蟬蛻水煎劑對妊娠晚期大鼠子宮運(yùn)動節(jié)律及PGE2、COX－2水平的影響

王鋒，徐靜，童婷婷，崔利娜，付秀虹

（漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 462000）

分娩啟動是一個(gè)十分復(fù)雜的生理過程，是多種因素作用下的結(jié)果，其中子宮收縮活動與分娩啟動密切相關(guān)［1］。子宮收縮活動在妊娠期間處于被抑制狀態(tài)，妊娠早期表現(xiàn)為低強(qiáng)度子宮收縮，中期強(qiáng)度稍大，晚期明顯增大，且收縮頻率升高［2］。但部分孕婦因子宮收縮強(qiáng)度不足導(dǎo)致過期妊娠，增加了圍產(chǎn)兒的死亡風(fēng)險(xiǎn)。目前，臨床主要采用催產(chǎn)素進(jìn)行引產(chǎn)，但在臨床應(yīng)用中因個(gè)體劑量差異大難以掌握給藥劑量，常并發(fā)子宮破裂、軟產(chǎn)道損傷及宮縮過頻引起的胎兒窘迫等不良事件［3］。中醫(yī)藥在婦產(chǎn)科有重要地位，近年來關(guān)于中藥引產(chǎn)的報(bào)道有所增加，諸醫(yī)家遵照活血化瘀、行氣催產(chǎn)原則用藥，療效頗佳。蟬蛻為催產(chǎn)湯劑中常用的一味中藥材，王家興等［4］研究發(fā)現(xiàn)蟬蛻可促進(jìn)大鼠離體子宮平滑肌運(yùn)動，這可能對妊娠晚期孕婦催產(chǎn)有重要作用，但相關(guān)報(bào)道鮮見。故本實(shí)驗(yàn)建立妊娠晚期大鼠模型，分析蟬蛻對妊娠晚期大鼠子宮運(yùn)動節(jié)律的作用及其可能機(jī)制，為研發(fā)有經(jīng)濟(jì)效益的催產(chǎn)新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級SD 大鼠，性成熟未交配，8 周齡。其中雌性大鼠100 只，體質(zhì)量230～240 g，雄性大鼠50 只，體質(zhì)量280～290 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019－0010。飼養(yǎng)溫度22～26 ℃，相對濕度40%～60%，自然光照，自由攝食飲水。本次實(shí)驗(yàn)操作均符合一般動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器

蟬蛻（云南省藥材公司），制備成1 g/mL 濃度的蟬蛻水煎劑，臨用時(shí)配制成實(shí)驗(yàn)用藥濃度；催產(chǎn)素（上海禾豐制藥有限公司，規(guī)格10 U，國藥準(zhǔn)字H31020850）；雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone，P）ELISA 試劑盒（美國Abraxis 公司）；兔抗大鼠前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、環(huán)氧化酶－2（cyclooxygenase－2，COX－2）、GAPDH 一抗（北京西美杰科技有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（上海古朵生物科技有限公司）；DYB－2 電泳儀（上海博通化學(xué)科技有限公司）。

1.2 方法與觀測指標(biāo)

1.2.1 造模、分組及干預(yù)

將大鼠按雌雄2∶1合籠，每日上午8時(shí)進(jìn)行雌鼠陰道涂片檢查，發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)日為妊娠第1天。將100只妊娠大鼠隨機(jī)分為模型組、生理鹽水組（安慰組）、蟬蛻水煎劑低劑量組（中低組）、蟬蛻水煎劑高劑量組（中高組）、陽性對照組（陽性組），每組各20只。在大鼠妊娠第19 天開始灌胃給藥。中低組、中高組分別予以生藥含量0.375、0.75 g/mL的蟬蛻水煎劑，安慰組予以等體積生理鹽水，均灌胃1 mL；陽性組予以0.089 U/kg 的催產(chǎn)素尾靜脈注射給藥；模型組不予以任何干預(yù)。每組隨機(jī)取10 只大鼠觀察分娩啟動時(shí)間和產(chǎn)程時(shí)間，其余大鼠進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)并觀察檢測相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.2 子宮收縮強(qiáng)度、頻率及子宮收縮力測定

給藥20 h 后，取10 只大鼠用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，仰臥位固定，在下腹部正中取切口，在一側(cè)子宮中段置入電極，連接肌肉張力換能器、二導(dǎo)生理記錄儀，靈敏度2 mV/cm，走紙速度1 mm/s。觀察大鼠子宮收縮情況，記錄宮縮幅度、頻率，計(jì)算宮縮力。

