單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在哮喘研究中應(yīng)用的研究進(jìn)展

魏 穎（綜述） 吾尼且木·吐拉克 滕方舟 湯蔚峰 董競成△（審校）

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 上海 200040；2復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 上海 200040）

哮喘是一種異質(zhì)性疾病，轉(zhuǎn)錄組測序常用來研究哮喘的發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)哮喘的療效。由于哮喘的異質(zhì)性，傳統(tǒng)基于血液或組織樣本的轉(zhuǎn)錄組測序方法獲得的是細(xì)胞群體的宏觀結(jié)果，呈現(xiàn)的是同一基因在所有細(xì)胞中的平均表達(dá)水平，不能呈現(xiàn)同一基因在單個細(xì)胞之間存在的差異以及其在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用，因此不能完全揭示異質(zhì)性哮喘的發(fā)病機(jī)制及藥物療效。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是在單細(xì)胞水平對全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)新技術(shù)，能夠獲得每個細(xì)胞的mRNA表達(dá)信息，發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞亞群以及相關(guān)信息，揭示細(xì)胞間基因表達(dá)的異質(zhì)性并鑒定稀有細(xì)胞類型。scRNA-seq能夠繪制肺組織細(xì)胞圖譜，進(jìn)行細(xì)胞譜系追蹤，多角度、多層次和直觀認(rèn)識哮喘的發(fā)病機(jī)制，為深入研究和理解哮喘發(fā)病機(jī)制提供新的技術(shù)手段。本文對scRNA-seq技術(shù)在哮喘研究中的應(yīng)用做一概述，以期為哮喘這一異質(zhì)性疾病發(fā)病機(jī)制的深入研究提供思路。

哮喘概述哮喘影響各年齡段的健康，患病率逐年上升，尤其是兒童患病率。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全球約有3億人罹患哮喘，哮喘在不同國家的患病率為1%～18%，每年因哮喘死亡的人數(shù)高達(dá)25萬，對個人、家庭和社會造成沉重的負(fù)擔(dān)。全球哮喘防治創(chuàng)議（Global Initiative for Asthma，GINA）指出，哮喘是一種異質(zhì)性疾病，以慢性氣道炎癥為主要特征［1］。哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，基因和環(huán)境的相互作用，參與哮喘發(fā)病的病理進(jìn)展。哮喘的病理過程由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與，包括肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞（neutrophils，NEU）、NK細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，這些細(xì)胞與炎癥細(xì)胞和外部環(huán)境相互作用，導(dǎo)致患者出現(xiàn)慢性氣道炎癥、可逆性氣流受限、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑。

哮喘具有不同的疾病過程。可根據(jù)患者的病史、臨床表現(xiàn)、病理生理學(xué)特征、治療反饋以及預(yù)后差異分為不同的哮喘表型［2-3］。T淋巴細(xì)胞在哮喘慢性炎癥中具有重要作用，2型輔助性T細(xì)胞（type 2 helper T cells，Th2）免疫應(yīng)答增強(qiáng)（2型免疫反應(yīng)）被認(rèn)為是一種重要的哮喘炎癥表型［4］。當(dāng)初次接觸過敏原，上皮細(xì)胞監(jiān)測到過敏原，釋放促炎因子，促進(jìn)肺部樹突狀細(xì)胞的募集和活化，樹突狀細(xì)胞攝取過敏原，將過敏原轉(zhuǎn)運(yùn)至回流淋巴結(jié)，誘導(dǎo)過敏原特異性Th2細(xì)胞活化。當(dāng)再次接觸相同過敏原時，Th2效應(yīng)細(xì)胞被刺激活化，分泌IL-4、IL-5和IL-13等2型炎癥因子，引起過敏性氣道炎癥、肺部EOS增多、杯狀細(xì)胞增生等炎癥變化。大量關(guān)于哮喘的發(fā)病機(jī)制以及藥效學(xué)研究均以Th2細(xì)胞作為關(guān)注的重點(diǎn)。NEU增多及Th17免疫應(yīng)答增強(qiáng)也被認(rèn)為是一種重要的哮喘炎癥表型，參與重癥哮喘的病理進(jìn)展［5-10］。此外，臨床上根據(jù)誘導(dǎo)痰中炎癥細(xì)胞比例將哮喘分為EOS型、NEU型、混合粒細(xì)胞型和粒細(xì)胞缺乏型炎癥表型。近年來，一些新的T細(xì)胞亞型及其在哮喘中的作用逐漸被認(rèn)識，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T，Treg）、濾泡輔助T細(xì)胞（follicular T helper，Tfh）、Th3、Th17、Th22和Th9細(xì)胞等，由此可見哮喘表型的多樣性和發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。

