王濤,崔月玲,王曉聰,譚薇
(遵義市第一人民醫(yī)院 眼科,貴州 遵義563000)
2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種以血糖升高為主要表現(xiàn)的代謝性疾病,糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)為其常見嚴重并發(fā)癥,是患者視力下降、失明的重要原因,嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。DR 是一個復雜病理過程,與長期血糖控制不佳、炎癥反應(yīng)、新生血管形成、細胞纖維化等有關(guān)[2]。抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)治療是目前DR 主要治療手段之一[3]。MicroRNA 是一類非編碼RNA 分子,廣泛參與細胞增殖、遷移、凋亡等生物學過程,還可影響VEGF 信號轉(zhuǎn)導,與眼底疾病發(fā)生有密切關(guān)系[4-5]。MicroRNA-20a-5p (miR-20a-5p)為microRNA-17-92 基因簇一員,參與調(diào)控細胞增殖、凋亡,血管新生形成等病理生理過程[6-7]。有研究報道,妊娠期糖尿病患者血清miR-20a-5p 水平明顯降低[8];miR-20a-5p 能負向調(diào)控VEGF 抑制高氧誘導視網(wǎng)膜病變的血管新生[9]。本研究旨在分析DR 患者血清miR-20a-5p、VEGF 水平變化,探討miR-20a-5p 參與DR 發(fā)生、發(fā)展的機制,以期為DR防治提供依據(jù)。
選取2018年1月—2020年12月遵義市第一人民醫(yī)院眼科收治的82 例DR 患者為DR 組。其中,男性38 例,女性44 例;年齡39~74 歲,平均(64.15±11.06)歲。納入標準:①符合《中國2 型糖尿病防治指南(2017年版)》[10]診斷標準;②符合《我國糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南(2014年)》[11]DR 診斷標準;③臨床資料完整;④入院前未接受抗DR 治療;⑤患者及家屬均知情。排除標準:①合并視神經(jīng)疾病、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、青光眼、白內(nèi)障等其他眼部疾??;②合并血管瘤;③先天性弱視;④急慢性感染性疾?。虎輫乐馗文I功能障礙;⑥合并其他慢性疾?。虎吆喜⒓谞钕俟δ芸哼M、皮質(zhì)醇增多癥等影響糖代謝疾??;⑧有近期手術(shù)史。選取同期52 例單純T2DM 患者為T2DM 組。其中,男性23 例,女性29 例;年齡40~75 歲,平均(64.15±12.26)歲;符合《中國2 型糖尿病防治指南(2017年版)》[10]診斷標準。選取同期42 例健康體檢者為對照組。其中,男性20 例,女性22 例;年齡41~78 歲,平均(65.25±11.61)歲。3 組研究對象的性別構(gòu)成、年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。
采集DR 患者、T2DM 患者入院時和對照組體檢時空腹靜脈血6 ml,3 000 r/min 離心10 min(離心半徑8 cm),分離血清,取上清液,分為2 份,置于-80℃冰箱中冷凍待檢。其中一份采用Trizol 試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司,貨號:15596-026;規(guī)格:100 ml)提取血清總RNA,TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(試劑盒購自杭州?;锛夹g(shù)有限公司,貨號:K1622;規(guī)格:100 Rxns)。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測,反應(yīng)體系:1.0 μl cRNA,0.3 μl Taq 酶,1.0 μl 引物,0.4 μl 10 mmol dNTP,1.2 μl 25 mmol MgCl2,2.0 μl 10×PCR buffer,3.5 μl DEPC水;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s,循環(huán)40 次。miR-20a-5p 引物:正向5'-ATGCTAAAGTGC TTATAGT-3',反向5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TC-3';以U6為內(nèi)參,引物:正向5'-CGCTTCGGCA GCAGCACATATAC-3',反向5'-AATTTGCGTGTCAT CCTTGC-3'。采 用2-ΔΔCt法計算血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量。另一份采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)(試劑盒購自上海西格生物科技有限公司,貨號:XG-E102939)檢測血清VEGF 水平,葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖(FBG)水平,膠乳凝集反應(yīng)法檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。
DR 患者入院后行眼底檢查,根據(jù)DR 發(fā)展階段和嚴重程度[11]分為增殖型(proliferative diabetic retinopathy, PDR)27 例(PDR 組)和非增殖型(nonproliferative diabetic retinopathy, NPDR)55 例(NPDR 組)。
