基于同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉琴 孫紅 余東陽 胡紅兵

華中科技大學(xué)同濟(jì)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院1輸血科，3檢驗(yàn)科（武漢 430015）；2浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310012）

幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）是兒童常見的以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的一類自身免疫性疾病，其主要表現(xiàn)為腫脹、疼痛和活動(dòng)受限，并可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，JIA 反復(fù)發(fā)作還會(huì)延緩生長(zhǎng)發(fā)育，甚至致殘，后果嚴(yán)重［1-3］。目前，該疾病病因不明，并且缺乏與JIA 相關(guān)的生物指標(biāo)物，臨床診斷JIA 主要依靠臨床資料，不利于疾病的早期診斷和治療。生物質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新型技術(shù)，有利于探明疾病的發(fā)病機(jī)制，尋找新的疾病診斷與治療的指標(biāo)［4］。本研究利用相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）聯(lián)合nano LC-MS/MS 質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)JIA 患者血清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，以期尋找新的JIA 診斷的血清標(biāo)志物，為臨床治療及疾病療效監(jiān)測(cè)提供線索。

1 資料和方法

1.1 一般資料收集武漢兒童醫(yī)院2017年11月至2018年1月JIA 患者18 例，患者診斷參照2001年國(guó)際風(fēng)濕病學(xué)聯(lián)盟（ILAR）的分類標(biāo)準(zhǔn)討論稿，年齡3.2 ～13.7 歲，中位年齡7.5 歲，其中男10 例，女8 例。正常對(duì)照組20 例，年齡3.4 ～15.1 歲，中位年齡8.1 歲，其中男10 例，女10 例，為同期武漢兒童醫(yī)院健康體檢者，查體無異常，同時(shí)排除肝、腎功能損害、腫瘤、自身免疫性疾病、感染及傳染病。收集浙江省立同德醫(yī)院2017年8月-2018年1月RA 患者44 例，患者診斷參照2010年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）聯(lián)合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）發(fā)布的RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡35.2 ～70.7 歲，中位年齡47.5 歲，其中男17 例，女27 例。本研究經(jīng)武漢兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器血清高豐度蛋清去除試劑盒（SIGMA，批號(hào)：PROTBA-1KT）；BCA 蛋白水平測(cè)定試劑盒（碧云天生物，批號(hào)：P0010S）；RIPA強(qiáng)裂解液（碧云天生物，批號(hào)：P0013B）；iTRAQ 試劑盒（ABSciex 公司，批號(hào)：4381664）；蛋白酶抑制劑（PMSF）（凱基生物，批號(hào)：KGP610）。質(zhì)譜儀（Thermo Scientific Q Exactive）；液相色譜儀（島津LC-20AD）；二維液相色譜儀（Thermo Dionex Ultimate 3000 RSLC nano）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集收集研究對(duì)象100 μL 血清標(biāo)本，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣本處理去除血清中的高豐度蛋白；測(cè)定蛋白質(zhì)含量；測(cè)定后的樣本進(jìn)行酶解；分別用iTRAQ 試劑114、116 和115 進(jìn)行標(biāo)記；混合，真空干燥。以上操作按照各個(gè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 質(zhì)譜分析將標(biāo)記后的多肽混勻進(jìn)行液相分離，色譜柱流動(dòng)相A：pH 10，20 mmol/L 甲酸胺；流動(dòng)相B：pH 10，20 mmol/L 甲酸胺，80%ACN；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm/280 nm；流速為200 μL/min。分離后的肽段進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：AGC target：3e6；Maximum IT：40 ms；Resolution：70 000；Scan range：350 to 1 800 m/z。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：AGC target：1e5；Maximum IT：60 ms；Resolution：17 500；TopN：20；NCE/stepped NCE：30。

