葛根素＋3%大豆苷元＋2%染料木苷（即2、3、4、5組），考察多成分組合對(duì)葛根素滲透性的影響。結(jié)果顯示，與葛根素組相比，第2、3、4、5組均顯著增加了葛根素的app（＜0.05），分別增加為葛根素單體的2.17、1.77、1.88和2.20倍；更顯著地增加了葛根素的a（＜0.05），分別增加了2.27、1.94、2.05和2.36倍；2、3、4組雖然對(duì)葛根素的a有所增加，為葛根素單體的1.71、1.48、1.71倍，但無(wú)顯著差異，僅第5組顯著增加了葛根素的a（＜0.05），為葛根素單體的a的2.13倍。具體見(jiàn)表12。

表9 不同梯度比例3′-羥基葛根素對(duì)葛根素腸吸收(吸收參數(shù)) 的影響(, n = 5)

表10 不同梯度比例大豆苷元對(duì)葛根素腸吸收(吸收參數(shù))的影響(, n = 5)

表11 不同梯度比例染料木苷對(duì)葛根素腸吸收(吸收參數(shù))的影響(, n = 3)

3 討論

3.1 葛根異黃酮成分對(duì)葛根素溶解度的調(diào)節(jié)作用分析

單味中藥葛根的黃酮組分中的3′-羥基葛根素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷都對(duì)葛根素的溶解度有著不同程度的影響。研究發(fā)現(xiàn)如果遵循組分內(nèi)成分間的固有比例組合，4種單體成分均能增加葛根素的溶解度，尤其是3′-羥基葛根素的促溶效果最佳，且按照組分結(jié)構(gòu)組合的2種或3種成分環(huán)境對(duì)葛根素也產(chǎn)生促溶作用。

表12 加入多種成分比例后對(duì)葛根素腸吸收(吸收參數(shù))的影響(, n = 5)

但當(dāng)遞進(jìn)式考察各成分不同比例對(duì)葛根素的影響時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)隨著大豆苷元投料比例上升，葛根素的溶解度反而下降，而另外3種對(duì)葛根素的促溶效果會(huì)隨著投料比例增加而更顯著。上述結(jié)果一定程度地說(shuō)明了單味中藥整體的重要性?？紤]到葛根素pa1約為7.4[12]，根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程[13]，葛根素在pH 7.4緩沖液中，其解離型與未解離型的比例約為1∶1，通常葛根素在弱酸條件下以疏水分子形式為主，而在弱堿性條件下則更傾向以親水分子形式存在。據(jù)此推測(cè)產(chǎn)生上述結(jié)果的原因是與各成分調(diào)節(jié)了葛根素可能與解離型葛根素產(chǎn)生某種離子效應(yīng)而調(diào)節(jié)了葛根素的解離從而改變了葛根素溶解度，或通過(guò)調(diào)節(jié)葛根素所處環(huán)境的酸堿度并改變其在溶液中的分子形式，且這種調(diào)節(jié)作用與環(huán)境分子的投入比例及種類(lèi)有關(guān)系，具體機(jī)制需要開(kāi)展深入研究。

3.2 葛根異黃酮成分對(duì)葛根素滲透性的調(diào)節(jié)作用分析

研究結(jié)果表明葛根素的腸滲透性較低，app僅為1.266×10?5cm/s，這與文獻(xiàn)研究結(jié)果[13]一致。發(fā)現(xiàn)單一成分加入到葛根素灌流液中，僅3′-羥基葛根素有促進(jìn)葛根素十二指腸吸收的效果，而大豆苷元與染料木苷對(duì)葛根素吸收基本無(wú)影響，僅當(dāng)投入比例增加時(shí)才表現(xiàn)出對(duì)葛根素的促吸收效果。當(dāng)加入2種成分或3種成分時(shí)，發(fā)現(xiàn)2種成分或3種成分對(duì)葛根素的腸滲透性具有“疊加效應(yīng)”，從結(jié)果看疊加的促滲透效果更好，具有顯著差異，此結(jié)果將對(duì)后期課題組設(shè)計(jì)葛根多元釋藥提供依據(jù)。有文獻(xiàn)表明葛根素吸收機(jī)制為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，但也有學(xué)者[14-15]認(rèn)為葛根素的吸收機(jī)制并不是單一的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究也表明在組分環(huán)境下，葛根素的a與a變化很大，尤其當(dāng)同時(shí)加入3種成分時(shí)，a在1.739×10?4～4.104×10?4s?1變化，a在3.27%～6.95%變化，推測(cè)多成分環(huán)境中的某些成分很可能對(duì)外排蛋白或相關(guān)酶有影響，使得等濃度葛根素的腸吸收過(guò)程中a與a變化很大。

