細(xì)胞程序性壞死在急性肺損傷中作用的研究進展

王亞麗（綜述） 朱 蕾（審校）

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科 上海 200032）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一類由多種因素誘發(fā)的高發(fā)病率、高死亡率的臨床疾病，除了創(chuàng)傷、病原微生物等對肺泡結(jié)構(gòu)的直接破壞，炎癥反應(yīng)失調(diào)也是ALI的重要原因，過度炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管膜彌漫性損傷和高通透性肺水腫。眾多內(nèi)源性修復(fù)機制受到抑制，肺泡液清除受損，導(dǎo)致ALI不斷進展和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的 發(fā)生。目前，對于ALI/ARDS缺乏能夠早期高效識別高危患者的方法及特效治療手段，因此，對于ALI/ARDS的病理生理機制需要更全面深入的研究以提高臨床診療效果。程序性壞死也稱為壞死性凋亡，是一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，依賴專門的分子系統(tǒng)，包括死亡受體（death receptor，DR）、受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK 1）、RIPK 3及混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL）等。程序性壞死通常由病原體感染、缺血、缺氧等誘發(fā)，可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞死亡并釋放炎癥介質(zhì)，影響炎癥啟動、放大和慢性化等各個階段，在ALI/ARDS中發(fā)揮重要作用［1-2］，對程序性壞死的研究綜述有助于進一步理解ALI/ARDS的發(fā)病機制，有望為臨床篩選高?；颊呒爸委熤匕Y者提供理論依據(jù)。

程序性壞死的機制程序性壞死由腫瘤壞死因 子 受 體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和Z-DNA結(jié) 合 蛋 白1（Z-DNA binding protein 1，ZBP1）等觸發(fā)。各種類型的作用機制相似，本文以TNFR1為例介紹信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。TNFR1與其配體TNF-α結(jié)合后，其胞內(nèi)死亡折疊基序暴露，募集RIPK 1等下游分子，形成由TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域 蛋 白（TNFR1-associated death domain protein，TRADD）、RIPK1和線性泛素鏈組裝復(fù)合物（linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC）等組成的復(fù)合體，并進一步形成由RIPK1、RIPK3和MLKL組成的壞死小體。RIPK3由RIPK1激活，二者通過RIP同型基序相互作用催化一系列復(fù)雜的磷酸化反應(yīng)，其中RIPK3催化MLKL磷酸化形成MLKL多聚體（三聚體或四聚體）。MLKL為程序性壞死的執(zhí)行者，其多聚體通過與磷脂酰肌醇磷酸酯結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，通透性增加，離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，進而發(fā)生細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引發(fā)免疫和炎癥反應(yīng)［3-4］。

RIPK1/RIPK3/MLKL是程序性壞死經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。RIPK 1、RIPK 3參與細(xì)胞凋亡，RIPK3還可在MLKL不參與的情況下調(diào)節(jié)促炎因子的基因轉(zhuǎn)錄、激活炎性小體［5］。程序性壞死與其他程序性死亡可能存在交互作用，一般情況下當(dāng)細(xì)胞凋亡途徑受到抑制，細(xì)胞更容易進入程序性壞死途徑［6］。RIPK 1抑制劑如Nec-1（necrostatin-1）、MLKL抑制劑如NSA（necrosulfonamide）或RIPK 3基因敲除皆可阻斷程序性壞死，減輕炎癥反應(yīng)和機體損傷。

ALI/ARDS的誘因ALI/ARDS的誘發(fā)因素包括嚴(yán)重感染、輸血、肺移植、機械通氣、脂肪栓塞等。肺炎相關(guān)ALI/ARDS最常見，金黃色葡萄球菌毒素如α-溶血素（Hla）、革蘭氏陰性桿菌外膜的重要免疫原性成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等能激活細(xì)胞程序性壞死，加劇肺損傷。膿毒癥情況下全身炎癥反應(yīng)易誘發(fā)肺損傷。紅細(xì)胞輸注后釋放的成分通過誘導(dǎo)程序性壞死及釋放危險信號，增加肺部炎癥的易感性［7］。肺移植時供體肺缺血、缺氧或缺血后再灌注引起肺血管內(nèi)皮或肺泡上皮細(xì)胞損傷；其他器官移植主要通過相關(guān)的缺血再灌注損傷釋放的炎癥介質(zhì)激活程序性壞死［8］。程序性壞死通過抑制脂肪酸氧化參與呼吸機相關(guān)肺損傷（ventilatorinduced lung injury，VILI）［9］。脂肪栓塞會造成肺血管內(nèi)皮、肺泡上皮細(xì)胞程序性壞死而誘發(fā)ALI/ARDS［10］。高氧暴露可能主要通過氧化應(yīng)激啟動細(xì)胞的程序性壞死，進而誘發(fā)ALI/ARDS［11］。

