基于NF－κB信號(hào)通路探討針刺緩解干眼豚鼠淚腺炎癥的機(jī)制

鄭曉駿，丁寧，徐倩，高衛(wèi)萍

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

干眼是臨床常見的眼表疾病，在該病的發(fā)生和演變過(guò)程中與炎癥因子之間關(guān)系密切，炎癥是干眼的主要發(fā)病機(jī)制之一［1］。針刺治療干眼，除了能夠有效降低角膜染色評(píng)分、增加淚液分泌量、延長(zhǎng)淚膜破裂時(shí)間之外，也可減輕炎癥反應(yīng)［2］；相比西藥不僅臨床療效較好，同時(shí)毒副作用也較少。為此，積極展開關(guān)于針刺治療干眼的抗炎作用機(jī)制研究，具有重要的意義。

研究顯示，針刺療法可通過(guò)增加α7nAChR，下調(diào)NF－κB 信號(hào)通路中p65 的表達(dá)，從而有效抑制炎癥，減輕各組織損傷［3］。但目前關(guān)于針刺可降低干眼動(dòng)物淚腺組織中炎癥因子表達(dá)的研究較少［2］。為此，本研究基于NF－κB 信號(hào)通路，以豚鼠進(jìn)行干眼動(dòng)物造模，通過(guò)檢測(cè)干眼豚鼠淚腺組織中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況，探討針刺對(duì)干眼的抗炎作用和NF－κB 信號(hào)通路之間存在的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫溴酸東莨菪堿注射劑（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：19011407）；酚紅棉線（遼寧美滋林藥業(yè)有限公司）；一次性使用無(wú)菌針灸針（φ0.18 × 13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：200628）；熒光素鈉眼科檢驗(yàn)試紙（天津伊諾新康醫(yī)療器械科技有限公司）；蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；J3692－A 豚鼠白細(xì)胞介素－4（IL－4）、白細(xì)胞介素－10（IL－10）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）ELISA 檢測(cè)試劑盒（江蘇晶美生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2021.03）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性英格蘭短毛三花豚鼠24 只（南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場(chǎng)，SCXK－蘇2019－0005），體質(zhì)量（300±50）g，常規(guī)喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度24～26 ℃，濕度50%～65%。裂隙燈顯微鏡查眼表無(wú)明顯異常。

1.3 動(dòng)物模型制備與分組

將上述24 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為空白組、模型組、針刺組及假針刺組，每組各6只（12只眼）。其中，模型組、針刺組、假針刺組每日8：00、11：00、14：00、17：00皮下注射1 次氫溴酸東莨菪堿溶液，每日4 次，劑量為0.6 mg/（0.2 mL·次）［4－5］。第12 天，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的Prtt 檢測(cè)結(jié)果同實(shí)驗(yàn)前及空白組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明干眼動(dòng)物模型建立。實(shí)驗(yàn)遵循《國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理保護(hù)條例》，并通過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2021DW0201）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

空白組常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何造模處理及治療。模型組、針刺組及假針刺組每日4次皮下注射東莨菪堿，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共26 d。其中，在第12 天造模成功后，模型組不做任何處理。針刺組每日給予針刺治療，穴位取雙側(cè)睛明、攢竹、絲竹空、太陽(yáng)、瞳子髎。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［6］。睛明針尖向內(nèi)下方斜刺入皮下，攢竹向下平刺，太陽(yáng)直刺，瞳子髎直刺，均不行針，留針15 min。絲竹空透太陽(yáng)，每日1次，連續(xù)治療14 d。假針刺組則以鈍針頭每天淺刺激本組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼周穴位，取穴方法及治療天數(shù)均同針刺組。

1.5 干眼相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法

分別于實(shí)驗(yàn)第0 天（實(shí)驗(yàn)前）、實(shí)驗(yàn)第12 天（造模后）、實(shí)驗(yàn)第26天（治療后）對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的BUT、FL及Prtt進(jìn)行檢測(cè)。具體方法如下：

