MicroRNA-181a、SIRT1水平與新生兒急性呼吸窘迫綜合征嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)性*

林勇，束國防，陳名霞，孫曉玄，陸愛珍

（1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū) 兒科，江蘇 南京210044；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京210003；3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū) 檢驗科，江蘇 南京210044；4.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 呼吸科，上海201102）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是肺部或全身性損害因素引起廣泛急性炎癥性肺損傷導(dǎo)致的肺力學(xué)異常和氣體交換障礙，為新生兒重癥監(jiān)護(hù)室（neonatal intensive care unit, NICU）常見危重癥[1]。盡管產(chǎn)前皮質(zhì)類固醇、表面活性劑、高級呼吸護(hù)理等方式極大改善新生兒ARDS 的預(yù)后，但ARDS 仍然是新生兒死亡的重要原因之一，因此早期評估患兒預(yù)后意義重大[2]。炎癥反應(yīng)失控是ARDS 發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理機(jī)制之一[3]。MicroRNA 是一種非編碼小分子RNA，參與了多種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控，能通過影響靶基因表達(dá)調(diào)控炎癥通路，在炎癥反應(yīng)進(jìn)展中扮演重要角色[4]。有研究報道[5]，脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中microRNA-181a（miR-181a）能通過調(diào)節(jié)核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信號通路參與急性肺損傷過程中的過度失控性炎癥反應(yīng)。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（silent information regulator factor 2-related enzyme 1, SIRT1）為Ⅲ類組蛋白去乙?；?，SIRT1 表達(dá)下調(diào)能通過激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 促進(jìn)急性肺損傷的炎癥反應(yīng)。目前尚無研究報道m(xù)iR-181a 和SIRT1 與ARDS新生兒病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。本研究分析ARDS 新生兒血清miR-181a、SIRT1 水平變化，探討兩者與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月—2021年7月東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)收治的162 例ARDS 患兒為ARDS組。其中，男性92 例，女性70 例；日齡1～7 d，平均（4.18±1.08）d；體重1 200～4 000 g，平均（3 000.82±253.15） g；致病原因：膿毒癥17 例、早產(chǎn)48 例、肺炎40 例、胎糞吸入39 例、其他原因18 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《“新生兒急性呼吸窘迫綜合征”蒙特勒標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②明確或可疑臨床損傷后出現(xiàn)的急性發(fā)作≤7 d；③患兒家屬或監(jiān)護(hù)人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性畸形、新生兒暫時性呼吸增快癥引起的呼吸困難；②肺腺瘤樣畸形、膈疝、表面活性物質(zhì)相關(guān)的遺傳性缺陷；③羊水吸入綜合征；④腦性過度換氣；⑤嚴(yán)重肝腎功能障礙；⑥臨床資料不全。另選取同期64 名健康新生兒為對照組，其中，男性36 例，女性28 例；日齡1～7 d，平均（4.26±1.21）d；體重2 500～4 000 g，平均（3 048.18±246.58）g。兩組性別、日齡、體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、SIRT1和炎癥因子水平檢測

分別于ARDS 組入NICU 后24 h 內(nèi)、對照組次日清晨采集股靜脈血3 ml，3 000 r/min 離心10 min（半徑8 cm），取上清液，分為2 份，置于-80℃冰箱中冷凍保存待檢。一份血清標(biāo)本用于實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度計驗證純度，OD260/OD280 為1.8～2.0，qRT-PCR 擴(kuò)增。miR-181a 引物：正向5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3'， 反向5'-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUUU-3'；內(nèi)參U6引物：正向5'-AGCATGCTAGCTAGCGTGAATGA-3'，反向5'-GTAGCGCTAGATGCATGCCATCA-3'。反應(yīng)體系（共10.0 μl）：5.0 μl SYBR Premix Ex Taq，0.2 μl正向引物，0.2 μl 反向引物，0.2μl ROX Reference Dye，1.0 μl cDNA 模板，3.4 μl RNase-free ddH2O。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s（1 個循環(huán)）、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct，2-ΔΔCt法計算血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量。另一份用于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清SIRT1、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 病情和預(yù)后評估