1.3.4 生物信息學(xué)分析將質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為，mfg 文件，利用Protein PilotTMSoftware 4.5 軟件進(jìn)行檢索，檢索參數(shù)如下：Sample Type：iTRAQ 8plex（Peptide Labeled）；Cys alkylation：MMTS；ID focus：biological modificaition；Digestion：typsin；Database：homo.fasta；Serch effort：thorough ID；FDR Analysis：Yes；User Modified Parameter Files：No。以差異倍數(shù)＞1.30 或＜0.77，P＜0.05 定義為差異蛋白。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/proteomes/）中人物種蛋白序列進(jìn)行GO 注釋，并基于GO 的細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物學(xué)過程（BP）對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行富集分析。分別利于KEGG數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.Kegg.jp/kegg/pathway.html）和STRING 數(shù)據(jù) 庫(kù)（http：//string-db.org/cgi/）進(jìn)行生物學(xué)通路富集分析和蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜鑒定分析結(jié)果JIA 組相對(duì)于健康體檢組，共鑒定差異蛋白106 個(gè)，其中49 個(gè)表達(dá)上調(diào)，57 個(gè)表達(dá)下調(diào)（圖1）。JIA 組相對(duì)于RA 組，共鑒定差異蛋白56 個(gè)，其中33 個(gè)表達(dá)上調(diào)，23 個(gè)表達(dá)下調(diào)。相對(duì)于健康體檢組，JIA 組和RA 組均差異表達(dá)的蛋白有63 個(gè)，其中26 個(gè)表達(dá)上調(diào)，37 個(gè)表達(dá)下調(diào)。由此可見，JIA 和RA 的疾病機(jī)理既具有相似之處，又存在較大差異。

圖1 差異表達(dá)蛋白熱圖Fig.1 The heat map of differential protein

2.2 GO 富集分析JIA 組相對(duì)于健康體檢組，GO富集分析差異蛋白主要參與的生物學(xué)過程、細(xì)胞定位和分子功能（圖2）。這些差異蛋白參與的生物學(xué)過程主要有：血小板脫顆粒、急性炎癥反應(yīng)、血液凝固、纖溶、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。這些差異蛋白質(zhì)主要定位在血漿脂蛋白顆粒、血小板α 顆粒、高密度脂蛋白顆粒、血小板致密性顆粒管腔等、脂蛋白復(fù)合物。這些差異蛋白參與的分子功能主要包括絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制活性、氧載體活性、免疫球蛋白結(jié)合、珠蛋白結(jié)合、脂蛋白顆粒受體結(jié)合等。由此可見，JIA 的發(fā)病機(jī)制與血液凝溶系統(tǒng)、脂質(zhì)代謝、免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。

圖2 GO 富集分析圖Fig.2 The gene ontology（GO）analysis

2.3 KEGG 通路分析JIA 組相對(duì)于健康體檢組，KEGG 通路分析結(jié)果：補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、PPAR信號(hào)通路、瘧疾、膽固醇代謝、血小板活化、鐵凋亡、造血細(xì)胞系、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、ECM-受體相互作用、NF-κB 信號(hào)通路等10 條差異蛋白富集通路。表明脂質(zhì)代謝、血液凝溶系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)參與JIA疾病的發(fā)生發(fā)展（圖3）。

圖3 KEGG 通路分析圖Fig.3 The KEGG pathway analysis

2.4 蛋白-蛋白相互作用STRING 網(wǎng)絡(luò)分析JIA組相對(duì)于健康體檢組，通過STRING 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素、APOH、AHSG 等差異蛋白可與其他多個(gè)差異蛋白發(fā)生相互作用，是PPI 網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵性節(jié)點(diǎn)，可作為研究JIA 機(jī)制的候選蛋白（圖4）。

圖4 STRING 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PIP）分析圖Fig.4 The STRING analysisof protein-protein interaction network（PIP）