1.5.1 BUT檢測(cè)

將濕潤(rùn)的熒光素鈉染色試紙輕點(diǎn)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下穹隆部，輔助動(dòng)物眨眼后，使用裂隙燈觀察，記錄首個(gè)角膜干燥斑出現(xiàn)所用的時(shí)間，每只眼均檢測(cè)3次，取平均值。

1.5.2 FL檢測(cè)

將濕潤(rùn)的熒光素鈉染色試紙輕點(diǎn)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下眼瞼穹窿部，輔助動(dòng)物眨眼后進(jìn)行計(jì)分。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：采取角膜病變劃分法，使用裂隙燈觀察，以角膜中心為垂直和水平兩條線的交點(diǎn)，將角膜劃分為四等份，每等份分別計(jì)0～3 分，不染色時(shí)計(jì)0 分，5 個(gè)以下點(diǎn)染計(jì)1 分，5 個(gè)以上的點(diǎn)染計(jì)2 分，塊狀染色計(jì)3 分，最后將各等份內(nèi)的分?jǐn)?shù)進(jìn)行相加，滿分為12分。

1.5.3 Prtt檢測(cè)

把酚紅棉線一端少許輕折，用眼科鑷小心輕夾反折處后，小心放入動(dòng)物結(jié)膜囊內(nèi)，輔助動(dòng)物閉眼，并計(jì)時(shí)20 s，再取出棉線，測(cè)量其被浸潤(rùn)的實(shí)際長(zhǎng)度。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第26 天處死所有豚鼠，立即從各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，隨機(jī)取3 只左眼部分淚腺組織，通過(guò)多聚甲醛固定和常規(guī)石蠟包埋。用PBS 液沖洗3 次后，以正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加p65（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 沖洗5 min×3 次，滴加新鮮配制的DAB 顯色劑。自來(lái)水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.7 Western Blot檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第26 天，處死各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，取下各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的右側(cè)淚腺，剪碎加入裂解混合液于冰上裂解30 min，待裂解完畢后離心5 min 取上清液，用BCA 法提取蛋白、濃度測(cè)定。樣品經(jīng)上樣緩沖液稀釋后于12% SDS－PAGE 分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶室溫封閉2 h。洗膜后，加入α7nAChR（1∶1 000），p65（1∶2 000）抗體4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫下孵育2 h，洗膜10 min×3 次后曝光。以GAPDH 作為內(nèi)參，對(duì)條帶進(jìn)行光密度分析。

1.8 ELISA檢測(cè)

用上述提取的蛋白按照IL－4、IL－10、TNF－α ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組淚腺組織中因子的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用±s進(jìn)行表示，采用單因素方差分析法，隨后進(jìn)一步采用LSD進(jìn)行多組兩兩對(duì)比。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)段BUT比較

實(shí)驗(yàn)前各組BUT 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后，除空白組外，其余各組的BUT同實(shí)驗(yàn)前相比均有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；治療后，模型組和空白組相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；針刺組同模型組相比明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；假針刺組同針刺組相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組不同時(shí)間段BUT比較（±s，s）

表1 各組不同時(shí)間段BUT比較（±s，s）

注：與空白組比較，＊P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與針刺組比較，▲P ＜0.05；與實(shí)驗(yàn)前比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與造模后比較，￥P ＜0.05。

實(shí)驗(yàn)前空白組模型組針刺組假針刺組n 6 6 6 6實(shí)驗(yàn)前7.17±2.69 8.50±3.26 9.83±4.26 8.93±3.96造模后7.25±2.80 5.33±3.31Δ 6.17±3.79Δ 4.75±2.83ΔΔ治療后8.00±3.28 2.58±1.51＊￥6.50±3.09#3.33±2.02▲

2.2 各組不同時(shí)段FL比較

實(shí)驗(yàn)前各組FL 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的角膜染色評(píng)分和實(shí)驗(yàn)前相比均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；并且模型組、針刺組、假針刺組同空白組相比明顯上升，差異也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療后，空白組和造模后相比有所下降（P＜0.05），但與實(shí)驗(yàn)前相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組同空白組對(duì)比上升顯著（P＜0.01）；針刺組同模型組相比顯著下降（P＜0.01）；假針刺組同針刺組相比，高于針刺組（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組不同時(shí)間段FL比較（±s，分）