scRNA-seq概述scRNA-seq是以單個細(xì)胞為單位，通過將組織或體液樣本中的細(xì)胞群分離成單個細(xì)胞，進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增和高通量測序，獲得相應(yīng)數(shù)據(jù)并進(jìn)行信息分析的技術(shù)，也是目前應(yīng)用最廣泛的單細(xì)胞測序方法。scRNA-seq能夠獲得每個細(xì)胞同一基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確呈現(xiàn)基因表達(dá)量在不同細(xì)胞間的差異，進(jìn)而在單細(xì)胞水平重新認(rèn)識各種組織器官及其在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用，尤其對異質(zhì)性疾病的研究具有不可替代的優(yōu)勢。2009年，Tang等［11］首次將scRNA-seq用于小鼠胚葉細(xì)胞的研究，開創(chuàng)了第一個哺乳動物scRNA-seq方法。此后相繼出現(xiàn)改良和優(yōu)化的scRNA-seq技術(shù)［12-17］。2017年，商業(yè)化的10×Genomics技術(shù)問世［18］，此后相繼開發(fā)的Seq-Well技術(shù)［19］、Microwellseq測 序 平 臺［20］、SPLit-seq技 術(shù)［21］和Slide-Seq技術(shù)［22］使大規(guī)模單細(xì)胞測序相關(guān)研究得以開展。相較于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，scRNA-seq能夠深入研究細(xì)胞類型、細(xì)胞功能、細(xì)胞亞群、細(xì)胞亞群的異質(zhì)性和細(xì)胞譜系等［23］，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的多個領(lǐng)域。scRNA-seq的基本流程包括單細(xì)胞制備、單細(xì)胞文庫構(gòu)建與測序和數(shù)據(jù)分析（圖1）。

單細(xì)胞制備 單細(xì)胞制備是scRNA-seq的第一步，直接影響后續(xù)的建庫、轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析。常用的單細(xì)胞制備方法包括低通量單細(xì)胞制備方法（如有限稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割分離法）和高通量單細(xì)胞分選方法（如流式細(xì)胞法和微流控技術(shù)）。有限稀釋法通過對細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度稀釋，至適宜濃度獲得單細(xì)胞懸液。顯微操作法需要將制備的單細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度，在光學(xué)顯微鏡下挑選目的細(xì)胞，并利用口吸管將細(xì)胞吸出，獲得后續(xù)測序所需的單細(xì)胞。激光捕獲顯微切割分離法需要將組織樣本固定至熱塑膜涂片上，在倒置顯微鏡下使用高度聚焦的激光束切割待分選的目的細(xì)胞。流式細(xì)胞法分選目的細(xì)胞，首先對目的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀分選單個活細(xì)胞，該技術(shù)通量高、特異性強(qiáng)，是最常用的單細(xì)胞制備方法之一。微流控技術(shù)分選法利用含有與細(xì)胞大小一致的反應(yīng)室的微流控芯片，進(jìn)而獲得單個活細(xì)胞，除了具有分選活細(xì)胞的功能外，該技術(shù)還可以進(jìn)行后續(xù)單細(xì)胞基因組或轉(zhuǎn)錄測序，具有高通量和高效率的雙重優(yōu)勢。

圖1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序流程圖Fig 1 Flow chart of scRNA-seq

單細(xì)胞文庫構(gòu)建與測序 獲得單細(xì)胞之后，需要對單個細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，構(gòu)建RNA文庫以滿足后續(xù)測序需求。全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增的方法主要有基于PCR的方法（多重?cái)U(kuò)增方法）和基于體外轉(zhuǎn)錄的全轉(zhuǎn)錄組方法（使用條形碼的多重線性擴(kuò)增）。根據(jù)合成第2條cDNA鏈方法的不同，PCR擴(kuò)增法分為末端加尾法、模板轉(zhuǎn)換法和隨機(jī)引物法。體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法以線性擴(kuò)增法代替PCR指數(shù)擴(kuò)增，避免了PCR指數(shù)擴(kuò)增帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法從單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)開始，使用特殊的引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在T 7RNA聚合酶的作用下以上述cDNA為模板，轉(zhuǎn)錄得到RNA并建立RNA文庫［12］。

