細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠協(xié)助干細(xì)胞移植治療的優(yōu)勢(shì)及不足分析

董鴻斐，王 冰，黃 茜，原小惠，孫紅玉，湯禮軍

自1980年發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞的可塑性后，大量研究表明干細(xì)胞在促進(jìn)組織、器官愈合與再生中發(fā)揮重要作用[1-2]。為此，人們追求研究各類干細(xì)胞，主要包括間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、神 經(jīng) 干 細(xì) 胞(neural stem cells，NSCs)和多能 干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSCs）[3]。目前，基于干細(xì)胞的療法已在骨骼重塑、心肌損傷、帕金森病、糖尿病和眼底病變等多個(gè)疾病中研究報(bào)道，并普遍被認(rèn)為是安全、有效的[4-6]。盡管干細(xì)胞在組織修復(fù)、功能重建和器官再造等方面極具潛力，但干細(xì)胞治療還存在若干不足。通過(guò)將細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）制備成細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠（extracellular matrix hydrogel，ECMH），為克服干細(xì)胞移植治療中的不足帶來(lái)了希望。在此，筆者主要探討ECMH在干細(xì)胞移植治療中的優(yōu)勢(shì)和不足。

1 ECMH應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療的原因

近年來(lái)，隨著對(duì)干細(xì)胞移植治療的研究不斷加深，也暴露出干細(xì)胞移植治療中存在的若干問(wèn)題。首先，在大多數(shù)臨床試驗(yàn)中，干細(xì)胞多在無(wú)任何載體的情況下通過(guò)注射器或者導(dǎo)管被注射到組織中，導(dǎo)致干細(xì)胞在注射過(guò)程中泄露及損傷的發(fā)生率較高；其次，不論干細(xì)胞移植方案如何變化，通常移植后只有少于5%的干細(xì)胞在注射部位持續(xù)存在并發(fā)揮治療作用[7]；最后，干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)處于不同的細(xì)胞微環(huán)境中，適宜的干細(xì)胞微環(huán)境有助于保持干細(xì)胞的數(shù)量并具有調(diào)控干細(xì)胞的分化成熟的作用[8-9]，但是干細(xì)胞移植部位的微環(huán)境卻常因炎癥、創(chuàng)傷和氧化應(yīng)激等因素影響變得惡劣，不利于干細(xì)胞存活及增殖分化，降低干細(xì)胞的治療效果。為改善干細(xì)胞移植過(guò)程中存在的問(wèn)題，研究人員在組織工程上進(jìn)行了多方面嘗試，發(fā)現(xiàn)水凝膠可以有效改善干細(xì)胞治療中的不足。水凝膠是含水量高的高分子多聚鏈化合物材料，多聚鏈通過(guò)物理和化學(xué)的交聯(lián)作用保持結(jié)構(gòu)的完整性，從天然材料（如纖維蛋白、海藻酸鈉等）到合成材料（如聚乙二醇或聚丙烯酸等）均可制備成水凝膠[10]。在聯(lián)合干細(xì)胞治療中，水凝膠通過(guò)其可構(gòu)建類似細(xì)胞外基質(zhì)的特性，為干細(xì)胞提供適宜的微環(huán)境，從而提高干細(xì)胞移植治療效果。Moxon等[11]在生理?xiàng)l件下通過(guò)物理混合受控凝膠化將膠原蛋白原纖維摻入藻酸鹽水凝膠中，再將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cells,iPSC）衍生神經(jīng)元封裝在混合水凝膠內(nèi)，發(fā)現(xiàn)水凝膠中包封的神經(jīng)元形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并成熟為可表達(dá)突觸素的分支神經(jīng)元。還有大量研究都證明通過(guò)構(gòu)建類似細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境可以有效提高干細(xì)胞的增殖及分化[12-13]。但在人體內(nèi)，不同組織的細(xì)胞外微環(huán)境各有差異，傳統(tǒng)的水凝膠制備由于其結(jié)構(gòu)單一及細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的阻斷，嚴(yán)重的限制了水凝膠與干細(xì)胞復(fù)合體在臨床中的應(yīng)用。將為不同組織提供微環(huán)境的ECM制備成ECMH，可解決的傳統(tǒng)水凝膠的缺點(diǎn)。與傳統(tǒng)的水凝膠相比，由于ECMH保留了原有組織內(nèi)的膠原蛋白、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖和彈性蛋白等，因此具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）可構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)；（2）支持并連接組織結(jié)構(gòu)；（3）調(diào)節(jié)組織與細(xì)胞的相互作用。因此，ECMH有望取代傳統(tǒng)水凝膠，并廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療。