宮縮力=宮縮幅度×宮縮頻率

1.2.3 HE染色觀察子宮宮頸組織形態(tài)學(xué)

上述實(shí)驗(yàn)完成后，脫頸處死大鼠，分離子宮頸，剔除宮頸外圍疏松組織，獲得宮頸組織，用4%多聚甲醛固定，制作5 μm 厚切片，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察各組大鼠宮頸形態(tài)學(xué)差異。

1.2.4 ELISA 法檢測大鼠血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平變化

處死大鼠后，腹主動脈采血，3 000 r/min 離心15 min，離心半徑10 cm，取上清置于－25 ℃冰箱內(nèi)保存。參考E2、P 的ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處測定吸光度值，計(jì)算大鼠血清E2、P濃度。

1.2.5 qRT－PCR 法檢測大鼠子宮組織中PGE2和COX－2的mRNA表達(dá)

取子宮肌條剪碎，Trizol裂解組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物由本實(shí)驗(yàn)室參考美國國立圖書館Pubmed基因庫中電腦軟件Primer5.0設(shè)計(jì)。PGE2：上游5'－AGAAGCTGATAATCGGGT－3'，下游5'－CCTAGTGAAGGATCC－3'，產(chǎn)物大小415 bp；COX－2：上 游5' －ACGGACTTGCTCACTTTG－3' ，下 游5' －AGGAGAACAGATGGGATT－3' ，產(chǎn)物大小377 bp；β－actin：上游5'－CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC－3'，下游5'－CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG－3'，產(chǎn)物大小690 bp。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃7 min 終止反應(yīng)。采用2－△△Ct法計(jì)算PGE2、COX－2 mRNA表達(dá)。

1.2.6 Western Blot 法檢測大鼠子宮組織中PGE2和COX－2的蛋白表達(dá)

取子宮肌條剪碎，加裂解緩沖液溶解，超聲勻漿，15 000 r/min，離心半徑10 cm，取上清。用Brad－Fold法檢測蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行SDS－PAGE 凝膠電泳，取10 μg 蛋白加5 × 加樣緩沖液，沸水浴變性后，電轉(zhuǎn)PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉24 h。加兔抗大鼠PGE2、COX－2、GAPDH 一抗（1∶1 000 稀釋）孵育過夜，次日加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000 稀釋）孵育2 h。ECL 顯影，用Image 圖像分析軟件計(jì)算目標(biāo)條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析與LSD－t比較。以P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠分娩啟動時(shí)間和產(chǎn)程時(shí)間比較

與模型組比較，中低組、中高組、陽性組大鼠分娩啟動時(shí)間與總產(chǎn)程時(shí)間較短（P＜0.05）；中低組、中高組、陽性組分娩啟動時(shí)間與總產(chǎn)程時(shí)間依次縮短，經(jīng)組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組與安慰組分娩啟動時(shí)間與總產(chǎn)程時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠分娩啟動時(shí)間和總產(chǎn)程時(shí)間比較（±s）

表1 各組大鼠分娩啟動時(shí)間和總產(chǎn)程時(shí)間比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05；與中高組比較，&P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組陽性組F值P值n 10 10 10 10 10分娩啟動時(shí)間（h）27.42±3.15 27.39±3.02 22.79±1.47*20.01±1.25*#17.22±1.82*#&38.918＜0.001總產(chǎn)程時(shí)間（min）118.33±10.75 117.45±9.39 106.52±5.38*95.06±4.43*#80.48±3.11*#&48.897＜0.001

2.2 各組大鼠宮縮強(qiáng)度、頻率及宮縮力比較

與模型組比較，中低組、中高組、陽性組大鼠宮縮頻率較高，宮縮強(qiáng)度及宮縮力較大（P＜0.05）；中低組、中高組、陽性組大鼠宮縮頻率依次增高，宮縮強(qiáng)度及宮縮力依次增大，經(jīng)組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組與安慰組大鼠宮縮強(qiáng)度、頻率及宮縮力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠宮縮強(qiáng)度、頻率及宮縮力比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠宮縮強(qiáng)度、頻率及宮縮力比較（n=10，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05；與中高組比較，&P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組陽性組F值P值宮縮幅度（mV）1.78±0.10 1.81±0.12 2.03±0.14*2.25±0.11*#2.42±0.12*#&54.518＜0.001宮縮頻率（次/min）2.50±0.12 2.51±0.13 2.86±0.11*3.01±0.14*#3.39±0.13*#&86.877＜0.001宮縮力（mV/min）4.45±0.16 4.47±0.15 5.76±0.13*6.77±0.16*#8.20±0.24*#&861.117＜0.001