數(shù)據(jù)處理采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料以構(gòu)成比或率(%)表示,比較用χ2檢驗;計量資料以均數(shù)±標準差(±s)或中位數(shù)(下四分位數(shù),上四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示,比較用t檢驗、方差分析或H檢驗,進一步兩兩比較用SNK-q檢驗或χ2檢驗;相關(guān)分析用Pearson 法;影響因素的分析用多因素Logistic 回歸分析模型;繪制ROC 曲線;P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
3 組糖尿病病程及FBG、HbA1c 比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);進一步兩兩比較,DR 組糖尿病病程長于T2DM 組,DR 組FBG、HbA1c 水平高于T2DM 組(P<0.05),T2DM 組FBG、HbA1c 水平高于對照組(P<0.05)。見表1。
表1 3組糖尿病病程及FBG、HbA1c水平比較
3 組血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量、VEGF 水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);進一步兩兩比較,DR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量低于T2DM 組和對照組(P<0.05),VEGF 水平高于T2DM 組和對照組(P<0.05);T2DM 組血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量低于對照組(P<0.05),血清VEGF 水平高于對照組(P<0.05)。見表2。
表2 3組血清miR-20a-5p mRNA相對表達量、VEGF水平比較 (±s)
表2 3組血清miR-20a-5p mRNA相對表達量、VEGF水平比較 (±s)
注:①與對照組比較,P<0.05;②與T2DM組比較,P<0.05。
組別DR組T2DM組對照組F 值P 值n 82 52 42 miR-20a-5p mRNA 0.43±0.06①②0.81±0.19①0.98±0.25 182.102 0.000 VEGF/(pg/ml)194.12±56.85①②102.26±20.952①65.13±19.07 158.222 0.000
PDR 組和NPDR 組患者血清miR-20a-5p mRNA相對表達量及FBG、HbA1c、VEGF 水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),PDR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量低于NPDR 組,F(xiàn)BG、HbA1c、VEGF 水平高于NPDR 組。見表3。
表3 不同程度DR患者血清miR-20a-5p mRNA相對表達量及FBG、HbA1c、VEGF水平比較 (±s)
表3 不同程度DR患者血清miR-20a-5p mRNA相對表達量及FBG、HbA1c、VEGF水平比較 (±s)
組別PDR組NPDR組t 值P 值n 27 55 miR-20a-5p mRNA 0.39±0.06 0.45±0.05-5.045 0.000 FBG/(mmol/L)12.15±3.84 9.83±2.95 3.016 0.003 HbA1c/%11.03±1.69 9.50±1.20 4.712 0.000 VEGF/(pg/ml)223.97±64.79 179.47±46.51 3.564 0.001
Pearson 法分析顯示,DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量與FBG、HbA1c、VEGF 呈負相關(guān)(r=-0611、-0.799 和-0.545,均P=0.000)。
以DR 發(fā)生(是=1,否=0)為因變量,糖尿病病程、FBG、HbA1c、miR-20a-5p、VEGF 為自變量,納入多因素Logistic 回歸模型,結(jié)果顯示,血清miR-20a-5p 高水 平[=0.254(95% CI:0.154,0.596)]為DR 發(fā)生的獨立保護因素(P<0.05),糖尿病病程長[=2.042(95%CI:1.422,2.933)]、血清HbA1c 高水平[=2.307(95% CI:1.101,4.833)]、血清VEGF 高水平[=2.570(95% CI:1.584,4.144)]為DR 發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。
表4 DR影響因素的多因素Logistic回歸分析參數(shù)
血清miR-20a-5p 預(yù)測DR 發(fā)生的AUC 為0.816(95% CI:0.739,0.877),截斷值為0.56,敏感性為97.56%(95% CI:0.915,0.997),特 異 性 為61.54%(95% CI:0.471,0.748);血清VEGF 的AUC 為0.818(95%CI:0.742,0.879),截斷值為138.25 pg/ml,敏感性為57.32%(95% CI:0.447,0.683),特異性為96.15%(95% CI:0.868,0.995);聯(lián) 合 預(yù) 測AUC 為0.892(95% CI:0.827,0.939),敏感性為91.46%(95% CI:0.832,0.965),特 異 性 為76.92%(95% CI:0.632,0.875)。見圖1。
圖1 血清miR-20a-5p、VEGF預(yù)測DR發(fā)生的ROC曲線