2 ECMH在干細(xì)胞移植中的優(yōu)勢(shì)

2.1 為干細(xì)胞提供適宜的細(xì)胞微環(huán)境 干細(xì)胞微環(huán)境是動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的，可以通過(guò)不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)和空間結(jié)構(gòu)來(lái)共同影響干細(xì)胞的表型及特征。而為干細(xì)胞提供微環(huán)境的基礎(chǔ)便是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）。ECM的生化成分、力學(xué)特征及微管結(jié)構(gòu)，都具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞行為的能力，通過(guò)對(duì)ECM成分的調(diào)節(jié)，可使干細(xì)胞達(dá)到預(yù)期的表型?；贓CM制備的ECMH可更好的模擬干細(xì)胞微環(huán)境，從而達(dá)到提高干細(xì)胞治療效果的目的。Bordbar等[14]將羊膝關(guān)節(jié)軟骨ECMH與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培育，結(jié)果表明所制備的水凝膠具有良好的細(xì)胞友好性，可以保持干細(xì)胞存活。Wu等[15]將豬半月板通過(guò)改良的脫細(xì)胞作用和酶消化作用，制備成豬半月板組織來(lái)源的ECMH，再來(lái)培養(yǎng)牛軟骨細(xì)胞和小鼠3T3成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與聚苯乙烯培養(yǎng)比較，豬半月板ECMH能顯著提高牛軟骨細(xì)胞和小鼠3T3成纖維細(xì)胞的生存率和增殖速度。這些結(jié)果表明由于ECMH因其具有獨(dú)特的微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和生物活性，可為干細(xì)胞提供更加適宜的細(xì)胞微環(huán)境。

2.2 對(duì)干細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性 要將ECMH應(yīng)用于干細(xì)胞移植并發(fā)揮良好的治療效果，首先需要確保干細(xì)胞可在ECMH中良好生存。因此，ECMH是否具有細(xì)胞毒性決定著移植干細(xì)胞的命運(yùn)。Getova等[16]將脂肪組織的ECM制備成水凝膠后，用于培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，來(lái)評(píng)估該ECMH的細(xì)胞毒性，連續(xù)培養(yǎng)7 d后結(jié)果顯示水凝膠內(nèi)細(xì)胞存活良好，并在ECMH中觀察到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和遷移。梁成宵等[17]用Live/Dead染色試劑盒檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A細(xì)胞在肝臟ECMH中的存活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRL-3A細(xì)胞在肝臟ECMH中培養(yǎng)1 d和3 d后BRL-3A細(xì)胞黏附數(shù)量明顯多于對(duì)照組，表明肝臟ECMH并無(wú)細(xì)胞毒性。以上結(jié)果均證明ECMH無(wú)細(xì)胞毒性，可以保證干細(xì)胞良好存活和遷移，有助于提高干細(xì)胞治療效果。

2.3 協(xié)同干細(xì)胞移植后有較低免疫原性 ECMH作為干細(xì)胞組織工程支架材料并應(yīng)用于臨床疾病治療，除了需要考慮ECMH的細(xì)胞毒性，還需考慮其是否會(huì)引起移植后免疫排斥反應(yīng)。Qiao等[18]將豬心肌組織來(lái)源的ECMH聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后，局部注射至急性心肌梗死后梗死邊界處的心肌中，連續(xù)觀察4 w后，發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌ECMH的組合可明顯增加血管生成，減少纖維化程度并減小梗塞面積，且未觀察到組織免疫反應(yīng)。Zhang等[19]為了評(píng)估衍生自豬膀胱組織的膀胱ECMH在大鼠腦組織中的生物相容性及免疫原性，將膀胱ECMH直接注射到正常大腦后，發(fā)現(xiàn)多種大腦組織損傷評(píng)估指標(biāo)無(wú)明顯變化，提示膀胱ECMH未引起大鼠腦組織免疫反應(yīng)。因此，ECMH具有良好的生物相容性及低免疫原性的特點(diǎn)，這也有助于協(xié)助干細(xì)胞體內(nèi)移植后發(fā)揮治療作用。