3.3 葛根異黃酮組分“自洽性”探討

綜合上述葛根素溶解度和腸吸收的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)若遵循葛根異黃酮組分中各成分的固有比例，葛根異黃酮中其他成分對(duì)葛根素的溶解度和滲透性都有一定程度的促進(jìn)作用，可見(jiàn)，葛根自有成分對(duì)主要活性成分葛根素的理化性質(zhì)存在著正調(diào)節(jié)作用。但是葛根黃酮類(lèi)組分中的成分較多，本研究?jī)H涉及葛根黃酮成分中3種黃酮類(lèi)成分對(duì)葛根素溶解度和腸吸收的影響，未探討其他黃酮類(lèi)成分的影響；再者，本研究只限于黃酮類(lèi)組分內(nèi)部，并未探討黃酮類(lèi)組分以外的組分比如多糖類(lèi)組分對(duì)葛根素溶解及腸吸收的影響，也未探討不同組分間的相互作用及影響規(guī)律。此外，課題組認(rèn)為，中藥自有成分間的“自洽性”可能同時(shí)包括正、負(fù)調(diào)節(jié)作用，如王娟等[16]、余丹等[17]、宋敏等[18]及Chang等[19]課題組的研究，丹參水溶液中的其他成分能促進(jìn)丹參素的分布和消除，促進(jìn)丹酚酸B的吸收并降低其在體內(nèi)的消除速率，而丹酚酸B又能顯著增加丹參素在大鼠血漿中的暴露程度。因此，充分研究中藥自有成分間的調(diào)節(jié)作用并闡釋中藥成分間的“自洽性”對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)中藥有著不可估量的作用。

根據(jù)“自洽性”可從葛根自身成分/組分的溶解度及滲透性等維度展開(kāi)研究，建立多成分/組分體系可能是改善葛根素生物利用度的途徑之一，以提高葛根素生物利用度為目標(biāo)針對(duì)性地對(duì)不同成分/組分進(jìn)行釋藥單元設(shè)計(jì)，從而開(kāi)發(fā)多元復(fù)方釋藥體系，有助于闡釋中藥整體觀的科學(xué)內(nèi)涵。

4 展望

中藥自有成分間的“自洽性”既符合生態(tài)合理性，也預(yù)示著其應(yīng)用于現(xiàn)代制劑開(kāi)發(fā)的無(wú)限可能性。目前解決中藥單體生物利用度低的問(wèn)題，常用的制劑技術(shù)主要是通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾或現(xiàn)代藥劑學(xué)手段改善葛根素單體的溶解性（水溶性或脂溶性）以提高口服生物利用度[20-21]。

本研究給現(xiàn)代中藥制劑技術(shù)提供了新的研究思路：從調(diào)節(jié)中藥單體自身物理特性的視角出發(fā)，可充分考慮單體所處多成分環(huán)境中其他成分對(duì)其溶解度和滲透性的影響，即放大多成分的協(xié)同作用或合理運(yùn)用成分間的抑制作用，以提高藥物生物利用度為目標(biāo)針對(duì)性地對(duì)不同成分/組分進(jìn)行釋藥單元設(shè)計(jì)，從而開(kāi)發(fā)多元復(fù)方釋藥體系；從中藥單體新型遞藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)的角度切入，可針對(duì)體系的弱點(diǎn)問(wèn)題，如納米遞藥體系載藥穩(wěn)定性差或藥物空間分布不合理等，從中藥自有成分中篩選合適成分設(shè)計(jì)為共載體系以優(yōu)化遞送體系性質(zhì)，并達(dá)到同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥效協(xié)同發(fā)揮的目標(biāo)；此外，還可從體內(nèi)視角深挖，充分利用“自洽性”去調(diào)節(jié)改善單體成分的吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)過(guò)程等。綜上研究思路都將既有助于解決中藥現(xiàn)代制劑研發(fā)等實(shí)際問(wèn)題，也有利于闡釋中藥整體觀的科學(xué)內(nèi)涵。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 劉丹, 郁丹紅, 孫娥, 等. 中藥組分與組分生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)構(gòu)建 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2012, 37(19): 2997-3000.

[2] 劉洋, 翟華強(qiáng), 趙保勝, 等. 多成分藥物代謝學(xué)術(shù)思想在中醫(yī)臨床藥學(xué)研究中的應(yīng)用分析 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2014, 39(7): 1335-1338.

[3] Zhao Y R, Du L D, Zhang L,.[A] //[M]. Singapore: Springer Singapore, 2018: 121-126.

[4] Li H W, Dong L, Liu Y,. Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats [J]., 2014, 466(1/2): 133-138.

[5] 朱衛(wèi)豐, 鄒斌, 管詠梅, 等. 葛根質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)探討分析 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2019, 37(4): 775-777.

[6] 王睿銳, 沈琦. 黃豆苷元、染料木素對(duì)葛根素小腸吸收影響 [J]. 中成藥, 2011, 33(8): 1323-1326.

[7] 范昕. 葛根異黃酮在實(shí)驗(yàn)性大鼠小腸吸收的藥動(dòng)學(xué)研究 [J]. 陜西中醫(yī), 2012, 33(6): 750-752.

[8] 趙潔, 蘇暢, 溫德廣, 等. 葛根素及葛根提取物在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究 [J]. 中國(guó)藥房, 2016, 27(10): 1311-1314.

