脾酪氨酸激酶在肝臟疾病中的作用機(jī)制

樂瀅玉， 張榮臻， 吳 聰， 肖偉松， 覃小賓， 曾勝瀾， 毛德文

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生學(xué)院， 南寧 530222； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝病一區(qū)， 南寧 530023

脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)是一種72 kD的胞質(zhì)非受體酪氨酸激酶，是酪氨酸激酶中zeta-鏈相關(guān)蛋白激酶70/Syk家族的成員之一，其由兩個SRC同源2結(jié)構(gòu)域和一個C端酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成[1]。Syk參與多種細(xì)胞類型的信號傳導(dǎo)，在造血細(xì)胞中高度表達(dá)，包括肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、B淋巴細(xì)胞和未成熟T淋巴細(xì)胞，并在這些細(xì)胞的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。Syk的異常調(diào)控與不同的變應(yīng)性疾病、抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、腎臟疾病、肝纖維化和變應(yīng)性鼻炎)有關(guān)[2]。在免疫細(xì)胞中，Syk主要通過其串聯(lián)SRC同源2結(jié)構(gòu)域與免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosinebased activation motifs, ITAM)相互作用而發(fā)揮作用。在肥大細(xì)胞中，Syk通過高親和力的IgE受體FcεRI(high affinity IgE receptor, FcεRI)介導(dǎo)下游信號傳導(dǎo)，而在中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板中，下游信號傳導(dǎo)通過Igγ和FcγR(Fc gamma receptor, FcγR)受體介導(dǎo)[3]。由于Syk在B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞受體下游信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此在早期淋巴細(xì)胞發(fā)育中也扮演著重要角色[4]。Syk被激活后，調(diào)節(jié)下游信號傳導(dǎo)，驅(qū)動先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的炎癥通路。除在造血細(xì)胞中高度表達(dá)之外，研究[5]表明，Syk也在非造血細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、乳腺組織、肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出更廣泛的表達(dá)模式。Syk在肝細(xì)胞中通過G蛋白偶聯(lián)受體激活有絲分裂原活化蛋白激酶。除了與肝細(xì)胞有關(guān)，Syk還可以在肝巨噬細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[6]。然而，關(guān)于Syk信號通路在肝病中的研究仍然有限。因此，本文重點討論了Syk在常見肝臟疾病中的作用機(jī)制及其作為治療的潛在靶點所面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，以期為肝臟疾病的治療提供更好的思路和依據(jù)。

1 Syk的傳導(dǎo)機(jī)制

Syk的免疫受體信號傳導(dǎo)需要滿足以下兩個條件：Syk激酶活性，兩個SRC同源2結(jié)構(gòu)域。Syk激酶結(jié)構(gòu)域在靜止?fàn)顟B(tài)下保持非活性，但可以通過兩個SRC同源2結(jié)構(gòu)域與雙磷酸化的ITAM相互作用而被激活。即使在沒有磷酸化ITAM結(jié)合時，接頭區(qū)域內(nèi)的酪氨酸殘基也可導(dǎo)致激酶活化[7]。Syk的SRC同源2結(jié)構(gòu)域與磷酸化ITAM的結(jié)合是Syk激活和下游信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵步驟[8]。Syk既可以通過ITAM磷酸化，也能通過催化其接頭酪氨酸的自磷酸化，促使Syk活化，因此在初始ITAM介導(dǎo)的Syk激活過程中可能存在正反饋機(jī)制?；罨腟yk與大量下游信號傳導(dǎo)效應(yīng)因子結(jié)合，并通過影響轉(zhuǎn)錄因子的激活以及將其組裝到轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中來參與促炎基因的表達(dá)[9]。

