MicroRNA-219a-5p和AFAP1L2對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用研究*

劉博，戚誠，趙爽，常曉靜，趙曉東，張立超，劉學(xué)臣，劉斌

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 普外四科，河北 石家莊050052；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊050051；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 放療科，河北 石家莊050052；4.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 普外九科，河北 石家莊050052；5.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊050052；6.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 科研處，河北 保定071030）

胰腺癌在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中預(yù)后是最差的，生存期短，5年生存率< 5%[1]。盡管放療、化療、靶向、手術(shù)等多模式治療有所進(jìn)展，近10年胰腺癌的5年生存率仍無明顯提高，胰腺癌細(xì)胞的惡性增殖、過早發(fā)生轉(zhuǎn)移及浸潤是其生存期不能提高的主要原因之一[2-3]。轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、肺癌、食管癌等伴隨著靶向治療的發(fā)展，5年生存率均得到一定程度的提高，而胰腺癌生存期卻沒有明顯改善[4]。對(duì)胰腺癌早期篩查指標(biāo)的探索，對(duì)進(jìn)展期胰腺癌治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，仍然是提高胰腺癌存活率的主要研究方向[5]。肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白1 相似蛋白2（AFAP1L2）是接頭蛋白的一種,在惡性腫瘤（胃癌、食管癌、肺癌等）中高表達(dá)。本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AFAP1L2 與胰腺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性行為具有相關(guān)性，在胰腺癌中是促癌基因[6]，對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[7]。miRNA 是一種內(nèi)源性小非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后參與細(xì)胞增殖、分化、生長等生物學(xué)行為，大部分負(fù)向調(diào)控下游基因[8]。胰腺癌miR-219 對(duì)胰腺癌細(xì)胞的惡性行為具有負(fù)向調(diào)控作用，但其機(jī)制并不清楚。本研究前期通過生物信息學(xué)預(yù)測顯示，microRNA-219a-5p（miR-219a-5p）與AFAP1L2 3'-UTR 具有堿基互補(bǔ)配對(duì)，兩者可能具有靶向調(diào)控關(guān)系。本研究檢測miR-219a-5p 與AFAP1L2 3'-UTR 在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，并觀察兩者對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的作用，對(duì)兩者可能具有的靶向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，為胰腺癌預(yù)測基因的發(fā)現(xiàn)及治療靶點(diǎn)的預(yù)測提供離體實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（HPDE）及人胰腺癌細(xì)胞株（PANC-1、BXPC-3、SW1990、Capan-1）由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)及傳代。AFAP1L2 山羊多克隆抗體及流式細(xì)胞周期和凋亡檢測試劑盒購自美國Santa Cruz 公司。BCA 定量試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒、DAB 顯色試劑盒、CCK-8 檢測試劑盒購自大連寶生生物技術(shù)有限公司。miR-219a-5p mimics（擬似劑）及miR-219a-5p inhibitor（抑制劑）購自日本TakaRa 公司。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒、miRNA 提取分離試劑盒、Lipofectamine 2000 及RPIM 1640 購自美國Sigma 公司。AFAP1L2 過表達(dá)質(zhì)粒（pCMVEGFP-AFAP1L2 質(zhì)粒）、空載EGFP-質(zhì)粒、引物、野生型引物（wt）及突變型（mut）螢光素酶報(bào)告載體由北京生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。AFAP1L2 正向引物：5'-CCGGACGTAACGACGCATCCG-3'，反向引物：5'-GCCCAGTTCGUUGUGCCACG-3'；miR-219a-5p正向引物：5'-GTTCTTGACAATTAAGACCC-3′，反向引物：5'-CATGATAAGTTCTGCGCTC-3'；β-actin 正向引 物：5'-GCCGATCCGTAACGCTACGGCGC-3'，反 向引物：5'-CCGGACGTTCGACGGCTCCG-3'。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測mRNA 表達(dá)對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行裂解，收集后依照Trizol 操作說明書提取RNA，合成cDNA，對(duì)RNA純度和完整性進(jìn)行檢測。進(jìn)行microRNA 逆轉(zhuǎn)錄，在70℃溫浴10 min 后立即給予冰浴，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄引物及模板退火；PCR 反應(yīng)體系的配置如下：qRT-PCR Master Mix 7.5 ml，2份SYBR Green，引物混合物0.6 ml，H2O 15 ml，cDNA 模板2 ml。進(jìn)行循環(huán)，延伸反應(yīng)條件如下：95℃溫浴2 min，94℃溫浴10 s，55℃溫浴15 s，72℃溫浴10 s，循環(huán)45 次；再次95℃溫浴1 min，60℃溫浴30 s，95℃溫浴30 s。擴(kuò)增曲線以2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)3次取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 Western blotting 法檢測蛋白表達(dá)各組細(xì)胞用PBS 洗滌3 次，收集后離心，棄去上清液，對(duì)裂解后的各細(xì)胞株總蛋白進(jìn)行抽提，常規(guī)BCA 法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，然后對(duì)蛋白樣本上樣，120 V條件下以12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳分離，20 min 后改為90 V 分離90 min，轉(zhuǎn)于PVDF膜，TBST 緩沖液（含5%脫脂奶粉）封閉1.5 h。加Ⅰ抗室溫孵育過夜，TBST 3 次洗膜加Ⅱ抗，37℃孵育1 h，凝膠顯像儀顯像（化學(xué)發(fā)光法）。β-actin 為內(nèi)參，Quantity One 計(jì)量灰度值。