[9] 侯成波, 汪國(guó)鵬, 張強(qiáng), 等. 中藥生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)中多成分環(huán)境對(duì)葛根素溶解度的影響 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2014, 39(23): 4499-4504.

[10] 尤春雪, 張振秋, 李峰, 等. HPLC波長(zhǎng)切換技術(shù)對(duì)葛根中8種成分的測(cè)定及指紋圖譜研究 [J]. 中草藥, 2013, 44(5): 616-621.

[11] 林文慧, 朱春燕, 陳衛(wèi), 等. 葛根黃酮在大鼠腸道的吸收動(dòng)力學(xué)研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2008, 33(2): 164-168.

[12] 劉西京, 楊大堅(jiān), 羅杰英, 等. 紫外分光光度法測(cè)定葛根素的解離常數(shù) [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2006, 17(11): 2206-2207.

[13] Po H N, Senozan N M. The Henderson-Hasselbalch equation: Its history and limitations [J]., 2001, 78(11): 1499.

[14] Liao Z G, Liang X L, Zhu J Y,. Transport properties of puerarin and effect of extract ofon puerarin intestinal absorption using in situ and in vitro models [J]., 2014, 28(9): 1288-1294.

[15] Li H W, Dong L, Liu Y,. Comparison of two approaches of intestinal absorption by puerarin [J]., 2014, 70(1): 6-11.

[16] 王娟, 馬張慶, 汪五三, 等. 丹參素鈉及丹參注射液在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)比較 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2009, 34(22): 2943-2945.

[17] 余丹, 柴建國(guó), 曹彥光, 等. 丹參注射液中丹酚酸B對(duì)丹參素藥代動(dòng)力學(xué)影響 [J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 40(3): 258-262.

[18] 宋敏, 杭太俊, 張正行. 丹參提取物有效成分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和相互影響研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 42(3): 301-307.

[19] Chang B B, Zhang L, Cao W W,. Pharmacokinetic interactions induced by content variation of major water-soluble components of Danshen preparation in rats [J]., 2010, 31(5): 638-646.

[20] 吳文婷, 鄒斌, 李文棟, 等. 葛根素口服給藥的藥劑學(xué)研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2019, 44(19): 4134-4141.

[21] 喬宏志, 狄留慶, 平其能, 等. 結(jié)構(gòu)中藥學(xué)：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的新領(lǐng)域 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2021, 46(10): 2443-2448.

Effect of isoflavones fromon solubility and permeability of puerarin based on “self-consistent regulation”

GUAN Yong-mei, WAN Xin-hao, ZOU Bin, WU Wen-ting, CHEN Li-hua, ZHU Wei-feng

Key Laboratory of Modern Chinese Medicine Preparations, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

Based on the integrality of traditional Chinese medicine, took Gegen () itself as a whole, the effects of isoflavones fromon the solubility and permeability of puerarin were investigated to discuss “self-consistency” of the compounds within single Chinese medicine.Three high content components in pueraria flavonoid group, including 3′-hydroxypuerarin, daidzein and genistin, were selected to design an artificial multi-component environment. The method of equilibrium solubility was employed to measure the solubility of puerarin in pH 7.4 phosphate buffer. The effects of the pueraria isoflavone on the permeability of puerarin were investigated by means of single-pass intestinal perfusion technique.The results showed that the solubility and permeability of puerarin were affected by different composition backgrounds, different composition combinations and different proportions of 3′-hydroxypuerarin, daidzein, daidzein and genistein. The solubility of two-component and three-component backgrounds was studied by a progressive formula. The results showed that the solubility and permeability of puerarin both had the characteristics of “superposition” and “saturation”. Solubility: Taking the components of pueraria as a whole, the solubility of pueraria was increased by 42.60% by different flavonoids in the aqueous solution system. The increase rate was 18.62% in pH 7.4 buffer liquid system. Permeability: The intestinal permeability of puerarin had a “superposition effect”. The intestinal permeability coefficientsapp,aandaof puerarin were increased by 220%, 236% and 213% respectively by isoflavones 3′-hydroxypuerarin, genitin and daidzein taking the root itself as the whole. That is, the intestinal permeability of puerarin was increased by about 220%.The above studies indicated that the isoflavones from pueraria may have a “superposition effect” in the human body, and pueraria is partially “self-consistent” in the multi-component environment of pueraria itself, thus improving the bioavailability of pueraria.

isoflavones from; solubility; pemeability; superposed effect; self-consistent regulation; self-consistency; puerarin; daidzein; genistein; in-situ single pass intestinal perfusion

R283.6

A

0253 - 2670(2021)23 - 7138 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.008

2021-06-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)（2017YFC1702904）；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助（JXARS-16）；江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（20192BBG70074）

管詠梅，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥新制劑與新技術(shù)及食療學(xué)研究。E-mail: guanym2008@163.com

朱衛(wèi)豐，教授，博士研究生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新制劑研究。E-mail: zwf0322@126.com

吳文婷，講師，從事中藥制劑與工程技術(shù)研究。E-mail: wuwenting0109@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]