單細(xì)胞測序包括先擴(kuò)增序列再測序的第二代高通量測序和直接測序的第三代高通量測序。第二代高通量測序具有測序成本較低和測序效率較高的特點(diǎn)，包括Illumina公司的Solexa聚合酶合成測序技術(shù)、ABI公司的寡聚物連接檢測測序和Roche公司的焦磷酸測序技術(shù)。第三代高通量測序基于單分子測序技術(shù)，不依賴PCR擴(kuò)增技術(shù)，能夠避免PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的誤差。

數(shù)據(jù)分析 scRNA-seq數(shù)據(jù)分析包括一系列操作步驟，由于結(jié)果包含海量信息，首先需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化的原始數(shù)據(jù)處理流程和數(shù)據(jù)處理包可從公開數(shù)據(jù)庫下載。在常規(guī)分析之前，需要移除干擾信息（如接頭序列、連接序列和標(biāo)簽序列等），對剩余的序列信息進(jìn)行分析。首先，通過基礎(chǔ)流程Cell Ranger將原始數(shù)據(jù)拆分成FASTQ文件［4，24］，通過質(zhì)控除去不符合要求的數(shù)據(jù)，再用標(biāo)簽復(fù)讀、計(jì)算機(jī)對相應(yīng)數(shù)據(jù)量化并生成基因表達(dá)矩陣。接著，利用Seurat軟件進(jìn)行細(xì)胞聚類分析［25］，先后通過主成分分析（principal component analysis，PCA）進(jìn)行線性降維［26］和t-分布隨機(jī)鄰域嵌入（tdistributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）算法進(jìn)行非線性降維［27］，呈現(xiàn)可視化結(jié)果。然后，利用monocle軟件進(jìn)行偽時間分析。最后，尋找每個聚類中顯著表達(dá)的基因進(jìn)行高度差異表達(dá)基因的鑒定。scRNA-seq數(shù)據(jù)分析主要是對測序樣本進(jìn)行異質(zhì)性分析，分析細(xì)胞內(nèi)的基因變化、對細(xì)胞進(jìn)行分群（通過已知的marker基因）、發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型以及分析不同細(xì)胞群體之間的相互作用。

scRNA-seq在哮喘研究中的應(yīng)用scRNA-seq是近年來迅速發(fā)展的生命科學(xué)前沿技術(shù)，能夠在單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞的基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，為研究異質(zhì)性疾病提供了新的研究思路和技術(shù)手段。通過分離肺組織單細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，有助于準(zhǔn)確理解細(xì)胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程及相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制。scRNA-seq已應(yīng)用于哮喘的研究中，并取得一定進(jìn)展。已發(fā)表的相關(guān)研究主要對肺組織、氣道、淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行研究及分群，揭示不同細(xì)胞群體及群體之間的相互作用在哮喘發(fā)病中的作用。

肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的相互作用對于維持肺穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Vieira Braga等［28］對正常人和哮喘患者肺組織的上氣道、下氣道和肺實(shí)質(zhì)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，選取通過鼻刷、支氣管活檢、肺切除和肺移植獲得的正常受試者和哮喘患者的樣本，對肺組織的結(jié)構(gòu)細(xì)胞和定居在肺組織的炎癥細(xì)胞及其相互作用進(jìn)行研究。針對上皮細(xì)胞譜系，在上氣道、下氣道和肺實(shí)質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了至少10種上皮細(xì)胞，包括基底細(xì)胞、club細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞Ⅰ型肺泡細(xì)胞、Ⅱ型肺泡細(xì)胞和ionocyte等；每種基底細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和纖毛上皮細(xì)胞又可以細(xì)分為2種表達(dá)不同marker基因的細(xì)胞狀態(tài)。針對免疫細(xì)胞，在上氣道、下氣道和肺實(shí)質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了髓樣細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、NEU、樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞；同時發(fā)現(xiàn)了淋巴樣細(xì)胞，包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞。針對基質(zhì)細(xì)胞，在上氣道、下氣道和肺實(shí)質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)構(gòu)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)表型和細(xì)胞比例均存在差異；同時鑒定出一種新的定居在肺組織的CD4+T細(xì)胞亞群，該亞群同時具有循環(huán)記憶細(xì)胞和組織定居記憶細(xì)胞的特征，許多疾病相關(guān)基因具有高度細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式。該研究在哮喘患者肺部發(fā)現(xiàn)了一種新的上皮細(xì)胞狀態(tài)——黏液纖毛細(xì)胞。這些黏液纖毛細(xì)胞代表了一種纖毛細(xì)胞的過渡狀態(tài)，其參與哮喘這類慢性病的黏液細(xì)胞增生。此外，還發(fā)現(xiàn)了其他哮喘相關(guān)的改變，包括杯狀細(xì)胞、上皮內(nèi)肥大細(xì)胞、氣道壁病理性效應(yīng)Th2細(xì)胞數(shù)量增加等。通過分析正常受試者和哮喘患者的細(xì)胞間通訊發(fā)現(xiàn)，伴隨與Th2細(xì)胞相互作用明顯增加，結(jié)構(gòu)細(xì)胞通訊明顯減少，該研究對上皮細(xì)胞的變化產(chǎn)生了新的見解，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞之間的通訊模式改變是哮喘性氣道炎癥的發(fā)病基礎(chǔ)。