ARDS 組入NICU 后24 h 內(nèi)，于首次機(jī)械通氣時計算氧合指數(shù)（OI），OI=平均氣道壓×動脈血氧分壓/吸入氧濃度×100。參考《“新生兒急性呼吸窘迫綜合征”蒙特勒標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》[6]進(jìn)行病情嚴(yán)重程度評估，分為重度組49 例（OI ≥16）、中度組53 例（氧指數(shù)8≤OI < 16）、輕度組60 例（4 ≤OI<8）。根據(jù)患兒痊愈出院或病情危重放棄、轉(zhuǎn)院、死亡分為預(yù)后不良組68 例和預(yù)后良好組94 例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 27.0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較做χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較做t檢驗或Z檢驗或H檢驗；H檢驗的兩兩比較做Bonferroni 校正檢驗；相關(guān)性分析用Pearson 或Spearman 法；繪 制ROC 曲 線。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量、SIRT1和炎癥因子水平比較

兩組血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量、SIRT1、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），ARDS 組血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于對照組，SIRT1 水平低于對照組。見表1。

表1 兩組血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、SIRT1和炎癥因子水平的比較

2.2 不同病情嚴(yán)重程度ARDS患兒血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、SIRT1和炎癥因子水平比較

輕度組、中度組、重度組患兒血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量、SIRT1、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，重度組和中度組患兒血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于輕度組，且重度組血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于中度組（P<0.05）；重度組和中度組患兒血清SIRT1 水平低于輕度組，且重度組血清SIRT1 水平低于中度組（P<0.05），見表2。

表2 不同病情嚴(yán)重程度ARDS患兒血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、SIRT1和炎癥因子水平比較 M（P25，P75）

2.3 ARDS 患兒血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量、SIRT1與氧指數(shù)、炎癥因子的相關(guān)性

ARDS 組患兒OI 為4～22 [11.00（6.00，17.00）]。相關(guān)性分析顯示，ARDS 患兒血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量與SIRT1 呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.788，P=0.000），與OI、IL-1β、IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)（rs=0.780、0.833、0.776 和0.804，均P=0.000）；SIRT1與OI、IL-1β、IL-6、TNF-α呈負(fù)相關(guān)（rs/r=-0.836、-0.716、-0.691 和-0.754，均P=0.000）。見表3。

表3 ARDS患兒血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、SIRT1與OI、炎癥因子的相關(guān)性

2.4 預(yù)后不良組與預(yù)后良好組血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、SIRT1水平比較

兩組血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量、SIRT1水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），預(yù)后不良組血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量高于預(yù)后良好組，SIRT1 水平低于預(yù)后良好組。見表4。

表4 預(yù)后不良組與預(yù)后良好組血清miR-181a mRNA相對表達(dá)量、SIRT1水平比較 M（P25，P75）

2.5 血清miR-181a、SIRT1 單獨及聯(lián)合對ARDS患兒預(yù)后不良的評估價值

ROC曲線結(jié)果顯示，miR-181a評估ARDS患兒預(yù)后不良的最佳截斷值為1.59，AUC 為0.777（95% CI：0.705，0.839），敏感性為80.88%（95% CI：0.717，0.857），特異性為70.21%（95% CI：0.652，0.757）；SIRT1 評估ARDS 患兒預(yù)后不良的最佳截斷值為0.70 ng/ml，AUC 為0.788（95% CI：0.717，0.848），敏感性為76.47%（95% CI：0.712，0.796），特異性為87.23%（95% CI：0.832，0.917）。兩者聯(lián)合評估ARDS患兒預(yù)后不良的AUC 為0.907（95% CI：0.851，0.947），敏感性為5.29%（95% CI：0.788，0.902），特異性為81.91%（95% CI：0.774，0.886）。見圖1。