2.3 各組大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)比較

模型組、安慰組大鼠宮頸結(jié)締組織與膠原纖維排列有序，間質(zhì)略水腫；與模型組比較，中低組、中高組、陽性組宮頸結(jié)締組織與膠原纖維排列紊亂、疏松，間質(zhì)水腫明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)比較（HE，×400）

2.4 各組大鼠血清E2和P水平比較

與模型組比較，中低組、中高組、陽性組大鼠血清E2水平較高，P 水平較低（P＜0.05）；中低組、中高組、陽性組大鼠血清E2水平依次遞增，P 水平依次遞減，經(jīng)組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組與安慰組大鼠血清E2和P 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清E2和P水平比較（±s，mg/mL）

表3 各組大鼠血清E2和P水平比較（±s，mg/mL）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05；與中高組比較，&P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組陽性組F值P值n 10 10 10 10 10 E2 11.56±0.75 11.63±0.86 26.48±2.18*30.47±2.45*#34.99±2.77*#&298.924＜0.001 P 85.32±7.45 85.57±7.66 46.69±5.15*41.86±4.23*#34.63±3.54*#&178.068＜0.001

2.5 各組大鼠子宮組織中COX－2 和PGE2的mRNA表達(dá)比較

與模型組比較，中低組、中高組大鼠子宮組織中COX－2、PGE2的mRNA 表達(dá)水平較高（P＜0.05）；中低組、中高組大鼠子宮組織中COX－2、PGE2的mRNA表達(dá)水平依次遞增，經(jīng)組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組與安慰組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的mRNA 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的mRNA表達(dá)情況比較（±s）

表4 各組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的mRNA表達(dá)情況比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組F值P值n 10 10 10 10 COX－2 0.11±0.01 0.16±0.02 0.62±0.03*0.79±0.08*#610.658＜0.001 PGE2 0.13±0.01 0.14±0.02 0.55±0.04*0.72±0.08*#501.033＜0.001

2.6 各組大鼠子宮組織中COX－2 和PGE2 的蛋白表達(dá)

與模型組比較，中低組、中高組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的蛋白表達(dá)水平較高（P＜0.05）；中低組、中高組大鼠子宮組織中COX－2 和PGE2的蛋白表達(dá)水平依次遞增，經(jīng)組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組與安慰組大鼠子宮組織中COX－2和PGE2的蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、圖2。

表5 各組大鼠子宮組織中COX－2、PGE2蛋白表達(dá)情況比較（±s）

表5 各組大鼠子宮組織中COX－2、PGE2蛋白表達(dá)情況比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05；與中低組比較，#P ＜0.05。

組別模型組安慰組中低組中高組F值P值n 10 10 10 10 COX－2 0.08±0.01 0.09±0.01 0.37±0.03*0.69±0.04*#1 144.519＜0.001 PGE2 0.09±0.01 0.08±0.01 0.44±0.05*0.68±0.07*#505.000＜0.001

圖2 大鼠子宮組織中PGE2、COX－2蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

分娩為正常生理現(xiàn)象，古人提倡“瓜熟蒂落”，但往往會有某些原因引起“瓜熟蒂不落”，妊娠時(shí)間過長，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)窒息，出現(xiàn)不良母嬰結(jié)局［5］。妊娠晚期孕婦的子宮運(yùn)動節(jié)律與分娩發(fā)動、引產(chǎn)成敗、產(chǎn)程長短均密切相關(guān)，故探索一種可調(diào)節(jié)子宮運(yùn)動節(jié)律的方法是產(chǎn)科亟待解決的重大課題。蟬蛻有很長的臨床應(yīng)用歷史，其性寒味甘，為辛涼解表藥，入肺、肝經(jīng)，有解痙、散風(fēng)、除熱之功效?！墩渲槟宜幮再x》記載，蟬蛻為妊娠禁藥，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其有免疫抑制、抗驚厥、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解熱等作用［6］，其所含甲殼質(zhì)被用于避孕殺精藥，但鄭梅等［7］在探討蟬蛻抗生育作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，蟬蛻對離體動物子宮平滑肌有促興奮作用。子宮平滑肌興奮性與子宮收縮節(jié)律密切相關(guān)，維持穩(wěn)定的子宮收縮節(jié)律，增強(qiáng)子宮收縮力是正常分娩、加快產(chǎn)程的關(guān)鍵。故本研究嘗試探討蟬蛻作為妊娠晚期大鼠催產(chǎn)藥的作用及其機(jī)制，以期為中藥催產(chǎn)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