微生物低劑量暴露、呼吸道病毒感染及空氣污染物都是哮喘發(fā)病的危險因素，但是這些危險因素和宿主2型免疫紊亂易感性之間的發(fā)病機(jī)制仍不明確。Radermecker等［29］利用scRNA-seq技術(shù)對來自于載體對照、低劑量及高劑量LPS暴露合并HDM致敏和激發(fā)誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠肺組織的NEU進(jìn)行深入研究，結(jié)果顯示NEU共分為6群，其中載體對照的肺組織中，NEU主要為1個細(xì)胞群體（cluster 0）；低劑量及高劑量LPS暴露合并HDM致敏和激發(fā)誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠肺組織中，NEU分為5群（cluster 1～5）。cluster 1僅出現(xiàn)在低劑量LPS暴露合并HDM致敏和激發(fā)誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠肺組織中；cluster 2/3/5出現(xiàn)在高劑量LPS暴露合并HDM致敏和激發(fā)誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠肺組織中；cluster 4平均出現(xiàn)在低劑量及高劑量LPS暴露合并HDM致敏和激發(fā)誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠肺組織中。分別對這6群NEU進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，明確了共同的、劑量非依賴的LPS誘導(dǎo)的基因表達(dá)特征，具體表現(xiàn)為：與NEU分群cluster 0相比，NEU分群cluster 1～5具有共同表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。對低劑量及高劑量LPS暴露誘導(dǎo)的肺組織特異性NEU分群（低劑量：cluster 1，高劑量：cluster 2/3/5）的基因表達(dá)特征進(jìn)行鑒定，Cxcr4和Lamp-1轉(zhuǎn)錄本（其編碼的蛋白質(zhì)可以通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到）在低劑量LPS暴露特異性的NEU分群cluster 1中顯著上調(diào)。高劑量LPS暴露特異性的NEU分群cluster 2/3/5中包含25個轉(zhuǎn)錄本，基因本體論分析（gene ontology analysis）顯示這25個轉(zhuǎn)錄本富集在補(bǔ)體受體介導(dǎo)的信號通路及1型或2型干擾素反應(yīng)等生物過程。低劑量LPS暴露特異性的NEU分群cluster 1中包含97個轉(zhuǎn)錄本，分別富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧合成、氧化應(yīng)激和ERK 1/2信號級聯(lián)反應(yīng)，這些通路均參與NET形成和分泌。通過scRNA-seq分析明確，在低劑量與高劑量LPS暴露誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境中，肺部NEU存在明顯差異。