1.2.3 轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞步驟收集對(duì)數(shù)生長期胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行消化，使其成為單細(xì)胞懸液，24 孔板內(nèi)按20×104個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行接種，對(duì)融合度>70%胰腺癌細(xì)胞株以Lipofectamine 2000 操作說明書要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用含10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染完成的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，48 h時(shí)后評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率，繼續(xù)完成下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖收集空白對(duì)照組（NC 組）、pCMV-EGFP-AFAP1L2 組、siAFAP1L2 組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將濃度調(diào)至1×105個(gè)/ml，100 μl 細(xì)胞懸液/孔加入96 孔板，12 h 培養(yǎng)于孵育箱（條件：濕度5%，溫度37℃）。48 h 溫浴后加10 μl 的CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀490 nm 波長處檢測光密度（OD）值，每孔進(jìn)行3 次試驗(yàn)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺癌細(xì)胞周期取胰腺癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)至EP管，PBS 1 ml進(jìn)行洗滌，然后加1 ml 70%的乙醇，以上均需預(yù)冷條件操作，于4℃進(jìn)行24 h固定，1 200 r/min 離心4 min。棄上清，PBS 洗滌。然后用PBS 對(duì)各樣本進(jìn)行重懸，加入30 μl 0.5% PI、15 μl Rnase A（10 mg/ml），4℃下避光溫浴40 min。流式細(xì)胞儀在波長488 nm 處行細(xì)胞周期檢測。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取各組胰腺癌細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，流式細(xì)胞儀設(shè)定條件：Alexa FITC 的最大發(fā)射波長509 nm，最大激發(fā)波長488 nm，PI-DNA復(fù)合物的最大激發(fā)波長535 nm，最大發(fā)射波長615 nm，采集細(xì)胞數(shù)10 000 個(gè)/樣本，以Cell Quest 軟件進(jìn)行凋亡率分析。

1.2.7 螢光素酶法檢測堿基互補(bǔ)配對(duì)miR-219a-5p與AFAP1L2 可能具有靶向調(diào)控關(guān)系，并確定核苷酸47～53 為3'-UTR 的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建商業(yè)化wt-AFAP1L2-Pmir-REPORT 及 mut-AFAP1L2-Pmir-REPORT 熒光素酶報(bào)告載體，將構(gòu)建的載體報(bào)告以X-treme Gene 與miR-219a-5p mimics 共轉(zhuǎn)染到胰腺癌細(xì)胞，miR-219a-5p negative control（NC）組為對(duì)照。共轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)箱內(nèi)以37℃、5% CO2條件下孵育培養(yǎng)48 h，以雙螢光素酶檢測試劑盒對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行檢測。 以wt/mut-AFAP1L2-Pmir-REPORT 與海腎熒光素酶表達(dá)載體活性比例為相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用PASW Statistics 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析或t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-219a-5p、AFAP1L2 在胰腺癌細(xì)胞株及HPDE中R 表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果顯示，在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1、BXPC-3、SW1990、Capan-1 及HPDE 中miR-219a-5p mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.26±0.07）、（0.28±0.08）、（0.58±0.28）、（0.46±0.25）和（1.32±0.57），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.462，P=0.000），在胰腺癌細(xì)胞株中表達(dá)較低。BXPC-3，SW1990 及Capan-1 分別與PANC-1 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SW1990 及Capan-1 分別與BXPC-3 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SW1990 與Capan-1 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1A。