2 Syk在肝臟疾病中的作用

2.1 Syk與肝纖維化 肝纖維化是由慢性肝損傷導(dǎo)致組織瘢痕形成和炎癥的過程，可進(jìn)一步發(fā)展為終末期肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[10]。進(jìn)行性肝纖維化多由病毒性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等疾病引起，以肝臟中細(xì)胞外基質(zhì)過多沉積為特征。據(jù)統(tǒng)計，全球肝纖維化發(fā)病率高達(dá)1%～2%，每年因肝纖維化死亡人數(shù)超過100萬[11-12]。HSC在細(xì)胞外基質(zhì)沉積和肝臟纖維形成中發(fā)揮核心作用[13]。HSC通常是靜息細(xì)胞，并作為類維生素A貯存細(xì)胞位于肝細(xì)胞和竇狀內(nèi)皮細(xì)胞之間的空隙(Disse空隙)[14]。肝損傷或微環(huán)境刺激激活靜息的HSC，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和積累，引發(fā)肝纖維化[15]。此外，活化的HSC失去其類維生素A貯存功能，高度增殖并產(chǎn)生大量趨化因子和細(xì)胞因子，進(jìn)一步增加了細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[16]。

研究[6]表明，Syk在HSC激活中起關(guān)鍵作用，Syk抑制劑在動物纖維化模型(包括四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠、二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠和膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠模型)中均能有效的阻斷HSC活化，從而有效減弱動物模型中的肝纖維化和HCC的形成。同時，抑制Syk表達(dá)可顯著降低纖維化相關(guān)基因(包括ACTA2、PDGFRβ、COL1A1)的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。此外，Syk存在兩個主要同工型Syk(L)和Syk(S)，其均在肝纖維化和HCC的發(fā)展中起著不同的作用。Syk(L)和Syk(S)mRNA在大鼠肝纖維化進(jìn)程中表達(dá)均得到增強(qiáng)，其中Syk(L)的表達(dá)水平在肝纖維化中起主要作用，而Syk (S)與腫瘤發(fā)生、HCC侵襲和轉(zhuǎn)移更為相關(guān)。據(jù)報道[17]，特定轉(zhuǎn)錄因子的選擇性表達(dá)對HSC的激活至關(guān)重要。Qu等[6]研究表明，Syk通過調(diào)節(jié)特定轉(zhuǎn)錄因子(MYB原癌基因轉(zhuǎn)錄因子、CREB結(jié)合蛋白和MYC原癌基因轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)以及與HSC增殖相關(guān)基因(MYC和CCND1)的表達(dá)來進(jìn)一步促進(jìn)HSC活化。

2.2 Syk與病毒性肝炎 近期研究[6,18]發(fā)現(xiàn)，Syk在HBV和HCV感染的慢性肝損傷患者的肝組織中高度表達(dá)，從而誘導(dǎo)HSC的激活和肝纖維化的發(fā)生。此外，一項關(guān)于HCV相關(guān)型HCC患者的基因表達(dá)譜的研究[19]表明，Syk是180個上調(diào)基因中上調(diào)幅度最大的基因之一。

HCV感染還與冰球蛋白血癥(B淋巴細(xì)胞增生性疾病)有關(guān)。CD81(cluster of differentiation 81，也被稱為TAPA1)是控制B淋巴細(xì)胞增殖的抗體的靶點。CD81是HCV侵入的關(guān)鍵受體，與HCV包膜蛋白E2相結(jié)合會誘導(dǎo)Syk的激活，從而導(dǎo)致ezrin和radixin磷酸化[20-21]。因此，Ezrin、radixin蛋白和Syk是肝細(xì)胞中HCV感染的重要調(diào)控因子和治療靶點[20]。此外，在HCV感染患者的肝細(xì)胞質(zhì)膜附近觀察到Syk的表達(dá)[22]。研究[23]表明，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5A的N末端部分(aa 1-175)以及中央部分(氨基酸237-302)參與了與Syk的物理相互作用，抑制Syk的酶活性；此外非結(jié)構(gòu)蛋白5A抑制了Syk介導(dǎo)的磷脂酶C-γ1的磷酸化，因此，促進(jìn)HCV感染肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并參與肝細(xì)胞的癌變。上述研究顯示，在HCV-CD81相互作用前阻斷Syk激活以及調(diào)節(jié)HCV在靶細(xì)胞內(nèi)的進(jìn)入和轉(zhuǎn)運(yùn)為拓展抗HCV療法提供了新的思路與策略。

