4-苯基丁酸對高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響△

王 芳 李寶海 李 吉 葉 巍 馬濟遠 蘇靜波 周 健

高血糖是導(dǎo)致糖尿病性白內(nèi)障(DC)的主要危險因素[1-2]。長期的高血糖通過引起晶狀體上皮細胞氧化應(yīng)激、滲透壓應(yīng)激以及非酶糖基化等改變導(dǎo)致晶狀體混濁[1]。近年的研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與DC發(fā)病密切相關(guān)[3]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的異常變化是觸發(fā)晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT的重要因素，本課題組在糖尿病小鼠晶狀體中發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT與ERS有關(guān)[4]。活性氧(ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與包括EMT在內(nèi)的眾多病理生理學(xué)過程[5-6]，而ERS又可通過提高細胞內(nèi)ROS水平參與調(diào)節(jié)EMT[7]。4-苯基丁酸 (4-PBA) 是一種相對分子質(zhì)量較小的脂肪酸[8]，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，可減輕非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，進而降低ERS水平[9-10]。本研究通過觀察4-PBA對高濃度葡萄糖(簡稱高糖)刺激人晶狀體上皮細胞系HLE-B3細胞發(fā)生EMT的影響，進一步探討ERS誘導(dǎo)EMT的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人晶狀體上皮細胞系HLE-B3細胞為北京眼科研究所張煒研究員惠贈；DMEM低及高濃度葡萄糖(葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1、30.0 mmol·L-1)培養(yǎng)基、胎牛血清、2.5 g·L-1胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；ROS檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE配膠、RIPA裂解液、β-actin抗體以及GAPDH抗體均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GRP78、CHOP以及p-eIF2α均購自美國Cell Signaling Technology公司；eIF2α、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體以及HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體均購自美國Santa Cruz公司； E-cadherin、α-SMA以及Snail均購自英國Abcam公司；山羊抗兔熒光二抗購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 HLE-B3細胞的培養(yǎng)及處理HLE-B3細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM低濃度葡萄糖培養(yǎng)基中，置于含體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期、融合度70%～80%的細胞用于實驗。用含體積分數(shù)0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，使細胞周期同步化。

將培養(yǎng)的HLE-B3細胞分為正常對照組、高糖組、4-PBA預(yù)處理+高糖組。正常對照組：細胞用含5.5 mmol ·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h；高糖組：細胞用上述DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)后再用30.0 mmol·L-1葡萄糖處理6 h；4-PBA預(yù)處理+高糖組：正常培養(yǎng)的細胞用1 mmol·L-14-PBA先處理1 h，然后用添加含30.0 mmol ·L-1葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h。各組細胞處理6 h后進行相關(guān)指標的檢測。

1.2.2 各組HLE-B3細胞的形態(tài)觀察將HLE-B3細胞以每孔10×103個的密度接種于特定共聚焦皿中，待細胞融合度70%～80%時，更換為含體積分數(shù)0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，使細胞周期同步化，按上述分組分別處理細胞6 h，在倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞內(nèi)ROS含量采用DCFH-DA法檢測各組細胞內(nèi)ROS的含量。取對數(shù)生長期細胞，按上述分組進行處理，培養(yǎng)6 h后換含10 μmol·L-1DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基置于 37 ℃培養(yǎng)箱中孵育細胞20 min，用溫PBS清洗細胞1次，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細胞，終止消化后制成細胞懸液。分別收集于15 mL離心管中，經(jīng)1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，再用1 mL溫PBS重懸細胞，轉(zhuǎn)移至EP管中，再次經(jīng)1000 r·min-1離心5 min，收集細胞，用流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度(FITC-A)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中不同因子的相對表達量取對數(shù)生長期的HLE-B3細胞按上述分組進行處理6 h，收集細胞，按照試劑盒說明分別提取各組細胞總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對提取的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄。其中，E-cadherin上游引物：5’-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3’，下游引物：5’-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3’；α-SMA上游引物：5’-GGGAATGGGACAAAAAGACA-3’，下游引物：5’-CTTCAGGGGCAACACGAA-3’；Snail上游引物：5’-CCCCAATCGGAAGCCTAACT-3’，下游引物：5’-GCTGGAAGGTAAACTCTGGATTAGA-3’。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt計算各組細胞中不同目的基因的相對表達量。