表2 各組不同時(shí)間段FL比較（±s，分）

注：與空白組比較，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.05；與針刺組比較，▲▲P ＜0.01；與實(shí)驗(yàn)前比較，△△P ＜0.01；與造模后比較，￥P ＜0.05，￥￥P ＜0.01。

組別空白組模型組針刺組假針刺組n6 6 6 6實(shí)驗(yàn)前1.17±0.94 1.00±0.85 1.17±1.45 1.42±1.56造模后3.43±2.94ΔΔ 7.17±3.79ΔΔ＊＊7.08±2.58ΔΔ＊＊7.00±3.13ΔΔ＊＊治療后1.75±1.29￥8.33±1.86＊＊3.42±1.83￥￥##6.75±3.23＊＊▲▲

2.3 各組不同時(shí)段Prtt比較

實(shí)驗(yàn)前各組之間的Prtt 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后，除空白組之外，其余各組的Prtt同實(shí)驗(yàn)前對(duì)比均顯著下降（P＜0.01）；并且，同空白組對(duì)比，模型組、針刺組、假針刺組均顯著下降，差異亦存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療后，模型組和空白組對(duì)比顯著下降（P＜0.01）；針刺組同模型組相比上升明顯（P＜0.01）；假針刺組和針刺組相比顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組不同時(shí)間段Prtt比較（±s，mm/20 s）

表3 各組不同時(shí)間段Prtt比較（±s，mm/20 s）

注：與空白組比較，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01；與針刺組比較，▲▲P ＜0.01；與實(shí)驗(yàn)前比較，△△P ＜0.01；與造模后比較，￥￥P ＜0.05。

組別空白組模型組針刺組假針刺組n6 6 6 6實(shí)驗(yàn)前10.21±5.00 9.63±2.37 10.21±2.35 9.33±3.31造模后9.96±5.67 4.17±1.27ΔΔ＊＊5.38±1.60ΔΔ＊＊4.96±3.00ΔΔ＊＊治療后10.21±5.00 2.83±3.43＊＊9.50±3.78ΔΔ##1.42±2.39ΔΔ＊＊▲▲

2.4 各組淚腺中NF－κBp65 蛋白的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果

與空白組對(duì)比，模型組淚腺組織中NF－κBp65 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，針刺組淚腺組織中NF－κBp65 蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）；與針刺組對(duì)比，假針刺組淚腺組織中NFκBp65 的相對(duì)表達(dá)量則明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 各組豚鼠淚腺中NF－κBp65蛋白的相對(duì)表達(dá)量（×200）

2.5 各組淚腺中α7nAChR 及NF－κBp65 的Western Blot檢測(cè)結(jié)果

與空白組對(duì)比，模型組淚腺組織中α7nAChR 的相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0. 01），NF－κBp65 則顯著升高（P＜0. 01）；與模型組對(duì)比，針刺組中的α7nAChR 的 相對(duì)表達(dá) 量顯著升 高（P＜0. 01），NF－κBp65 則顯著下降（P＜0. 01）；與針刺組對(duì)比，假針刺組淚腺組織中α7nAChR 的相對(duì)表達(dá)量有所下降，而NF－κBp65 則顯著升高（P＜0. 01）。結(jié)果見圖2 和圖3。

圖2 各組豚鼠淚腺中α7nAChR的表達(dá)水平

圖3 各組豚鼠淚腺組織中NF－κBp65蛋白的表達(dá)水平

2.6 各組淚腺中IL－4、TNF－α和IL－10的含量比較

與空白組對(duì)比，模型組淚腺組織中IL－4 的含量高于空白組（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，針刺組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺組織中IL－4 的含量顯著下降（P＜0.01）；與針刺組對(duì)比，假針刺組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺組織中IL－4 的含量升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖4。

圖4 各組豚鼠淚腺中IL－4的含量對(duì)比情況

與空白組對(duì)比，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺組織中TNFα的含量高于空白組（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，針刺組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺組織中TNF－α 的含量明顯下降（P＜0.05）；與針刺組對(duì)比，假針刺組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺組織中TNF－α的含量升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖5。