2.3 Syk與酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD) ALD是指長期過量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和HCC。目前我國尚缺乏對ALD的流行病學(xué)調(diào)查，但據(jù)世界衛(wèi)生組織2018年的報告[24]，全世界每年約有300萬人死于酒精濫用，其中ALD占死亡人數(shù)的絕大部分。ALD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素繁多，包括乙醇介導(dǎo)的肝損傷、氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞損傷引發(fā)炎癥反應(yīng)、腸道通透性和微生物群組的改變[25]。酒精及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生活性氧，通過線粒體損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷[26-27]。受損的肝細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的募集和激活。參與ALD進(jìn)展的核心細(xì)胞類型是巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過刺激免疫細(xì)胞的浸潤和Kupffer細(xì)胞(常駐肝巨噬細(xì)胞)的激活，在誘導(dǎo)肝臟炎癥中發(fā)揮重要作用[25,28]。在ALD患者中，肝臟中的常駐和募集巨噬細(xì)胞被細(xì)菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharide, LPS)調(diào)控的Toll樣受體4(Toll like receptor 4, TLR4)信號通路激活，由于過量飲酒后腸道通透性增加，導(dǎo)致門靜脈和體循環(huán)中的LPS升高[29-30]。Syk在TLR4信號傳導(dǎo)中也發(fā)揮著重要作用，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞中的Syk磷酸化與TNFα、單核細(xì)胞趨化因子1等促炎細(xì)胞因子的分泌有關(guān)[31]。Zhou等[31]研究顯示，受損肝細(xì)胞釋放的內(nèi)源性微粒配體剪接體相關(guān)蛋白130是一種危險信號因子，其與LPS協(xié)同驅(qū)動肝臟炎癥反應(yīng)。

已有研究[32]證明，酒精性肝炎患者肝臟中Syk表達(dá)和磷酸化水平增加。Syk通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor associated factor, TRAF)家族成員相關(guān)的NF-κB激活劑結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)或干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulating factor 3, IRF3)信號來調(diào)節(jié)肝細(xì)胞死亡。Syk抑制劑可顯著降低肝臟磷酸化TBK1和磷酸化IRF3水平，減少促炎細(xì)胞因子的分泌，從而改善酒精引起的肝損傷和細(xì)胞死亡[33]。同時，Syk在脂質(zhì)積累中也扮演著重要角色，使用Syk抑制劑治療可通過抑制脂質(zhì)生物生成和促進(jìn)脂質(zhì)代謝來預(yù)防及改善酒精誘導(dǎo)的肝脂肪變性[34]。ALD患者肝臟中循環(huán)血單核細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的總Syk以及活化的Syk(pSykY525/526)表達(dá)顯著增加。由于Syk與ALD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，并且Syk可作為酒精性肝損傷的主要信號分子，因此，Syk抑制可以預(yù)防和減弱酒精性肝臟炎癥、細(xì)胞死亡、脂肪變性等ALD的各個階段。

2.4 Syk與非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指包括單純性脂肪肝、NASH、肝纖維化和HCC的一系列不同程度的肝損傷[35]。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，全球發(fā)病率約為25.2%，亞洲發(fā)病率高達(dá)27%，發(fā)病率隨地區(qū)和社會條件的差異而略有變化(22.1%～28.6%)[36]。NASH是NAFLD更為嚴(yán)重和具有臨床意義的階段，臨床表現(xiàn)為肝細(xì)胞損傷、脂肪變性和炎癥，極易發(fā)展為終末期肝病和HCC[37]。