圖1 血清miR-181a、SIRT1單獨及聯(lián)合評估ARDS患兒預(yù)后不良的ROC曲線

3 討論

ARDS 是一個彌散性肺損傷過程，影像學(xué)上病理性改變?yōu)殡p側(cè)肺組織多個肺野的肺泡不規(guī)則滲出，新生兒ARDS 是新生兒期常見危重癥，具備壞死性小腸結(jié)腸炎、新生兒窒息、嗆奶、胎糞吸入綜合征等獨特的觸發(fā)因素，且新生兒還存在肺生物學(xué)、成熟度、支氣管肺發(fā)育不良易感性、免疫功能低下等差異，因此新生兒ARDS 往往臨床后果較兒童和成人ARDS 更嚴(yán)重[7]。目前兒童和成人ARDS 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)已得到廣泛認(rèn)可，而新生兒ARDS 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)仍然未形成共識，缺乏統(tǒng)一的預(yù)防和救治措施，病死率較高，早期評估新生兒ARDS 病情嚴(yán)重程度和預(yù)后對實施治療和改善預(yù)后意義重大。炎癥反應(yīng)失控是ARDS 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，肺內(nèi)、肺外各種致病因素引起的急性失控性炎癥反應(yīng)可直接侵襲肺組織引起肺水腫，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的通透性增高，各種富含蛋白、炎癥細(xì)胞的水腫液進(jìn)入肺泡腔和肺間質(zhì)，引起ARDS，過度炎癥反應(yīng)還可引起彌漫性肺泡毛細(xì)血管膜損傷，導(dǎo)致ARDS 進(jìn)一步發(fā)展[8]。

miRNAs 是一類由19～24 個核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非蛋白質(zhì)編碼RNA，通過與靶基因mRNA 的3'-非翻譯區(qū)的堿基互補結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因功能，近年研究證實，miRNAs 參與ARDS 炎癥反應(yīng)進(jìn)展[4]。miR-181 是一個進(jìn)化及保守的分子，miR-181a 為miR-181 家族成員之一，是一種炎癥應(yīng)激性miRNA，miR-181a 表達(dá)改變參與多種炎癥相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展。如ABDUL-MAKSOUD 等[9]研究顯示，miR-181a 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中表達(dá)上調(diào)，與疾病活動指數(shù)相關(guān)。如崔昭等[10]研究顯示，炎癥性腸病患者血清miR-181a 表達(dá)上調(diào)，與腸道菌群失調(diào)相關(guān)。上述研究提示miR-181a 在多種疾病中發(fā)揮促炎作用。本研究ARDS 組血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量升高，提示miR-181a 可能參與新生兒ARDS 發(fā)生；輕度組、中度組、重度組患兒血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量呈依次升高趨勢，且與評估新生兒ARDS 病情嚴(yán)重程度的OI 呈正相關(guān)，說明miR-181a 參與新生兒ARDS 發(fā)生發(fā)展。IL-1β、IL-6、TNF-α 是重要的促炎細(xì)胞因子，基礎(chǔ)研究證實其在ARDS 炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]，本研究結(jié)果顯示，ARDS 患兒血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量與IL-1β、IL-6、TNF-α 水平呈正相關(guān)，提示miR-181a 高表達(dá)可能通過炎癥反應(yīng)途徑參與新生兒ARDS 進(jìn)展。其機(jī)制可能與miR-181a能靶向Toll 樣受體4 激活NF-κB 信號通路有關(guān)[4]。近期李淵等[12]研究也證實，抑制急性肺損傷小鼠miR-181a 表達(dá)能降低小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡率，逆轉(zhuǎn)肺組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡隔增厚、肺泡腔縮小等病理改變。