1.2.5 Western blot 檢測各組細胞中不同目標蛋白的表達取對數(shù)生長期HLE-B3細胞，按上述分組進行處理6 h，收集細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用BCA 法檢測蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg樣品，行SDS-PAGE電泳分離蛋白，采用50 g·L-1濃縮膠和100 g·L-1分離膠，電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將PVDF膜按照目標蛋白的相對分子質(zhì)量進行裁剪，在室溫下用封閉液室溫封閉PVDF膜2 h，分別加入與目標蛋白相應(yīng)的特異性一抗(稀釋度均為1500)，4 ℃過夜，用含Tween20的PBS漂洗PVDF膜3次，每次5 min。再使用相應(yīng)的HRP標記的二抗(稀釋度均為13000)，37 ℃孵育1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光法使蛋白條帶顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并測量蛋白條帶的灰度值，以β-actin或GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參。實驗重復(fù)至少3次，取平均值。目標蛋白表達量的相對灰度值為目標蛋白灰度值/β-actin(GAPDH)灰度值。

1.2.6 免疫熒光染色觀察各組細胞中E-cadherin和α-SMA的表達將細胞接種于特定共聚焦皿中，當(dāng)細胞融合度70%～80%時，按上述分組處理細胞6 h，用40 g·L-1多聚甲醛固定細胞30 min，用PBS洗5 min×3次，用體積分數(shù)1%BSA、1%TritonX-100室溫封閉30 min。分別用兔抗人E-cadherin(1100)和兔抗人α-SMA(1100)孵育細胞，在4 ℃濕盒中過夜；用PBS洗10 min×3次，在室溫下避光、用山羊抗兔(1200)二抗孵育2 h，經(jīng)PBS洗10 min×3次后，用DAPI染細胞核15 min，再用甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism7.0數(shù)據(jù)分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較方差齊時用Tukey 法。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞的形態(tài)學(xué)變化HLE-B3細胞分別經(jīng)過正常、高糖、4-PBA預(yù)處理后高糖再處理6 h后發(fā)現(xiàn)，正常對照組HLE-B3細胞呈多邊形貼壁生長，邊界清晰；高糖組HLE-B3細胞呈長梭形改變，丟失上皮細胞特性，類似纖維細胞的表型；4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細胞形態(tài)不規(guī)則，與高糖組相比，長梭形細胞數(shù)量較少(圖1)。

2.2 各組HLE-B3細胞中ROS含量的變化流式細胞術(shù)檢測各組HLE-B3細胞中ROS熒光強度發(fā)現(xiàn)，正常對照組93.2%的細胞、高糖組99.7%的細胞和4-PBA 預(yù)處理+高糖組99.8%的細胞的相對熒光強度分別為(9.30±1.07)%、(68.63±1.68)%和(22.13±0.82)%，組間比較總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=628.00，P<0.01)。與正常對照組和4-PBA預(yù)處理+高糖組相比，高糖組HLE-B3細胞相對熒光強度明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=29.76、24.81，均為P<0.01)；4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細胞相對熒光強度稍高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=9.501，P<0.01)。

2.3 ERS信號通路相關(guān)分子的蛋白表達變化Western blot檢測結(jié)果顯示，高糖組HLE-B3細胞中ERS信號通路相關(guān)分子GRP78、CHOP以及p-eIF2α蛋白的相對表達量均比正常對照組增高(均為P<0.05)，提示高糖激活細胞的ERS通路；與高糖組相比，4-PBA預(yù)處理+高糖組細胞中GRP78、CHOP及p-eIF2α的蛋白相對表達量均顯著降低(均為P<0.05)，而與正常對照組相比，GRP78、CHOP及p-eIF2α的蛋白相對表達量均明顯增高(均為P<0.05)(圖2、表1)。

2.4 EMT標志分子的表達變化

2.4.1 各組細胞中實時熒光定量PCR檢測結(jié)果實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，高糖組HLB-E3細胞中E-cadherin mRNA相對表達水平較正常對照組明顯降低(P<0.05)，4-PBA預(yù)處理+高糖組HLB-E3細胞中E-cadherin mRNA相對表達水平較高糖組明顯增高(P<0.05)，但仍比正常對照組低(P<0.05)。高糖組HLB-E3細胞中α-SMA mRNA相對表達水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)；4-PBA 預(yù)處理+高糖組HLE-B3細胞中α-SMA mRNA相對表達水平較高糖組降低(P<0.05)，同時也低于正常對照組(P<0.05)。 高糖組HLE-B3細胞中Snail mRNA相對表達水平較正常對照組明顯升高(P<0.05)，4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細胞中Snail mRNA相對表達水平較高糖組降低(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.05)(表2)。

2.4.2 各組細胞中E-cadherin、α-SMA和Snail的蛋白表達Western blot檢測結(jié)果顯示，各組HLE-B3細胞中E-cadherin、α-SMA和Snail的蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.93、121.20、50.96；均為P<0.05)(圖3)。高糖組細胞中E-cadherin蛋白相對表達量顯著低于正常對照組(P<0.05)；4-PBA預(yù)處理+高糖組細胞中E-cadherin蛋白相對表達量較高糖組增高(P<0.05)，但仍低于正常對照組(P<0.05)。高糖組細胞中α-SMA 蛋白相對表達量顯著高于正常對照組(P<0.05)，4-PBA預(yù)處理+高糖組細胞中α-SMA蛋白相對表達量較高糖組明顯降低(P<0.05)，也低于正常對照組(P<0.05)。高糖組細胞中Snail蛋白相對表達量顯著高于正常對照組(P<0.05)，4-PBA預(yù)處理+高糖組細胞中Snail蛋白相對表達量較高糖組明顯降低(P<0.05)，但高于正常對照組(P<0.05)(表3)。

