肝祖細(xì)胞與肝再生的關(guān)系

王俊俊， 陸倫根， 蔡曉波

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院 消化科， 上海 200080

肝臟的再生能力極強(qiáng)，然而在正常情況下99%的肝細(xì)胞處于G0期。當(dāng)急性肝損傷或肝大部分切除后(partial hepatectomy, PH)，殘存的肝細(xì)胞迅速進(jìn)入復(fù)制狀態(tài)[1]。由肝細(xì)胞增殖介導(dǎo)的肝再生迅速而有效且通常在殘存肝細(xì)胞相對(duì)健康的條件下發(fā)生，其被稱為肝損傷的首要防線或生理性再生。當(dāng)重癥肝病時(shí)大量肝細(xì)胞死亡或慢性肝病時(shí)肝細(xì)胞衰老或復(fù)制受到抑制時(shí)，肝祖細(xì)胞(liver progenitor cell, LPC)介導(dǎo)的肝細(xì)胞再生稱為肝臟代償?shù)闹黧w，也稱為肝臟再生的次要機(jī)制或病理性再生。盡管目前也有研究[2]顯示，膽管細(xì)胞能在慢性肝損傷時(shí)分化為成熟肝細(xì)胞而起到肝再生作用。較多研究[3-4]均證實(shí)LPC在肝臟發(fā)育和肝損傷中存在，并可參與肝再生。本文主要闡述LPC的起源與激活，和在不同類型肝損傷中介導(dǎo)肝再生的作用及其調(diào)控機(jī)制。

1 LPC的起源

LPC是一種卵圓形、高核質(zhì)比的細(xì)胞，位于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與匯管區(qū)交界的Hering’s管，從形態(tài)和體積上類似于膽管上皮細(xì)胞，被認(rèn)為具有肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞雙向分化潛能，并具有以下特征：(1)具有高增殖潛力的克隆形成能力；(2)具有在培養(yǎng)條件下分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的能力；(3)具有移植后的肝臟再增殖能力[5]。Farber[6]在1956年描述了第一個(gè)被鑒定為卵圓形細(xì)胞的LPC。此后在大鼠PH聯(lián)合2-乙酰氨基芴介導(dǎo)急性肝損傷模型中證實(shí)了卵圓細(xì)胞可以分化為肝細(xì)胞[7]。其中3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihidro-collidine(DDC)或膽堿缺乏、乙硫氨酸補(bǔ)充(choline-deficient ethionine-supplemmented diet, CDE)模型是使用最廣泛的研究卵圓細(xì)胞的小鼠肝損傷模型[5]。LPC不僅表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物EPCAM、Sca-1、CD133、CD24、A6、Trop2、Lgr5、Mic1-1c3，也同時(shí)表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)志物SOX9、CK19及肝細(xì)胞標(biāo)志物HNF4a、CK8[8]，因此被認(rèn)為是雙能干/祖細(xì)胞群。

然而較多文獻(xiàn)討論了LPC可能來自轉(zhuǎn)分化的膽管細(xì)胞或肝細(xì)胞。Raven等[2]通過阻斷已有肝細(xì)胞的增殖證實(shí)膽管細(xì)胞可再生肝細(xì)胞，其研究是基于Sox9表達(dá)，提出膽管細(xì)胞在肝再生過程中作為CK19+兼性干細(xì)胞，但是Sox9在膽管細(xì)胞中也表達(dá)，不能將膽管細(xì)胞與LPC區(qū)分開。同樣Yimlamai等[9]研究顯示在成熟的肝細(xì)胞中異位表達(dá)的YAP(Hippo途徑的成員)激活了祖細(xì)胞程序，并將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為能夠分化的祖細(xì)胞，體現(xiàn)肝細(xì)胞的可塑性。Wang等[10]在中心靜脈附近發(fā)現(xiàn)了具有自我更新能力表達(dá)Axin2+的二倍體肝細(xì)胞，被認(rèn)為是肝干細(xì)胞，但近期Sun等[11]研究數(shù)據(jù)反對(duì)Axin2+肝細(xì)胞是肝干細(xì)胞，并且表明整個(gè)肝臟中的肝細(xì)胞都有助于肝臟的穩(wěn)態(tài)和再生。此外，最近一項(xiàng)研究[12]發(fā)現(xiàn)了表達(dá)高水平端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的肝細(xì)胞子集，其在體內(nèi)平衡過程中和損傷后有助于肝再生，并且利用譜系追蹤證實(shí)了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶高水平的肝細(xì)胞相對(duì)稀少，隨機(jī)分布在整個(gè)肝小葉中，具有祖細(xì)胞特征。除了肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞外，有研究[13]提出肝星狀細(xì)胞也能成為L(zhǎng)PC的來源。在膽管結(jié)扎和CDE誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中，體內(nèi)譜系追蹤顯示肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)PC參與肝再生。總之，LPC是在肝損傷過程中被激活以再生肝實(shí)質(zhì)的細(xì)胞，而肝臟細(xì)胞的高度可塑性，為L(zhǎng)PC來源提供更多可能性。