qRT-PCR 及Western blotting 結(jié)果顯示，在胰腺癌 細(xì) 胞 株P(guān)ANC-1、BXPC-3、SW1990、Capan-1 及HPDE中AFAP1L2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.19±0.24）、（0.92±0.29）、（0.97±0.07）、（0.99±0.45）、（0.57±0.16），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.931，P=0.000）；AFAP1L2 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（14.01±0.92）、（13.86±1.32）、（14.59±1.02）、（12.97±0.78）、（8.42±0.91），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.401，P=0.000）。AFAP1L2 蛋白及mRNA 在胰腺癌細(xì)胞株和HPDE 細(xì)胞中表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），胰腺癌細(xì)胞株中表達(dá)較高（P<0.05）；BXPC-3，SW1990 及Capan-1 分別與PANC-1 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SW1990 及Capan-1 分 別 與BXPC-3 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SW1990 與Capan-1 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1B、C。

圖1 miR-219a-5p、AFAP1L2在胰腺癌細(xì)胞株與HPDE中的表達(dá)

2.2 AFAP1L2表達(dá)影響胰腺癌細(xì)胞增殖

CCK-8 法結(jié)果顯示，Capan-1 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，空白 對(duì) 照 組（NC 組）、pCMV-EGFP-AFAP1L2 組、siAFAP1L2 組OD 值分別為（0.387±0.007）、（0.749±0.302）和（0.146±0.081），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.724，P=0.007）。pCMV-EGFP-AFAP1L2 組OD 值高于NC 組和siAFAP1L2 組（P<0.05），NC 組OD 值高于siAFAP1L2 組（P<0.05）。見圖2A。

SW1990 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，NC 組、pCMV-EGFPAFAP1L2 組、siAFAP1L2 組OD 值分別為（0.410±0.082）、（0.673±0.128）和（0.213±0.103），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.159，P=0.000）。pCMV-EGFP-AFAP1L2組OD 值高于NC 組和siAFAP1L2 組（P<0.05），NC 組OD值高于siAFAP1L2組（P<0.05）。見圖2B。

圖2 AFAP1L2對(duì)Capan-1及SW1990細(xì)胞增殖的影響

2.3 miR-219a-5p影響胰腺癌細(xì)胞增殖

CCK-8 法結(jié)果顯示，Capan-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h，miR-NC 組、miR-219a-5p mimics 組、miR-219a-5p inhibitor 組OD 值分別為（0.272±0.031）、（0.105±0.022）和（0.569±0.068），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.017，P=0.009）。miR-219a-5p mimics 組OD 值低于miR-NC 組，miR-219a-5p inhibitor 組高于miR-NC 組（P<0.05）。見圖3A。

SW1990 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，miR-NC 組、miR-219a-5p mimics 組、miR-219a-5p inhibitor 組OD值分別為（0.405±0.035）、（0.255±0.062）和（0.667±0.074），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.363，P=0.012）。miR-219a-5p mimics 組OD 值低于miR-NC 組，miR-219a-5pinhibitor組OD 值高于miR-NC 組。見圖3B。

圖3 miR-219a-5p對(duì)Capan-1及SW1990細(xì)胞增殖的影響

2.4 各組細(xì)胞周期比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，miR-NC組、miR-219a-5p mimics 組、miR-219a-5p inhibitor 組在G1 期、G2 期及S 期的比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。miR-219a-5p mimics 組在G1 期、G2 期及S期的比例分別與miR-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），miR-219a-5p mimics 組G1 期、G2期比例較miR-NC組減少，S 期比例較miR-NC組升高。miR-219a-5p inhibitor 組在G1 期及G2 期比例較miR-219a-5p mimics 組升高，在S 期比例降低。見表1。

表1 各組細(xì)胞周期比較 （%，±s）

注：①與miR-NC 組比較，P<0.05；②與miR-219a-5p inhibitor組，P<0.05。

組別miR-NC組miR-219a-5p mimics組miR-219a-5p inhibitor組F 值P 值G1期80.15±0.94 68.75±1.35①②83.29±0.82 3.340 0.005 G2期9.57±1.29 4.93±1.48①②8.58±0.97 2.920 0.007 S期11.52±1.76 29.28±1.79①②9.47±0.89 11.530 0.001