NASH的進(jìn)展與TLR和核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide oligomeric domain-like receptors, NLR)等危險信號的逐漸積累有關(guān)[38]。LPS與TLR4的相互作用在具有炎癥響應(yīng)的先天免疫與和Kupffer細(xì)胞激活之間起著重要作用[39]。在NASH發(fā)展過程中，活化的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和趨化因子CCL2、FcγR1有助于循環(huán)血單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞進(jìn)入炎癥性肝臟。同時，活化的Kupffer細(xì)胞還分泌TNFα和TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體，誘導(dǎo)鄰近肝細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，誘發(fā)和促進(jìn)NASH發(fā)生發(fā)展[40]。

TRAF-6是多種信號通路中的共享分子，并通過適配器MyD88和IRAK-1(IL1受體相關(guān)激酶1)與TLR4相互作用。Syk通過與TRAF-6的關(guān)聯(lián)，在IL-1誘導(dǎo)的趨化因子釋放中發(fā)揮作用。TLR4通過B淋巴細(xì)胞受體傳導(dǎo)信號誘導(dǎo)Syk活化，并對B淋巴細(xì)胞存活、增殖和B淋巴細(xì)胞受體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答至關(guān)重要[41]。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞參與NASH的進(jìn)展，暗示了Syk在這一過程中的作用。

研究[32]表明，相比于正常肝臟，NASH患者肝臟中Syk表達(dá)與NAS評分(NAFLD活性評分)升高呈正相關(guān)。Syk通過模式識別受體途徑和NLR途徑參與NASH的發(fā)病，而部分NLR在炎性小體的形成中起關(guān)鍵作用。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域富含膿素亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域3炎癥小體激活需要Syk參與，并形成炎癥小體復(fù)合物[42]。因此，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域富含膿素亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域3炎癥小體的體內(nèi)藥理抑制作用可以減輕NASH的肝臟炎癥、肝細(xì)胞損傷和肝纖維化程度[32,43]。

2.5 Syk與HCC 肝細(xì)胞凋亡和代償性增殖是HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動因素，而Syk在HCC的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。研究[44]表明，腸道菌群、LPS以及TLR4的信號傳導(dǎo)與慢性損傷性肝臟炎癥和癌變有關(guān)，腸道菌群的LPS通過激活TLR4可以促進(jìn)損傷和炎癥驅(qū)動的腫瘤生長，LPS-TLR4途徑可通過增加非骨髓源性常駐肝細(xì)胞中的增殖和抗凋亡信號來促進(jìn)HCC，而Syk通過參與調(diào)節(jié)LPS-TLR4途徑之間的相互作用來影響HCC的發(fā)生發(fā)展。Yuan等[45]研究發(fā)現(xiàn)，HCC腫瘤組織中存在27%Syk基因被甲基化，Syk基因甲基化與Syk mRNA或蛋白表達(dá)的缺失高度相關(guān)，并在基因沉默中起因果作用。Syk甲基化和表達(dá)的缺失有助于肝癌的發(fā)展，并且是HCC患者總生存率的預(yù)測指標(biāo)。此外，在HCC細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Syk啟動子的甲基化是負(fù)向調(diào)控的。在Syk沉默的HCC細(xì)胞系中恢復(fù)Syk表達(dá)可降低肝細(xì)胞的生長、細(xì)胞遷移和侵襲，但有助于細(xì)胞與基質(zhì)的黏附[46-47]。

Checkpoint激酶1(Checkpoint kinase 1, CHK1)是一種進(jìn)化保守的Ser/Thr激酶，在DNA損害后變得活躍。研究[48]表明，CHK1的高表達(dá)具有致癌作用，并與HCC患者的不良預(yù)后有關(guān)。CHK1能夠使腫瘤抑制因子Syk(L)在Ser295位點發(fā)生磷酸化，并誘導(dǎo)其蛋白酶體降解，從而促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。但是，Syk(L)的非磷酸化突變體可抑制HCC細(xì)胞系的增殖、集落形成和腫瘤生長。因此，在HCC患者中CHK1和Syk(L)的表達(dá)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)。有趣的是，另一研究[49]發(fā)現(xiàn)，Syk(L)和Syk(S)在對抗HCC侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有相反的調(diào)節(jié)作用。Syk(S)會促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡，并對抗Syk(L)的相反作用。而Syk(L)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。同時，Syk(L)表達(dá)水平上調(diào)或Syk(S)表達(dá)水平下調(diào)對HCC患者3年和5年的復(fù)發(fā)時間以及總體生存曲線明顯延長，使肝癌切除術(shù)后患者的腫瘤早期復(fù)發(fā)率明顯下降。因此，Syk(L)和Syk(S)的表達(dá)水平是HCC患者預(yù)后的有力預(yù)測指標(biāo)。