2 LPC的激活

LPC在肝臟的增殖不是獨(dú)立存在的，往往與Kupffer細(xì)胞、星狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)形成類似小室(niche)復(fù)合體。正因?yàn)閺?fù)合體的存在，LPC與肝纖維化關(guān)系密切，LPC可以產(chǎn)生促纖維化細(xì)胞因子而促進(jìn)纖維化，而纖維化的存在也能促進(jìn)LPC的增殖[14]。在多種類型的肝損傷中，表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞會(huì)從門靜脈周圍區(qū)域擴(kuò)展到周圍的薄壁組織中，這種現(xiàn)象稱為膽管反應(yīng)(ductular reaction, DR)。根據(jù)細(xì)胞來源，DR通常分為3類：(1)先前存在的肝內(nèi)膽管細(xì)胞的增殖，通常見于膽道疾病，如原發(fā)性膽汁性肝硬化；(2)肝細(xì)胞的膽管樣化生；(3)LPC[15]。由于慢性肝病中通常存在肝細(xì)胞的慢性損傷，因此LPC是DR的主要來源，且有研究證明LPC的激活與DR呈正相關(guān)[16]。Zhou等[17]使用NCAM、CK19、HepPar1對(duì)DR細(xì)胞染色，發(fā)現(xiàn)DR具有明顯的雙極性，即具有膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞兩個(gè)分化方向，還可不斷產(chǎn)生多種分化狀態(tài)的中間肝膽細(xì)胞，進(jìn)一步說明DR是LPC的增殖形式。

3 LPC在肝損傷中的作用

3.1 急性肝損傷 Katoonizadeh等[18]研究顯示, 當(dāng)肝臟出現(xiàn)大規(guī)模壞死導(dǎo)致急性肝衰竭時(shí)，LPC廣泛活化及DR明顯出現(xiàn)，且肝細(xì)胞損失50%是LPC廣泛活化的閾值，DR的激活是由肝損傷期間肝臟上皮細(xì)胞的再生能力受損引起的，這種激活與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，并在疾病早期(1周內(nèi))發(fā)生，但LPC需要大約1周的時(shí)間才能分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞 。根據(jù)這一理論，Weng等[19]認(rèn)為大面積肝壞死患者大量肝細(xì)胞壞死的同時(shí)伴隨著LPC介導(dǎo)的肝再生的發(fā)生，即使在急性肝衰竭情況下，患者的命運(yùn)取決于LPC是否可以在短時(shí)間內(nèi)再生足夠的功能性肝細(xì)胞以恢復(fù)肝臟質(zhì)量和功能。

3.2 慢性肝損傷 慢性肝病時(shí)肝細(xì)胞P21蛋白表達(dá)明顯增加，表明肝細(xì)胞的增殖被抑制。同時(shí)，對(duì)丙型肝炎患者的研究[20]顯示，LPC的增殖與患者年齡相關(guān)。因此，肝細(xì)胞的再生抑制和衰老可能是LPC成為慢性肝病肝臟再生的主要機(jī)制。在慢性肝損傷中，LPC的活化程度與炎癥和纖維化程度有關(guān)[16]。最近來自小鼠模型的研究[21]顯示，LPC是實(shí)質(zhì)再生的重要來源，并且證明LPC在CDE肝損傷模型中對(duì)肝細(xì)胞的貢獻(xiàn)將近30%。臨床研究[22]顯示，在非酒精性脂肪性肝炎患者中，LPC增殖和DR的程度與肝細(xì)胞復(fù)制阻滯、纖維化階段和門靜脈炎癥嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在酒精性肝炎患者中，DR增殖與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，并且DR細(xì)胞表達(dá)趨化因子和炎性介質(zhì)，促進(jìn)了中性粒細(xì)胞在門靜脈周圍區(qū)域的浸潤(rùn)[23]。此外一項(xiàng)對(duì)丙型肝炎患者的回顧性隊(duì)列研究[24]顯示，在疾病進(jìn)展期以及原位肝移植后丙型肝炎復(fù)發(fā)期間，LPC及DR程度與肝臟炎癥、纖維化顯著正相關(guān)。