Th2細(xì)胞在哮喘發(fā)病中具有重要作用，但是對哮喘病理進(jìn)展中Th2細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜特征仍不清楚。Tibbitt等［30］對HDM誘導(dǎo)的哮喘模型中縱隔淋巴結(jié)、肺組織和氣道中Th細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq研究。HDM誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增了120余倍。氣道中出現(xiàn)大量Foxp3+Treg、Th1、Th2和Th17細(xì)胞亞群，而肺組織和淋巴結(jié)中較少出現(xiàn)Th相關(guān)細(xì)胞亞群。該研究利用SMART-Seq2平臺對氣道中的CD3+CD4+CD44+Th細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，通過兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，在每個細(xì)胞中檢測到2 000～2 500個基因表達(dá)，在所有細(xì)胞中共檢測到超過12 000個基因，其中1 971個基因明顯差異表達(dá)。進(jìn)一步分析顯示，這些CD3+CD4+CD44+Th細(xì)胞共分為6個亞群，均表達(dá)Cd4、Cd3e、Cd3g、Cd3d和Cd44。Th細(xì)胞亞群cluster 1最像典型的Treg細(xì) 胞，表達(dá)Foxp3、Ctla4、Il10、Folr4、Il2ra和Klrg1 mRNA；Th細(xì)胞亞群cluster 4具有Th2細(xì)胞表 型 ，表 達(dá)Il1rl1（ST 2）、Gata3、Il13、Il5、Il17rb、Ltb4r1和Ccr8 mRNA。Pparg是Th2細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答所必需的基因，在Th2細(xì)胞亞群中特異性表達(dá)。此外，在Th細(xì)胞亞群cluster 4中發(fā)現(xiàn)了一系列高 表達(dá)基 因（Igfbp7、Plac8、Gclc、Serpinb6a、Fgl2、Vdr、Hlf），此前并未報道這些基因與Th2免疫應(yīng)答相關(guān)。Th細(xì)胞亞群cluster 5特征性表達(dá)Cxcr3、Ccl5和Ms4a4b mRNA，這群細(xì)胞同時富集Tbx21和Ifng mRNA，提示這群細(xì)胞具有Th1細(xì)胞特征。Th細(xì)胞亞群cluster 2高表達(dá)Tcf7、S1pr1、Tmem176 a和Tmem176b mRNA，具有活化和記憶表型。Th細(xì)胞亞群cluster 3缺少明確的差異表達(dá)基因，可能是細(xì)胞的混合表型。Th細(xì)胞亞群cluster 6顯著表達(dá)If it3、Isg15、Isg20、Mx1、Stat1和Stat2，說明這群細(xì)胞對Ⅰ型干擾素具有應(yīng)答反應(yīng)。但是Th細(xì)胞亞群cluster 6并未顯著表達(dá)Ⅰ型干擾素受體Ifnar1和Ifnar2，說明不具有對這類細(xì)胞因子作出反應(yīng)的傾向性。研究人員提出假設(shè)，I型干擾素應(yīng)答反應(yīng)可能是由HDM提取物中的toll樣受體配體介導(dǎo)的。進(jìn)一步通過野生型、Tlr4-/-和Myd88-/-小鼠開展相關(guān)研究，結(jié)果顯示，對Ⅰ型干擾素的應(yīng)答反應(yīng)并不局限于特定的Th細(xì)胞亞群，對Ⅰ型干擾素應(yīng)答的幼稚CD4+T細(xì)胞、Th1、Th2、Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜特征。顯著富集到氣道的Th2細(xì)胞特征性基因包括Cd200r1、Il6、Plac8和Igfbp7；Th2細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的基因顯著富集到脂代謝相關(guān)通路，抑制關(guān)鍵通路明確了糖脂代謝通路在Th2細(xì)胞中的作用，進(jìn)一步明確了細(xì)胞代謝對過敏性疾病中病理性Th2細(xì)胞分化的作用。

結(jié)語自2009年scRNA-seq技術(shù)問世以來，已廣泛用于各種疾病發(fā)病機(jī)制的研究，尤其是異質(zhì)性疾病。目前基于scRNA-seq技術(shù)在哮喘方面的研究結(jié)果，揭示出肺組織不同的細(xì)胞群體及其相互作用在哮喘的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。目前針對肺組織的scRNA-seq還有待進(jìn)一步提升。首先，肺組織單細(xì)胞懸液制備過程復(fù)雜，對肺組織樣本中某些細(xì)胞群體的分選提出了挑戰(zhàn)，部分細(xì)胞群體死亡率過高，造成數(shù)據(jù)失真或損失。構(gòu)成肺組織的各類細(xì)胞對不同的消化酶的反應(yīng)條件不同，為了盡可能獲得肺組織的全部細(xì)胞種類，需要對肺組織的酶消化方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性探索。其次，現(xiàn)有scRNA-seq技術(shù)主要針對含有poly-A尾的mRNA，不能檢測在哮喘發(fā)病中具有重要作用但無poly-A尾的microRNA和lncRNA等，這也是scRNA-seq技術(shù)需要完善的重要方面。最新研究顯示，單細(xì)胞組學(xué)研究已由轉(zhuǎn)錄組學(xué)向多組學(xué)延伸，未來的單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)將更全面和準(zhǔn)確揭示多種類型肺部細(xì)胞及其亞型在哮喘發(fā)病中的具體作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)聲明魏穎 論文構(gòu)思、撰寫和修改。吾尼且木·吐拉克，滕方舟 文獻(xiàn)整理。湯蔚峰 文獻(xiàn)整理，制圖。董競成 論文審定。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。