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，miR-NC 組、miR-219a-5p mimics 組、miR-219a-5p inhibitor組凋亡率分別為（31.02±4.87）%、（16.52±3.19）%、（52.75±6.92）%，3 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.972，P=0.016）。miR-219a-5p mimics 組凋亡率低于miR-NC 組（P<0.05），miR-219a-5p inhibitor 組凋亡率高于miR-NC組（P<0.05）。miR-219a-5p mimics 組凋亡率低于miR-219a-5p inhibitor 組（P<0.05）。

2.6 miR-219a-5p與AFAP1L2 3'-UTR具有堿基互補(bǔ)配對(duì)

通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測分析，確定miR-219a-5p 與AFAP1L2 可能具有靶向調(diào)控關(guān)系，并確定核苷酸47～53 為3'-UTR 的結(jié)合位點(diǎn)。見圖4。

圖4 miR-219a-5p與AFAP1L2 3'-UTR堿基互補(bǔ)配對(duì)

2.7 miR-219a-5p對(duì)AFAP1L2具有調(diào)控作用

miR-219a-5p mimics 轉(zhuǎn) 染Capan-1 細(xì)胞，與miR-NC 組比較，miR-219a-5p mimics 組AFAP1L2 mRNA 及蛋白表達(dá)均下降（P<0.05）（見圖5B、圖6）。給予iR-219a-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染Capan-1 細(xì)胞，與miR-NC組比較，miR-219a-5p inhibitor 組AFAP1L2 mRNA 及蛋白表達(dá)均上升（P<0.05）（見圖7B、圖8）。表明miR-219a-5p負(fù)向調(diào)控AFAP1L2表達(dá)。

圖5 miR-219a-5p mimics轉(zhuǎn)染對(duì)AFAP1L2 mRNA表達(dá)的影響

圖6 miR-219a-5p mimics轉(zhuǎn)染Capan-1細(xì)胞對(duì)AFAP1L2蛋白的影響

圖7 miR-219a-5p inhibitor與AFAP1L2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖8 miR-219a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染Capan-1細(xì)胞對(duì)AFAP1L2蛋白表達(dá)的影響

2.8 miR-219a-5p與AFAP1L2堿基互補(bǔ)配對(duì)

構(gòu) 建 wt-AFAP1L2-pMIR-REPORT 及 mut-AFAP1L2-pMIR-REPORT 熒光報(bào)告載體，將野生型與突變型AFAP1L2 螢光報(bào)告載體與miR-219a-5p mimics 共轉(zhuǎn)染到Capan-1 細(xì)胞，螢光素酶活性檢測結(jié)果顯示，AFAP1L2 野生組miR-NC 及miR-219a-5p mimics 熒光素酶活性分別為（0.69±0.09）和（0.24±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），轉(zhuǎn)染wt-AFAP1L2-pMIR-REPORT 的3'-UTR 端熒光素酶活性下降；AFAP1L2 突變組miR-NC 及miR-219a-5p mimics 熒光素酶活性分別為（0.64±0.11）和（0.61±0.16），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），轉(zhuǎn)染mut-AFAP1L2-pMIR-REPORT 的3'-UTR 端熒光素酶活性無變化。見圖9。

圖9 螢光素酶活性比較

3 討論

細(xì)胞增殖被一系列的檢查點(diǎn)蛋白和細(xì)胞調(diào)控蛋白包括細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期依賴激酶（CDKS）保護(hù)和調(diào)控，細(xì)胞增殖調(diào)控通路的失衡會(huì)導(dǎo)致癌變及癌癥的發(fā)展[9-12]。miRNA 失調(diào)會(huì)通過靶向作用于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子影響細(xì)胞周期，調(diào)控細(xì)胞生長速度，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，并調(diào)控Caspase 水平，凋亡細(xì)胞增加，抑制細(xì)胞生長[12-13]。有研究顯示，miR-219a-5p 通過靶向作用于MRTFa提控乳腺癌細(xì)胞的遷移和表皮間質(zhì)化，在肝癌中，miR-219a-5p 通過靶向作用于GPC3 抑制肝癌細(xì)胞增殖[14-15]。肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白（AFAP）家族是包括AFAP 1、AFAP1L1 和AFAP1L2/XB 130 在內(nèi)的適配器蛋白重要成員，AFAP1L2 肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白和CSRC 激活蛋白，AFAP1L2 可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。有研究表明，AFAP1L2 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，可能通過cAMP-CSRC-磷酸肌醇3 激酶/Akt 途徑發(fā)揮作用[16-18]。在惡性腫瘤中，miRNA 可以對(duì)下游信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，從而介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡及侵襲等惡性行為[19-21]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測分析，miR-219a-5p 與AFAP1L2 可能具有靶向調(diào)控關(guān)系，并確定3'-UTR 的結(jié)合位點(diǎn)。