DR 是一種嚴重微血管并發(fā)癥,T2DM 患者長期血糖控制不佳,血糖滲入眼部基底膜,引起眼局部組織缺血缺氧、炎癥反應(yīng)等,導致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞異常增殖和纖維化,形成病理性新生血管,破裂出血后表現(xiàn)為眼底出血,患者視力模糊,隨著血管破裂,疤痕組織生長又可牽拉視網(wǎng)膜,導致視網(wǎng)膜脫落,最終喪失視力[3,11]。流行病學顯示,我國糖尿病病程5年和10~15年患者的DR 發(fā)生率為9.7%和80.0%,已成為嚴重公共衛(wèi)生問題[1],因此早期發(fā)現(xiàn)和闡明其發(fā)病機制對DR 防治意義重大。
MicroRNA 是一類長度約22 個核苷酸的高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈非編碼RNA,能與靶mRNA 的3'非翻譯端相互作用,降解靶mRNA 或翻譯抑制,參與多種生物學過程。研究報道,缺血誘導視網(wǎng)膜新生血管后,缺血視網(wǎng)膜中存在多種miRNAs 異常表達,參與血管新生等過程[12]。miR-20a-5p 位于13 號染色體,已被證實參與乳腺癌、胃癌等實體瘤增殖、遷移、入侵等過程[13-14]。miR-17-92 基因簇作為miR-20a-5p 的前體,研究報道,轉(zhuǎn)染miR-17-92 基因簇能恢復小鼠內(nèi)皮細胞增殖、遷移、新生血管能力[15]。PLATANIA 等[16]發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜和血清中miR-20a-5p 表達顯著降低,下調(diào)miR-20a-5p 表達能引起糖尿病小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成。本研究結(jié)果顯示,T2DM 組血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量低于對照組,提示miR-20a-5p 低表達與T2DM 發(fā)生有關(guān)。結(jié)果還顯示,DR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量低于T2DM組,PDR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量低于NPDR 組,提示miR-20a-5p 不僅與T2DM 發(fā)生有關(guān),還可能參與DR 發(fā)生,支持PLATANIA 等[16]的觀點。內(nèi)皮祖細胞功能障礙是糖尿病患者血管生成并發(fā)血管并發(fā)癥的關(guān)鍵[17]。miR-20a-5p 能抑制高糖狀態(tài)下的內(nèi)皮祖細胞凋亡和自噬,調(diào)節(jié)糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細胞功能,進而抑制新生血管生成[18]。該項研究進一步佐證了本研究結(jié)果,本研究結(jié)果也顯示,血清miR-20a-5p 高水平為DR 發(fā)生的保護因素,說明miR-20a-5p 對DR 可能具有抑制作用,但關(guān)于其作用機制尚不明確。
VEGF 是一種糖蛋白,能通過結(jié)合血管內(nèi)皮細胞表面特異性受體和血管內(nèi)皮生長因子受體,發(fā)揮增加血管通透性、促進血管生成等作用,被認為是DR 新生血管形成的主要調(diào)控因子[2]。本研究結(jié)果顯示,DR 組血清VEGF 水平高于T2DM 組和對照組,T2DM 組血清VEGF 水平高于對照組,PDR 組血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量低于NPDR 組,符合既往研究報道[19]。血糖紊亂是DR 發(fā)生主要因素之一[2]。本研究結(jié)果顯示,DR 組FBG、HbA1c 高于T2DM 組,PDR 組FBG、HbA1c 高于NPDR 組,符合DR 患者血糖水平變化。本研究結(jié)果還顯示,DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量與FBG、HbA1c、VEGF 呈負相關(guān),提示miR-20a-5p 可能通過影響血糖和VEGF 水平參與DR 發(fā)生過程。高氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜病變模型中,上調(diào)視網(wǎng)膜組織中miR-20a-5p 表達能通過抑制VEGF 減少小鼠視網(wǎng)膜血管新生[9]。體外DR 模型中,高濃度糖顯著降低了視網(wǎng)膜光受體中miR-20a-5p 表達,增加了VEGF 表達,轉(zhuǎn)染miR-20a-5p 至視網(wǎng)膜光受體,可顯著降低VEGF 表達,并抑制視網(wǎng)膜新生血管生成潛能[20]。上述研究表明,miR-20a-5p 可能通過負向調(diào)控VEGF 發(fā)揮對DR 的保護作用。DR 嚴重影響T2DM 患者生存質(zhì)量,玻璃體切割和視網(wǎng)膜激光光凝治療雖然能改善PDR 的視功能,但并不能解決根本問題,因此早期發(fā)現(xiàn)DR 十分必要[21]。本研究ROC 曲線顯示,miR-20a-5p 可作為預(yù)測T2DM 患者DR 發(fā)生的指標,且聯(lián)合VEGF 后預(yù)測價值更高。
綜上所述,DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相對表達量降低,與FBG、HbA1c、VEGF 密切相關(guān),miR-20a-5p 可能通過調(diào)控糖代謝和VEGF 介導DR的發(fā)生、發(fā)展,可作為DR 的預(yù)測指標。但關(guān)于miR-20a-5p 參與DR 的確切機制,還需更多實驗證實。