2.4 有助于干細(xì)胞存活 基于干細(xì)胞的療法可用于治療多種疾病和損傷，目前主要應(yīng)用于臨床治療的多為間充質(zhì)干細(xì)胞，其治療作用通常歸因于間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)或促進(jìn)組織修復(fù)的作用[23]，因此保持干細(xì)胞的存活及增殖對(duì)干細(xì)胞治療效果有決定性作用。Jang等[21]分別使用豬心臟ECMH和膠原兩種不同的材料與人源心臟祖細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)心臟ECMH更能增強(qiáng)人源心臟祖細(xì)胞的存活、增殖和分化。Lin等[22]通過(guò)將豬外周神經(jīng)脫細(xì)胞化后制備成ECMH用來(lái)培養(yǎng)施旺細(xì)胞(Schwann's cell)，發(fā)現(xiàn)豬外周神經(jīng)ECMH中的細(xì)胞外基質(zhì)成分和其納米纖維結(jié)構(gòu)特征有助于促進(jìn)施旺細(xì)胞存活和增殖。Ozpinar等[23]通過(guò)使用豬直皮ECMH與I型膠原水凝膠分別培養(yǎng)人源性肥大細(xì)胞來(lái)觀察豬直皮ECMH對(duì)肥大細(xì)胞代謝活性、細(xì)胞活力和受體表達(dá)的影響，結(jié)果在豬直皮ECMH中培養(yǎng)時(shí)，人源肥大細(xì)胞表現(xiàn)出不同的代謝活性，同時(shí)與肥大細(xì)胞成熟/激活相關(guān)的免疫球蛋白E（IgE）受體也被上調(diào)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相較于傳統(tǒng)水凝膠，ECMH可明顯提高干細(xì)胞生存率并有助于干細(xì)胞增殖，是一種良好的干細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.5 具有誘導(dǎo)干細(xì)胞向成體細(xì)胞分化的作用 干細(xì)胞移植治療的成功還取決于干細(xì)胞在移植后是否能夠保持其增殖、分化和表型的能力。Bordbar等[14]將羊膝關(guān)節(jié)軟骨ECMH與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同構(gòu)建干細(xì)胞復(fù)合體，觀察到嵌入在水凝膠內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成軟骨細(xì)胞。Zhang等[24]將制備的人胎盤ECMH與高傳代（P8）直皮乳頭細(xì)胞（dermal papilla cells，DPCs）混合成球體后，發(fā)現(xiàn)P8-DPCs在傳代表達(dá)缺失的與毛誘導(dǎo)能力相關(guān)的基因表達(dá)得到了恢復(fù)，進(jìn)一步將水凝膠-干細(xì)胞復(fù)合體移植于裸鼠皮下，兩周后觀察到毛發(fā)再生，而單純細(xì)胞移植組無(wú)毛發(fā)再生現(xiàn)象，證明人胎盤ECMH可通過(guò)活化表達(dá)關(guān)鍵基因來(lái)調(diào)節(jié)DPCs的形態(tài)和功能，使原本不能表達(dá)的與毛誘導(dǎo)能力相關(guān)的基因表達(dá)得到了恢復(fù)。以上研究表明，ECMH具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)干細(xì)胞向成體細(xì)胞分化的能力。

3 ECMH在干細(xì)胞移植治療中面對(duì)的問(wèn)題

目前，ECMH由于其類似組織的物理特性、獨(dú)特的3D環(huán)境結(jié)構(gòu)特性及出色的細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，已被認(rèn)為是干細(xì)胞培養(yǎng)的黃金標(biāo)準(zhǔn)[25]。隨著ECMH在干細(xì)胞培養(yǎng)和移植方面應(yīng)用普及，其優(yōu)勢(shì)逐漸得以體現(xiàn)，但將人體組織來(lái)源的ECMH應(yīng)用于臨床治療，尚處于生物材料學(xué)領(lǐng)域的起步階段。此外，ECMH的臨床應(yīng)用還需面對(duì)以下問(wèn)題：（1）由于ECMH制備的原材料為動(dòng)物組織和器官，在臨床應(yīng)用中應(yīng)盡可能降低組織來(lái)源差異引起的免疫反應(yīng)，所以理想的材料為人體組織，這使得ECMH的原材料供應(yīng)成為一個(gè)首要障礙；（2）從人體組織中獲取ECM必須面對(duì)個(gè)體間變異所產(chǎn)生的組織差異性，差異性的來(lái)源包括年齡、性別、種族等多個(gè)方面，這些差異極大的降低了ECMH的生產(chǎn)重復(fù)性，這種生產(chǎn)批次間的變異影響了其臨床應(yīng)用；（3）由于ECM結(jié)構(gòu)成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)的多元化并不利于找們理解細(xì)胞外信號(hào)及ECM組分在細(xì)胞器形成中的作用，這些問(wèn)題導(dǎo)致在干細(xì)胞治療中，很難根據(jù)干細(xì)胞種類及應(yīng)用部位選擇最適合的ECMH。

4 ECMH應(yīng)用于干細(xì)胞移植的展望

將ECMH應(yīng)用于干細(xì)胞的體內(nèi)移植，在臨床中的可行性仍未明確，但已有大量的文獻(xiàn)綜述表明ECMH在干細(xì)胞移植中的應(yīng)用潛力。隨著合成和加工技術(shù)的發(fā)展，ECMH的設(shè)計(jì)將不斷更新。動(dòng)態(tài)ECMH的發(fā)展不僅可以為干細(xì)胞提供良好的微環(huán)境，還將為干細(xì)胞提供更加多元的外部觸發(fā)因素（例如光、聲音）[26]。這些動(dòng)態(tài)特性可以更加深層次的影響干細(xì)胞的生物信號(hào)傳導(dǎo)和力學(xué)結(jié)構(gòu)形態(tài)，為干細(xì)胞治療提供更好的助力。