子宮收縮力是臨產(chǎn)時(shí)產(chǎn)力的主要力量，也是分娩的主體推動力［8］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中低組、中高組大鼠宮縮頻率較高，宮縮強(qiáng)度及宮縮力較大，分娩啟動時(shí)間與總產(chǎn)程時(shí)間較短，提示蟬蛻水煎劑用于妊娠晚期大鼠催產(chǎn)，可增強(qiáng)宮縮力，誘發(fā)分娩啟動，并縮短產(chǎn)程?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明［9］，宮頸結(jié)締組織的主要構(gòu)成成分是膠原纖維，在促進(jìn)宮頸成熟、增強(qiáng)宮縮中起突出作用的是宮頸膠原纖維降解和重新排列。在本研究中，HE 染色觀察子宮組織形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，中低組、中高組宮頸結(jié)締組織與膠原纖維排列紊亂、疏松，間質(zhì)水腫明顯，這些生理性能變化是宮頸成熟的結(jié)果，提示蟬蛻水煎劑可改變子宮組織形態(tài)，促進(jìn)宮頸成熟。KARAKO 等［10］報(bào)道E2、P 與宮頸成熟密切相關(guān)。E2可誘導(dǎo)肌細(xì)胞縫隙連接的形成，并提高子宮肌層興奮性，促進(jìn)前列腺素合成，從而促使宮頸成熟。孕期E2、P 由胎盤、胎膜合成與代謝，局部子宮內(nèi)E2濃度升高，當(dāng)E2與P 比值升高到超出P 抑制作用的程度時(shí)，即可促進(jìn)宮頸成熟，使分娩發(fā)動。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中低組、中高組大鼠血清E2水平較高，P 水平較低，提示蟬蛻水煎劑可調(diào)節(jié)妊娠晚期大鼠血清E2與P 濃度，對宮頸成熟、分娩發(fā)動有積極作用。

關(guān)于分娩發(fā)動的機(jī)制至今仍未闡明，但PGE2是與分娩發(fā)動關(guān)系研究中最受關(guān)注的細(xì)胞因子，其作用已經(jīng)在臨床上得到證實(shí)［11］。CHOWDHARY 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，人胎膜局部釋放PGE2可誘導(dǎo)子宮平滑肌收縮以及宮頸成熟。PGE2在分娩啟動前無變化，妊娠晚期時(shí)宮內(nèi)組織胎盤、羊膜、子宮肌等組織均可產(chǎn)生PGE2，并作用于局部誘導(dǎo)子宮收縮，還可促進(jìn)子宮縫隙連接形成，為分娩發(fā)動奠定基礎(chǔ)。SLATER 等［13］報(bào)道，COX－1、COX－2 為中樞前列腺素合成酶，COX－1 mRNA 在羊膜與絨毛膜蛻膜中呈低表達(dá)，且不隨胎齡增長而變化，僅COX－2 mRNA 表達(dá)隨胎齡增加，在妊娠晚期及分娩時(shí)，COX－2 mRNA 表達(dá)異常升高，導(dǎo)致前列腺素合成酶活性升高，從而誘導(dǎo)羊水PGE2濃度升高。本研究中，與模型組比較，中低組、中高組COX－2 和PGE2的mRNA 與蛋白表達(dá)均上調(diào)，提示蟬蛻水煎劑可上調(diào)子宮組織COX－2 和PGE2表達(dá)，這可能是其促進(jìn)子宮收縮的機(jī)制之一。

綜上所述，蟬蛻水煎劑可調(diào)節(jié)妊娠晚期大鼠子宮運(yùn)動節(jié)律，上調(diào)子宮組織PGE2、COX－2 表達(dá)，但本研究仍無足夠證據(jù)證明蟬蛻水煎劑的催產(chǎn)作用機(jī)制與子宮組織PGE2、COX－2 表達(dá)上調(diào)相關(guān)，這將是未來的研究方向。