3.3 肝硬化 在肝硬化的實(shí)質(zhì)消失區(qū)或纖維間隔中，常觀察到成簇肝細(xì)胞和增殖管組成的小結(jié)節(jié)，其被認(rèn)為是實(shí)質(zhì)病變中的再生過程。Lin等[25]使用線粒體DNA突變作為克隆擴(kuò)增的標(biāo)志物，顯示肝硬化中肝實(shí)質(zhì)的再生結(jié)節(jié)與LPC具有相同的細(xì)胞起源，提示LPC參與肝再生。肝硬化患者中往往能觀察到膽道標(biāo)志物EpCAM+的肝細(xì)胞，這種中間肝膽細(xì)胞的出現(xiàn)可以從兩種相反的角度解釋：慢性損傷的肝細(xì)胞可能會(huì)獲得膽管標(biāo)志物的異常表達(dá)，代表了它們正在經(jīng)歷去分化，或者可能來自干/祖細(xì)胞分化的新生肝細(xì)胞。通過對(duì)慢性乙型和丙型肝炎患者肝臟的研究發(fā)現(xiàn)，EpCAM+肝細(xì)胞的程度與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并且與CK19+DR細(xì)胞相鄰。此外，肝硬化EpCAM+肝細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度介于EpCAM-肝細(xì)胞和增生的DR細(xì)胞之間，這更支持了肝硬化時(shí)LPC向肝細(xì)胞分化的理論[26]。Stueck和Wanless[4]的研究也支持了干/祖細(xì)胞再生是肝硬化時(shí)肝臟再生的主要機(jī)制。

3.4 肝癌 LPC在肝癌發(fā)生中的作用存在長(zhǎng)期爭(zhēng)論，LPC被認(rèn)為與肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌密切相關(guān)。對(duì)于肝細(xì)胞癌的基因芯片分析顯示約20%的肝細(xì)胞癌存在膽道標(biāo)志物的表達(dá)，這部分肝細(xì)胞癌被認(rèn)為起源于LPC，其預(yù)后更差[27]。同時(shí)存在肝細(xì)胞癌和膽管細(xì)胞癌特征的肝細(xì)胞癌合并肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，其癌旁LPC的增殖與預(yù)后有關(guān)。具有DR特征的細(xì)膽管癌，也被認(rèn)為來源于LPC。無論對(duì)于肝細(xì)胞癌或肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，癌旁DR均與周圍組織炎癥、纖維化相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)DR的增加與肝細(xì)胞癌中β-catenin核轉(zhuǎn)位有關(guān)，為DR增加和肝癌預(yù)后不良之間的關(guān)系提供了解釋[28]。此外有研究[29]顯示在慢性肝損傷模型中抑制LPC增殖可減少腫瘤的進(jìn)展。

4 LPC分化調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路

4.1 Wnt/β-catenin信號(hào) Wnt/β-catenin信號(hào)與LPC分化為肝細(xì)胞有關(guān)。在接受2-乙酰氨基芴聯(lián)合PH處理的大鼠中，LPC增殖階段β-catenin活性顯著增加，而在β-catenin 缺乏情況下，LPC數(shù)量急劇減少，表明Wnt/β-catenin在LPC正常活化和增殖中起關(guān)鍵作用[30]。Boulter等[31]研究顯示，巨噬細(xì)胞吞噬肝細(xì)胞碎片誘導(dǎo)Wnt3a表達(dá)，激活鄰近LPC中的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)，促進(jìn)了LPC向肝細(xì)胞的分化。

4.2 Notch信號(hào) Notch信號(hào)是膽管分化重要的調(diào)節(jié)分子，Alagille綜合征是由先天性的Notch信號(hào)缺乏引起膽道缺失而導(dǎo)致膽汁淤積。在膽道再生過程中肌成纖維細(xì)胞表達(dá)Jagged1，促進(jìn)了LPC中 Notch信號(hào)傳遞，促進(jìn)了LPC分化為膽管細(xì)胞[31]。譜系追蹤技術(shù)證實(shí)了Notch-RBPJ信號(hào)在膽管再生中起關(guān)鍵作用，還可促進(jìn)體外LPC向膽管細(xì)胞分化[32]，說明Notch信號(hào)在LPC向膽管細(xì)胞分化的過程中起著核心作用。