SIRT1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性酶，可通過對組蛋白和非組蛋白等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行脫乙酰作用，參與細(xì)胞衰老、基因轉(zhuǎn)錄、能量平衡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種生理功能的調(diào)控[13]。SIRT1 具有重要抗炎作用，如SHI 等[14]研究報道，在術(shù)后認(rèn)知功能障礙患者中SIRT1 表達(dá)下調(diào)，上調(diào)SIRT1 表達(dá)能通過Toll 樣受體4/NF-κB 信號通路抑制IL-1β，IL-6，TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)。在慢性阻塞性肺疾病小鼠研究中[15]，上調(diào)SIRT1 表達(dá)也能通過抑制NF-κB 信號通路抑制肺部IL-6、IL-8 等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，ARDS 組血清SIRT1 水平降低，提示SIRT1 可能參與新生兒ARDS 發(fā)生。進(jìn)一步分析顯示，輕度組、中度組、重度組患兒血清SIRT1 水平呈依次降低趨勢，與OI 呈負(fù)相關(guān)，說明SIRT1 參與新生兒ARDS 發(fā)生發(fā)展，分析與ARDS 患兒機(jī)體內(nèi)部炎癥反應(yīng)上調(diào)降低了SIRT1 活性有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，ARDS患兒血清SIRT1水平與IL-1β、IL-6、TNF-α 水平呈負(fù)相關(guān)，提示SIRT1 低表達(dá)可能通過炎癥反應(yīng)途徑參與新生兒ARDS 進(jìn)展。分析與SIRT1 能調(diào)節(jié)NF-κB 轉(zhuǎn)錄有關(guān)，NF-κB 為炎癥反應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，需經(jīng)歷乙?；土姿峄榷喾N翻譯后修飾才能發(fā)揮作用，而SIRT1 作為一種去乙?；福浔磉_(dá)降低會增強(qiáng)NF-κB 乙?；龠M(jìn)NF-κB 轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)激活及加劇[16]。在ARDS 小鼠模型中也能檢測到肺組織、肺泡灌洗液SIRT1 mRNA 表達(dá)下調(diào)，通過重組SIRT1 或SIRT1 激活劑激活SIRT1 能顯著抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，并改善肺組織病理變化[17]。miR-181a 是目前發(fā)現(xiàn)幾個能靶向降調(diào)節(jié)和/或維持SIRT1 低水平的miRNA 之一，RONG 等[18]研究報道，miR-181a 能靶向SIRT1抑制鵝顆粒細(xì)胞活力，誘導(dǎo)鵝顆粒細(xì)胞凋亡；WU等[19]研究報道，抑制miR-181a 可靶向SIRT1 抑制NF-κB 信號通路激活，減輕膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果也顯示，ARDS 患兒血清miR-181a mRNA 相對表達(dá)量與SIRT1 水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-181a 和SIRT1 可能共同通過炎癥反應(yīng)參與新生兒ARDS 發(fā)生發(fā)展。與李淵等[12]研究報道膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中miR-181a 與SIRT1 存在靶向關(guān)系符合，但關(guān)于miR-181a 是否能靶向SIRT1參與新生兒ARDS 發(fā)生發(fā)展還需研究證實。本研究結(jié)果還顯示，預(yù)后不良組血清miR-181a 水平更高，SIRT1 水平更低，考慮也與miR-181a 參與ARDS 炎癥反應(yīng)和SIRT1 具有抑制ARDS 炎癥反應(yīng)有關(guān)，提示兩者可能成為新生兒ARDS 預(yù)后評估指標(biāo)。本研究進(jìn)一步通過繪制ROC 曲線也證實，miR-181a、SIRT1 均對新生兒ARDS 預(yù)后不良具有評估價值，且二者聯(lián)合AUC 達(dá)到了0.90，說明聯(lián)合檢測血清miR-181a、SIRT1 水平能更好評估新生兒ARDS 病情嚴(yán)重程度及預(yù)后，有利于指導(dǎo)臨床制訂治療方案。

綜上所述， 新生兒ARDS 血清miR-181a、SIRT1 水平與ARDS 患兒病情嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)，可作為新生兒ARDS 預(yù)后評估指標(biāo)。但本研究為單中心小樣本研究，未動態(tài)監(jiān)測血清miR-181a、SIRT1 水平變化，還需多中心大樣本研究證實。