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)（protcomics）是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，采用各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段來探索蛋白質(zhì)表達(dá)、定位與功能，以及細(xì)胞的活動(dòng)規(guī)律的一門新興學(xué)科［5-6］。iTRAQ 聯(lián)合質(zhì)譜是具有高靈敏度和重現(xiàn)性的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，是研究組織、細(xì)胞等在不同生理病理狀態(tài)下，不同病理類型中差異蛋白的一種有效方式，已廣泛應(yīng)用于腫瘤、炎癥、免疫性疾病中［7-9］。既往蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要針對(duì)成人關(guān)節(jié)炎，對(duì)兒童關(guān)節(jié)炎研究甚少，所用的分析技術(shù)主要是傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳，靈敏度、重復(fù)性與質(zhì)譜技術(shù)相對(duì)較差［10-13］。然而，JIA 與成人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理有很大的區(qū)別，需要更多的蛋白質(zhì)組分析數(shù)據(jù)［14-15］。

本研究利用iTRAQ 結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)JIA 患者和健康人群血清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和相對(duì)定量分析比較，共篩選出差異蛋白106 個(gè)。通過GO 富集分析和KEGG 通路分析結(jié)果表明，血液凝溶系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、脂質(zhì)代謝與JIA 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。并通過STRING 分析篩選出在PPI 網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用蛋白：脂聯(lián)素、AHSG、APOH 等，作為進(jìn)一步深入研究JIA 機(jī)制的候選蛋白。通過分別比較JIA 組和RA 組與健康體檢組的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)有26 個(gè)差異蛋白均呈現(xiàn)上調(diào)，37 個(gè)差異蛋白均呈現(xiàn)下調(diào)。鑒于這兩類疾病的特征均為慢性關(guān)節(jié)滑膜炎，在蛋白組學(xué)上也具有較大的相似之處也不足為奇。此外，本研究還比較了JIA 患者和RA 患者血清中的差異蛋白，共鑒定篩選出56 個(gè)差異蛋白。由此可見，JIA 與RA 兩種疾病之間還存在較大區(qū)別，JIA 患兒不是RA 患者的縮小版，JIA 疾病有其特有的發(fā)病機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)ADIPOQ 基因編碼的脂聯(lián)素（adiponectin）在JIA樣本中高表達(dá)。通過STRING分析，它與其他多個(gè)差異蛋白相互作用，是PPI 網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種激素蛋白，可以通過與單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞脂聯(lián)素受體結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的作用［16-17］。研究表明，脂聯(lián)素在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清中高表達(dá)，并與關(guān)節(jié)破壞程度正相關(guān)［18-19］。在JIA 中脂聯(lián)素水平如何變化，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，脂聯(lián)素是否可以成為JIA 的生物標(biāo)志物仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，近年來研究表明血脂紊亂也存在于兒童風(fēng)濕性疾病患者中，并與早期動(dòng)脈粥樣硬化形成相關(guān)［20］。孫東明等［21］研究顯示，全身型相較于其他亞型JIA，更易出現(xiàn)血脂代謝紊亂。在本研究中，GO 富集分析和KEGG 通路分析結(jié)果表明差異表達(dá)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)。通過STRING 分析發(fā)現(xiàn)，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的APOH、APOA2、APOC3 等蛋白在PPI 網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用，是研究JIA 機(jī)制的候選蛋白。由此可見，脂質(zhì)代謝可能成為JIA 發(fā)病機(jī)制研究的新的突破點(diǎn)。通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝通路，改善患兒的脂質(zhì)代謝狀態(tài)可能成為治療該疾病的新方向。

總之，本研究通過比較、分析JIA 患者與正常個(gè)體以及成人RA 患者的蛋白質(zhì)組的差異，分析差異蛋白的功能、定位、相互作用關(guān)系等特性，不僅有助于探討JIA 發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的生物指標(biāo)，還可為JIA 治療提供新的思路，為臨床藥物的開發(fā)提供重要線索。但由于本研究樣本量較少，可能存在一定的誤差，需進(jìn)一步加大樣本量，并對(duì)鑒定的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。