本研究首先檢測胰腺癌細(xì)胞及HPDE 細(xì)胞中miR-219a-5p 和AFAP1L2 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-219a-5p在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)低于HPDE 細(xì)胞，AFAP1L2 mRNA 及蛋白在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)高于HPDE 細(xì)胞。細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示，AFAP1L2 對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖具有正向調(diào)控作用。miR-219a-5p 表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖具有負(fù)向調(diào)控作用，對(duì)AFAP1L2 及miR-219a-5p 表達(dá)水平的調(diào)控間接驗(yàn)證兩者對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖具有相反作用。另有研究顯示，miR-219a-5p 與腫瘤直徑、組織學(xué)分化程度及肝癌患者總生存時(shí)間具有相關(guān)性，miR-219a-5p抑制肝癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其從G1 期向S 期轉(zhuǎn)化[15]。本研究也顯示，在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)miR-219a-5p表達(dá)，可誘導(dǎo)細(xì)胞S 期阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。本研究為進(jìn)一步研究miR-219a-5p 及AFAP1L2 在胰腺癌細(xì)胞增殖調(diào)控中的機(jī)制，檢測了miR-219a-5p表達(dá)上調(diào)或下調(diào)后AFAP1L2 mRNA 及蛋白水平的變化，結(jié)果顯示，miR-219a-5p 負(fù)向調(diào)控AFAP1L2 表達(dá)，為進(jìn)一步驗(yàn)證兩者是否具有直接的調(diào)控關(guān)系，進(jìn)行螢光素酶活性檢測試驗(yàn)，結(jié)果顯示miR-219a-5p與AFAP1L2 的3'-URT互補(bǔ)結(jié)合，miR-219a-5p 與AFAP1L2 存在直接的靶向調(diào)控關(guān)系。本研究對(duì)miR-219a-5p 及AFAP1L2 在胰腺癌細(xì)胞增殖調(diào)控中機(jī)制的研究結(jié)果顯示，miR-219a-5p 通過調(diào)控AFAP1L2 表達(dá)負(fù)向介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞增殖。HUANG等[15]對(duì)83 例肝癌組織中miR-219a-5p 表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，miR-219a-5p 高表達(dá)的患者腫瘤體積小，組織分化程度高，患者總生存率長，并通過負(fù)向調(diào)控GPC3 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖。LAHDAOUI 等[22]研究顯示，miR-219 的3'-UTR 與MUC4 互補(bǔ)結(jié)合，具有靶向調(diào)控關(guān)系，通過對(duì)MUC4 的直接調(diào)控，激活A(yù)kt 及Erk 信號(hào)通路，影響胰腺癌細(xì)胞遷移及增殖，是抑癌基因。ZHAO 等[23]觀察AFAP1 RNA 對(duì)胃癌的預(yù)測價(jià)值，結(jié)果顯示，AFAP-RNA 與胃癌生存期呈負(fù)相關(guān)，對(duì)胃癌細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。WANG 等[24]認(rèn)為，在肺癌中，AFAP1L1 下調(diào)會(huì)激活Caspase-3 和P38 表達(dá)，抑制PRAS 40 表達(dá)，對(duì)肺癌細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，加速細(xì)胞周期的進(jìn)程，阻止細(xì)胞凋亡。目前在腫瘤研究中沒有miR-219a-5p 對(duì)AFAP1L2 的調(diào)控作用研究。MüLLER 等[25]對(duì)胰腺癌中多個(gè)miRNA 進(jìn)行篩查，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行觀察及預(yù)測，進(jìn)一步評(píng)價(jià)miRNA對(duì)胰腺癌診斷、預(yù)后預(yù)測及治療靶點(diǎn)選擇的意義。本研究結(jié)論為miR-219a-5p 通過靶向調(diào)控AFAP1L2表達(dá)負(fù)向介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞增殖及凋亡。隨著研究的深入，miR-219a-5p 及AFAP1L2 可能成為未來胰腺癌診斷的腫瘤標(biāo)志物及預(yù)測預(yù)后的靶基因。