ALI/ARDS的細(xì)胞改變ALI/ARDS發(fā)病過程中細(xì)胞會出現(xiàn)多種類型死亡，程序性壞死是其中之一，所占的比例主要取決于相關(guān)受體的表達(dá)情況及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的程序性壞死直接或間接導(dǎo)致肺泡上皮-內(nèi)皮屏障受損而發(fā)生肺水腫，并且促進大量炎癥介質(zhì)釋放誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞，尤其是肺泡巨噬細(xì)胞，通過免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)和抑炎介質(zhì)的平衡在ALI發(fā)生、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。肺泡巨噬細(xì)胞的程序性壞死會打破該平衡而加劇炎癥反應(yīng)。

肺泡上皮細(xì)胞 肺泡彌漫性損傷是ALI/ARDS基本病理改變，肺泡上皮細(xì)胞死亡是關(guān)鍵。通過對LPS誘導(dǎo)的肺損傷動物模型中各種細(xì)胞死亡標(biāo)記物的比較，發(fā)現(xiàn)程序性壞死是肺泡上皮細(xì)胞主要死亡形式之一［12］。肺泡上皮細(xì)胞中RIPK1、RIPK3及MLKL均高表達(dá)。在金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的肺損傷動物模型中發(fā)現(xiàn)，炎癥早期出現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞程序性壞死［13］。TNF-α和ZBP1均可觸發(fā)肺泡上皮細(xì)胞程序性壞死［14-16］。LPS可能通過中性粒細(xì)胞誘發(fā)肺泡上皮細(xì)胞程序性壞死［12］。體外實驗顯示，LPS刺激肺泡上皮細(xì)胞并未造成細(xì)胞死亡，而LPS+中性粒細(xì)胞處理肺泡上皮細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞死亡，可檢測到程序性壞死。腎移植引發(fā)的肺損傷與骨橋蛋白相關(guān)［17］。發(fā)生程序性壞死的上皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的骨橋蛋白增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加。骨橋蛋白是一種促炎因子，可以促進B淋巴細(xì)胞增值及產(chǎn)生免疫球蛋白，因此上皮細(xì)胞程序性壞死間接促進炎癥反應(yīng)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞 向小鼠氣管內(nèi)滴注高濃度LPS建立ALI模型，通過投射電鏡觀察到肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體腫脹，核染色質(zhì)未呈現(xiàn)顯著形態(tài)學(xué)改變。血管內(nèi)皮細(xì)胞中TRADD、RIPK1、RIPK3、MLKL等表達(dá)顯著增加。RIPK3高表達(dá)使血管內(nèi)皮鈣黏蛋白、玻黏蛋白、閉鎖連接蛋白-1等表達(dá)增加，RIPK3高表達(dá)與血管內(nèi)皮鈣黏蛋白分解及肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑緊密相關(guān)，程序性壞死導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障的完整性受損、通透性增加［18］。RIPK3高表達(dá)還與凝血、內(nèi)皮細(xì)胞遷移和分化、血管生成等相關(guān)，熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）能夠正向調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞程序性壞死。紅細(xì)胞刺激內(nèi)皮細(xì)胞上清液后，RIPK3、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）濃度顯著升高，RIPK1和RIPK3相互作用增加。Nec-1預(yù)處理后，上述變化明顯減弱，提示紅細(xì)胞輸注誘發(fā)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生程序性壞死可能與HMGB1有關(guān)［7］。

肺泡巨噬細(xì)胞 LPS通過激活ZBP1介導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞程序性壞死，放大炎癥信號誘導(dǎo)肺損傷［19-20］。高濃度LPS導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著降低。在肺泡巨噬細(xì)胞中敲除ZBP1可以減輕肺損傷，肺泡灌洗液、血漿及肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-α濃度降低，肺泡巨噬細(xì)胞中RIPK1、RIPK3和MLKL表達(dá)顯著下降，mtDNA/TLR4/NF-κB信號通路下調(diào)，線粒體DNA激活的NF-κB通路可使促炎因子、促炎細(xì)胞等高表達(dá)而加劇炎癥反應(yīng)。Hla也會誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生程序性壞死，加劇肺組織炎癥反應(yīng)［21］。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）能夠正向調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞的程序性壞死而加劇肺損傷［22-23］。