4.3 Hippo/YAP信號(hào) Hippo-YAP信號(hào)通路也可能參與LPC分化調(diào)控，成熟肝細(xì)胞中的YAP異位表達(dá)可將肝細(xì)胞去分化為L(zhǎng)PC，這些LPC能增殖并分化為膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞[9]。同樣有研究[33]通過單細(xì)胞測(cè)序顯示在DDC損傷模型中，膽管細(xì)胞中YAP表達(dá)具有明顯異質(zhì)性，并且YAP是維持膽管反應(yīng)所必須的，此外還發(fā)現(xiàn)YAP激活受膽汁酸調(diào)節(jié)。

4.4 Hedgehog信號(hào) PH可誘導(dǎo)小鼠肝臟Hedgehog配體的產(chǎn)生，激活Hedgehog信號(hào)，并伴隨著LPC的增加和PH后纖維化的修復(fù)，而使用Hedgehog通路抑制劑會(huì)減弱PH后LPC的反應(yīng)和恢復(fù)[34]。此外Hedgehog配體也直接或間接地在招募巨噬細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些巨噬細(xì)胞可調(diào)節(jié)LPC向肝細(xì)胞分化[35]。

4.5 HGF/c-Met信號(hào) 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)在誘導(dǎo)LPC轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞中至關(guān)重要。HGF激活c-Met受體，從而進(jìn)一步上調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk1/2)、蛋白激酶B(AKT)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)的表達(dá)，從而驅(qū)動(dòng)LPC分化，缺乏c-Met受體，會(huì)減弱LPC增殖、分化和遷移能力[36]。且Kitade等[37]研究顯示，HGF/c-Met信號(hào)能夠有效激活A(yù)kt和STAT3信號(hào)通路，這是LPC向肝細(xì)胞分化所必需的，c-Met缺失導(dǎo)致LPC向肝細(xì)胞分化能力喪失。

4.6 TWEAK/Fn14信號(hào) TNF類細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑(TWEAK)是TNF超家族的成員，而成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)劑14(Fn14)是TWEAK的受體，在健康肝臟中很少檢測(cè)到，但在受損和再生的嚙齒類動(dòng)物肝臟模型中可顯著誘導(dǎo)Fn14的表達(dá)。Jakubowski等[38]首次報(bào)道TWEAK的誘導(dǎo)會(huì)引起健康肝臟中LPC的激活，而TWEAK的敲減會(huì)顯著降低肝損傷模型中LPC的擴(kuò)增。

5 LPC移植重建肝實(shí)質(zhì)

使用譜系追蹤技術(shù)觀察肝損傷模型中移植LPC的研究[39]顯示，LPC可再生為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞以重建肝實(shí)質(zhì)，參與肝再生。臨床研究[40]將分離出EPCAM+細(xì)胞移植到終末期肝病患者，顯示EPCAM+細(xì)胞的成功移植以及肝硬化嚴(yán)重程度的顯著降低，表明了LPC在細(xì)胞治療方法中具有巨大潛力。筆者的前期研究也同樣顯示脾臟注射LPC能有效緩解四氯化碳誘導(dǎo)的急慢性肝病中肝臟炎癥、纖維化。LPC作為移植來源細(xì)胞其優(yōu)勢(shì)在于細(xì)胞體積小、耐受不良微環(huán)境、定向分化和增殖能力強(qiáng)等；然而，正常肝臟LPC數(shù)量少，關(guān)于如何促進(jìn)其體外擴(kuò)增、處理宿主相關(guān)免疫抑制以及LPC移植是否增加腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等問題還需進(jìn)一步研究。

6 小結(jié)

總之，在慢性或嚴(yán)重肝損傷時(shí)，LPC增殖分化為肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞參與再生，并且在損傷過程中激活不同的信號(hào)通路調(diào)控LPC的增殖與分化。此外較多研究均證實(shí)LPC移植可改善肝臟炎癥及纖維化，這將為終末期肝病患者的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。目前對(duì)于LPC激活、增殖及分化調(diào)控機(jī)制還缺乏充分認(rèn)識(shí)，未來可深入研究LPC在不同類型肝損傷中激活、增殖及其分化條件，以及準(zhǔn)確有效的LPC分子標(biāo)志，為各種類型肝病的治療提供新的思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王俊俊負(fù)責(zé)文章結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，撰寫文章；陸倫根負(fù)責(zé)收集、篩選文獻(xiàn)，修改文章；蔡曉波負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。