3 Syk抑制劑

近年來，Syk信號通路已被認(rèn)為是各種疾病新興的治療靶標(biāo)，尤其是在肝臟疾病。Syk抑制劑的研究亦得到社會廣泛的關(guān)注，并且有部分藥物已進(jìn)入動物實驗及臨床研究，療效可觀。研究[32-33]表明，R406可阻斷Fc受體信號通路及NF-κB信號通路、抑制炎性小體激活、減少巨噬細(xì)胞和其他肝細(xì)胞中Syk的表達(dá)和磷酸化，最終達(dá)到抑制脂肪變性、炎癥和纖維化，改善非酒精性和酒精性脂肪性肝炎。GS-9973是一種新型的口服Syk抑制劑，通過抑制Syk的Y525/526磷酸化，降低HSC活化因子(MYB原癌基因轉(zhuǎn)錄因子、CREB結(jié)合蛋白和MYC原癌基因轉(zhuǎn)錄因子)和HSC增殖因子(MYC、CCND1)的表達(dá)水平，抑制造血干細(xì)胞增殖和活化，最終起到抗肝纖維化和抗癌作用[6]。PRT062607和Piceatannol兩種抑制劑可導(dǎo)致腫瘤內(nèi)p16和p53表達(dá)水平升高而使抗凋亡蛋白Bcl-xL及SMAD4表達(dá)水平降低。此外，還能影響肝臟中有關(guān)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老的基因表達(dá)，抑制雷帕霉素靶蛋白、IL-8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化磷酸化。最終選擇性地阻斷Syk磷酸化、顯著減少炎癥細(xì)胞浸潤和HSC分化，抑制肝纖維化及肝癌的發(fā)展進(jìn)程[50]。盡管Syk抑制劑現(xiàn)已在動物實驗和臨床研究中取得不錯的療效，但仍然存在著一些問題尚未解決;(1)長期安全性尚未得到證實;(2)Syk在不同細(xì)胞中普遍表達(dá)，Syk抑制劑對多種細(xì)胞功能的全面抑制可能會產(chǎn)生副作用；(3)目前，關(guān)于Syk抑制劑的研究多停留在動物實驗研究，要轉(zhuǎn)化為臨床療效，仍尚需進(jìn)一步大量的研究。因此，如何在不破壞細(xì)胞生理功能的情況下抑制病理過程是Syk抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床的主要挑戰(zhàn)之一。

4 小結(jié)

綜上所述，Syk作為一種新型的潛在治療靶點，其與慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。明確Syk在慢性肝臟疾病中具體的作用機(jī)制，有利于新型藥物的開發(fā)，并為肝臟疾病的治療提供新策略和新思路。雖然近年來有關(guān)Syk對肝臟疾病作用的研究較多，一些小分子Syk抑制劑在試驗研究中取得不錯的成績，但仍存在長期安全性以及臨床療效的不確定性等許多尚未闡明的關(guān)鍵問題，故尚需對該領(lǐng)域進(jìn)一步深入探索，為肝臟疾病的臨床防治提供新的策略和實驗支撐。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：毛德文、樂瀅玉負(fù)責(zé)研究選題；張榮臻、吳聰、肖偉松負(fù)責(zé)設(shè)計論文框架，起草論文；毛德文、樂瀅玉負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿；覃小賓、曾勝瀾負(fù)責(zé)修訂論文。