ALI/ARDS的肺組織改變ALI小鼠出現(xiàn)肺結(jié)構(gòu)破壞和肺水腫、肺活量降低、肺順應(yīng)性降低。各類病因所致ALI肺組織中均發(fā)現(xiàn)表達(dá)RIPK 1和RIPK 3的細(xì)胞數(shù)量急劇增加，RIPK1、RIPK3、磷酸化RIPK 3、MLKL和磷酸化MLKL濃度顯著升高，RIPK 1和RIPK 3的相互作用增強。Nec-1、NSA、RIPK3-/-等干預(yù)措施下調(diào)RIPK1、RIPK3、MLKL信號分子的表達(dá)，肺部炎癥和損傷明顯減輕［10，16，21，24-27］。在H7N9流感病毒所致ARDS患者中，死亡患者肺組織RIPK1、RIPK3、磷酸化RIPK3、MLKL和磷酸化MLKL表達(dá)顯著升高，提示H7N9觸發(fā)了肺組織的程序性壞死［28］。

ALI/ARDS的肺泡灌洗液、血漿改變ALI動物模型的肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)增加、中性粒細(xì)胞數(shù)量增加，巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，總蛋白質(zhì)濃度增加，肺泡上皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物濃度增加，IL-1α、IL-1β、IL-6等炎癥相關(guān)信號分子濃度增加，MLKL濃度增加，值得注意的是ARDS患者肺泡灌洗液中的外泌體中也發(fā)現(xiàn)RIPK3濃度增加［29］。經(jīng)過Nec-1、NSA、RIPK 3-/-等干預(yù)措施后，上述變化明顯減弱［10，16，21，24-27］。

一項隊列研究顯示，膿毒癥患者血漿RIPK3從出現(xiàn)到48 h后的變化量與ARDS的發(fā)生獨立相關(guān)［30］。在發(fā)病前6天發(fā)生ARDS的患者血漿RIPK3濃度增量顯著大于未出現(xiàn)ARDS的患者；血漿RIPK3的變化量也與30天死亡率正相關(guān)。在重癥膿毒癥患者中，血漿RIPK3濃度與RBC輸注相關(guān)［7］。輸血前，未輸血組和輸血組患者血漿RIPK3濃度無差異；輸血第2天，輸血組患者血漿RIPK 3濃度升高。其可能機制是輸注的紅細(xì)胞誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞程序性壞死并釋放HMGB1，HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)，在膿毒癥炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。對LPS誘導(dǎo)的膿毒癥動物研究顯示趨化因子受體CXCR1/2可能正向調(diào)控程序性壞死，其受體拮抗劑可通過抑制程序性壞死而減輕肺損傷［31］。

Siempos等［9］的研究顯示RIPK3可能通過非依賴RIPK1、MLKL途徑抑制脂肪酸氧化介導(dǎo)VILI。與未使用機械通氣（mechanical ventilation，MV）的患者相比，接受MV的患者血漿游離肉堿（C0）與棕櫚酰肉堿（C16）、油基肉堿（C18）二者和的比值［C0/（C16+C18）］及RIPK3濃度更高，血漿RIPK3與C0/（C16+C18）正 相 關(guān) ，兩 組 血 漿RIPK 1及MLKL濃度未見差異。使用MV的患者中，與非ARDS組相比，ARDS組血漿RIPK 3及C0/（C16+C18）顯著升高。C0/（C16+C18）升高反映肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（carnitine palmitoyl transferase，CPT 1）缺乏。CPT 1是一種脂肪酸β-氧化限速酶，CPT 1抑制劑可導(dǎo)致VILI惡化。VILI的小鼠肺組織長鏈脂肪酸（如棕櫚酸和亞油酸）濃度升高、肺泡灌洗液游離脂肪酸濃度升高；RIPK 3-/-小鼠的上述變化明顯改善，但Nec-1干預(yù)、RIPK1+/-及MLKL-/-未出現(xiàn)類似結(jié)果。因此，程序性壞死經(jīng)典信號途徑RIPK1/RIPK3/MLKL可能未參與VILI病理過程，但RIPK3仍發(fā)揮重要作用，這提示RIPK3可能在RIPK 1、MLKL不參與的情況下介導(dǎo)某種炎癥信號通路，此信號通路通過抑制脂肪酸氧化，進而影響機體能量代謝使得肺損傷惡化。

結(jié)語程序性壞死導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞損傷，參與各種因素誘發(fā)的ALI/ARDS，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心為RIPK1/RIPK3/MLKL，不同誘因下的程序性壞死調(diào)控機制略有差異，ALI/ARDS患者血漿RIPK3與疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)，程序性壞死阻斷劑可發(fā)揮保護效應(yīng)。目前大多數(shù)研究關(guān)注ALI/ARDS的早期階段，少有研究探索程序性壞死對中后期階段的影響，如肺泡毛細(xì)血管屏障修復(fù)、纖維化及預(yù)后等。程序性壞死的詳細(xì)分子機制，如程序性壞死與其他細(xì)胞活動的交互作用、經(jīng)典分子通路的上下游調(diào)控機制等，也有待深入研究。

作者貢獻聲明王亞麗 文獻調(diào)研，論文構(gòu)思和撰寫。朱蕾 論文校審和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。