圖5 各組豚鼠淚腺中TNF－α的含量對(duì)比情況

與空白組對(duì)比，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺組織中IL－10的含量高于空白組（P＜0.05）；與模型組對(duì)比，針刺組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺組織中IL－10 的含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與針刺組對(duì)比，假針刺組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物淚腺組織中IL－10 的含量明顯上升（P＜0.05）。結(jié)果見圖6。

圖6 各組豚鼠淚腺中IL－10的含量對(duì)比情況

3 討論

在參與炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，NF－κBp65 被激活后與目的基因相結(jié)合，從而促進(jìn)IL－4、TNF－α 和IL－10等炎癥因子的大量釋放［1］。而其上游的α7nAChR 在機(jī)體抗炎過(guò)程中，具有重要作用［3］，具體為通過(guò)增加α7nAChR，可有效抑制NF－κBp65 的激活，減少IL－4、TNF－α 和IL－10 等炎癥因子的釋放，從而有效抑制炎癥反應(yīng)，減輕機(jī)體組織損傷［1］。

本研究以皮下注射東莨菪堿誘導(dǎo)干眼豚鼠模型，造模后的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的角膜染色評(píng)分顯著上升，淚膜破裂時(shí)間、淚液分泌量明顯減少，表示造模成功。模型組淚腺組織中IL－4、TNF－α 和IL－10 含量明顯上升，NF－κBp65蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，表明在NF－κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活后，釋放炎癥因子，損傷淚腺細(xì)胞，促使淚腺腺泡細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致淚液分泌減少，淚膜穩(wěn)定性下降，角膜熒光染色上升，從而誘發(fā)干眼［7］。經(jīng)針刺干預(yù)后，針刺組干眼豚鼠角膜染色評(píng)分下降、淚膜破裂時(shí)間延長(zhǎng)、淚液分泌量增多，淚腺組織中IL－4、TNF－α 和IL－10 含量明顯下降，NFκBp65 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯減少，α7nAChR 相對(duì)表達(dá)量明顯增多，表明通過(guò)針刺治療之后，可能存在增加淚腺組織中α7nAChR，下調(diào)NF－κBp65 表達(dá)，從而抑制IL－4、TNF－α 和IL－10 等炎癥因子的釋放，緩解干眼癥狀。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，干眼屬“白澀癥”“神水將枯”等范疇，基本病理改變以“陰虛內(nèi)熱”為本［8-15］。通過(guò)針刺眼周穴位治療，可起到滋陰清熱，并促進(jìn)眼周經(jīng)絡(luò)氣血循環(huán)，從而有效改善干眼不適癥狀［16-18］。在眼周穴位中，太陽(yáng)為經(jīng)外奇穴，主治目疾?！妒セ莘健吩铺?yáng)“理風(fēng)，赤眼頭痛，目眩澀”；晴明既是足太陽(yáng)經(jīng)穴，又是五脈之會(huì)，乃治眼病要穴，可宣泄郁熱，主治目疾；瞳子髎為足少陽(yáng)膽經(jīng)頭面部的第一穴，有祛風(fēng)，泄熱，明目之功效；攢竹為膀胱經(jīng)之穴，取之以資調(diào)眼部氣血，滋陰清熱，《銅人》云攢竹“治眼中赤痛及瞼膶動(dòng)”；絲竹空為手少陽(yáng)之穴，主目赤腫痛。因此，將以上各穴聯(lián)用，可共奏滋陰清熱的功效。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺眼周穴位，能夠起到較好的滋陰清熱及促進(jìn)眼周氣血循環(huán)，從而有效改善干眼癥狀。

綜上，本研究基于NF－κB 信號(hào)通路，初步探討了關(guān)于針刺對(duì)干眼動(dòng)物淚腺組織中炎癥因子的調(diào)控機(jī)制。但本研究同樣存在其局限性和不足，如樣本量較小等，而這些也有待日后進(jìn)一步完善和改進(jìn)。