2.4.3 各組細胞中E-cadherin、α-SMA蛋白免疫熒光染色結(jié)果免疫熒光染色結(jié)果顯示，E-cadherin蛋白在正常對照組HLE-B3細胞中呈強陽性表達，為強綠色熒光；高糖組HLE-B3細胞中E-cadherin熒光弱于正常對照組，4-PBA 預(yù)處理+高糖組HLE-E3細胞中E-cadherin熒光增強。正常對照組細胞中α-SMA蛋白呈弱陽性表達；高糖組細胞中α-SMA蛋白表達量明顯高于正常對照組，為強紅色熒光，4-PBA 預(yù)處理+高糖組細胞中α-SMA熒光減弱(圖4)。

3 討論

當(dāng)機體受到各種外源性或內(nèi)源性刺激，如氧化應(yīng)激、缺血缺氧、鈣平衡失調(diào)等因素的影響時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)環(huán)境被破壞，蛋白質(zhì)將無法進行正確的修飾和折疊,造成未折疊和錯誤折疊的蛋白分子大量堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)這些錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量聚集超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理的能力時就會啟動ERS[11-12]。高血糖是引起各器官損害的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖引起體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞、糖尿病小鼠晶狀體上皮細胞中ERS通路相關(guān)分子GRP78、CHOP表達均增高，表明高糖誘導(dǎo)了ERS的發(fā)生[4,13]。

上皮細胞發(fā)生EMT是組織器官發(fā)生纖維化的重要病理基礎(chǔ)。近年來研究表明，ERS和未折疊蛋白反應(yīng)與器官纖維化相關(guān)[14-15],提示ERS與EMT也可能有密切聯(lián)系。為驗證ERS在高糖引起的晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT中的重要作用，本研究使用化學(xué)分子伴侶4-PBA調(diào)節(jié)HLE-B3細胞ERS反應(yīng)強度，觀察高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT的變化。4-PBA是目前最常用的ERS抑制劑，其作用原理是通過增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的能力和穩(wěn)定未折疊或錯誤折疊蛋白的構(gòu)象以促進其轉(zhuǎn)運，從而達到減輕ERS反應(yīng)強度的目的[8，16-17]。 Baek等[18]用4-PBA預(yù)處理TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細胞，結(jié)果顯示細胞的ERS反應(yīng)強度降低，同時TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細胞中α-SMA、ColⅠ蛋白表達均下調(diào)，提示4-PBA通過抑制ERS反應(yīng)起到減輕細胞發(fā)生EMT的作用。

GRP78是ERS的一個經(jīng)典標志物之一，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶蛋白，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。當(dāng)ERS顯著激活時，GRP78蛋白與PERK蛋白解離，PERK蛋白磷酸化活性增強，激活下游eIF2α的磷酸化，增加CHOP的表達，引起細胞損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細胞中GRP78、CHOP以及p-eIF2α蛋白相對表達水平均較高糖組顯著降低，但仍顯著高于對照組，提示4-PBA可部分抑制高糖誘導(dǎo)的HLE-B3細胞ERS，這可能與4-PBA的刺激濃度較低或作用時間較短有關(guān)。值得注意的是，4-PBA抑制ERS時，高糖引起的細胞內(nèi)ROS含量明顯減輕?；诖?，我們認為高糖激活細胞ERS使細胞內(nèi)ROS含量增高并參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT。進一步研究發(fā)現(xiàn)， 4-PBA預(yù)處理+高糖組HLE-B3細胞E-cadherin的表達上調(diào)，α-SMA和Snail的表達下調(diào)。誘導(dǎo)EMT發(fā)生的重要信號是核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Snail并使其表達上調(diào)，而Snail又能抑制上皮表型并激活間質(zhì)表型表達所需要的轉(zhuǎn)錄基因[20-21]。因此，本研究結(jié)果提示，4-PBA通過下調(diào)ERS反應(yīng)強度可有效抑制高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT，反向證實了ERS參與高糖導(dǎo)致晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT的過程。

綜上所述，本研究證實了ERS參與高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT的過程，4-PBA可通過抑制ERS、減少ROS含量、抑制高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT，從而對晶狀體上皮細胞起到保護作用，這為尋求治療DC的有效藥物提供了一定的理論和實驗依據(jù)。