尋常型銀屑病和汗孔角化癥患者外周血Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的表型分析

周嘉青 陶 璐 顏克香 欒 菁 張喬安 潘潔雯 張正華△ 沈 蕾

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科 上海 200040；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所 上海 200025）

尋常型銀屑?。╬soriasis vulgaris，PV）是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，由機(jī)體在多基因遺傳背景和環(huán)境因素等作用下，出現(xiàn)免疫系統(tǒng)過度活化導(dǎo)致的自身炎癥和自身免疫反應(yīng)［1-2］。汗孔角化癥（porokeratosis，PK）則是一種少見的常染色體顯性遺傳的角化異常性皮膚病，可由甲羥戊酸（mevalonate，MV）通路上致病基因的缺陷引起固有免疫亢進(jìn)（自身炎癥），進(jìn)而導(dǎo)致角化過度，目前已被歸類到自身炎癥性角化?。?-5］。國內(nèi)外均有PV和PK共存的病例報(bào)道［3，6-13］，PV可見于家族性或者散發(fā)PK患者。以往的基因表達(dá)譜研究支持PV和PK在分子水平上具有相似性的觀點(diǎn)［14-15］，提示了二者在自身炎癥機(jī)制中可能存在相關(guān)性。體內(nèi)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)或腫瘤形成過程中可出現(xiàn)增殖和/或活化，發(fā)生代謝重編程，促進(jìn)MV通路，為合成膽固醇和甾類激素等提供重要的前體［16］。真皮IL-17+γδT（γδ17T）細(xì)胞在PV的炎癥應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［17-18］，而MV通路上的多種磷酸化代謝產(chǎn)物是γδT細(xì)胞的強(qiáng)效激動(dòng)劑［16］，提示MV通路有可能通過激活γδT細(xì)胞分泌炎癥因子而參與PK發(fā)病。雖然大多數(shù)PK患者攜帶MV通路上的基因突變，但目前尚不清楚其γδT細(xì)胞的數(shù)量和功能是否存在異常。本研究通過比較PV、PK患者與正常對照（normal control，NC）的外周血Vγ9Vδ2 T細(xì)胞比例、皮膚趨化表型和分化表型的變化，為深入研究γδT細(xì)胞參與自身炎癥和角化過度提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料和方法

研究對象本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（KY 2017-367）。2017年10月至2018年12月，來自皮膚科門診的33例斑塊狀PV和19例PK患者，以及33例健康志愿者在獲得充分說明后簽署書面知情同意書。入選標(biāo)準(zhǔn)：常規(guī)檢查無其他器質(zhì)性病變；在1個(gè)月內(nèi)均未接受系統(tǒng)治療，2周內(nèi)均未外用糖皮質(zhì)激素、維A酸和卡泊三醇等藥物。PV受試者至少由兩位醫(yī)師診斷為斑塊狀PV，其中男性18例，女性15例，年齡18～65歲，平均36.67歲；病程1～29年，平均11.67年；銀屑病皮損面積和嚴(yán)重度指數(shù)評分（psoriasis area and severity index，PASI）為4～38.4分，平 均16.03分 。根據(jù)2018年中國銀屑病診療指南對疾病嚴(yán)重程度的界定標(biāo)準(zhǔn)［19］，其中11例為中度銀屑病患者（3

主要試劑和儀器APC-Cy7-抗人CD3（Clone SK 7）、BV 786-抗人CD45RA（Clone HI100）及同型對照均購自美國BD Bioscience公司；PE-抗人CLA（REA 1101）及同型對照購自德國Miltenyi Biotec公司；PE-Cy7-抗人Vδ2（Clone B6）、APC-抗人Vγ9（Clone B3）及同型對照、人Fc受體阻斷劑（Human TruStain FcX?）均購自美國Biolegend公司；PECy5-抗 人CD27（Clone O323）及 同 型 對 照、Live/Dead Blue染色試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich公司 ；Ficoll-Hypaque購 自 加 拿 大 Stemcell Technologies公司。96孔圓底培養(yǎng)板為美國Corning公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀（LSRFortessa?X-20）為美國BD Bioscience公司產(chǎn)品；Flow Jo流式分析軟件購自美國Tree Star公司。

研究方法

PBMCs分離 每例PV、PK和NC組對象取外周血10 mL肝素鈉抗凝，使用Ficoll-Hypaque進(jìn)行密度梯度離心常規(guī)獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）進(jìn)行重懸，備用。

流式細(xì)胞術(shù)檢測 每例標(biāo)本取1×106個(gè)細(xì)胞，在100μL Live/Dead Blue（1μg/mL）溶液中室溫避光孵育15 min，PBS洗滌，加入25μL受體阻斷劑（濃度10μg/mL）室溫避光孵育5 min，再加入25μL APC-Cy7-抗人CD3、APC-抗人Vγ9、PE-Cy7-抗人Vδ2、PE-抗人CLA、PE-Cy5-抗人CD27、BV 786-抗人CD45RA熒光標(biāo)記的單克隆抗體（濃度20μg/mL），在4℃下避光孵育30 min，洗滌緩沖液洗滌后重懸，用BD LSRFortessa?X-20流式細(xì)胞儀檢測上述抗體表達(dá)，用Flow Jo軟件進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)中連續(xù)性變量用±s表示，采用GraphPad Prism V.8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，單因素t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

PV與PK患者的PBMCs中Vγ9Vδ2 T細(xì)胞比例均出現(xiàn)顯著下降如圖2A所示，流式細(xì)胞術(shù)圈門Vγ9Vδ2 T細(xì)胞，確定Vγ9Vδ2 T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，相較于NC組［（5.30±3.93）%］，PV組［（3.36±2.68）%］和PK組［（3.32±2.48）%］均顯著下降（t=-2.349，P=0.0224；t=-2.226，P=0.030 6）；PV組與PK組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A）。

PV與PK患者的CLA+Vγ9Vδ2 T細(xì)胞比例均出現(xiàn)顯著下降皮膚淋巴細(xì)胞抗原（cutaneous lymphocyte antigen，CLA）是一種皮膚淋巴細(xì)胞歸巢的表面標(biāo)志物。如圖2B所示，流式細(xì)胞術(shù)圈門CLA+Vγ9Vδ2 T細(xì)胞，確定CLA+Vγ9Vδ2 T細(xì)胞占總Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，相較于NC組［（23.44±14.95）%］，PV組［（12.70±11.44）%］和PK組［（13.97±8.59）%］均顯著下降（t=-3.277，P=0.001 7；t=-2.901，P=0.005 5）；PV組與PK組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3B）。

PV與PK患者的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞分化表型存在相似性根據(jù)CD27和CD45RA的表達(dá)狀態(tài)（圖2B），Vγ9Vδ2 T細(xì) 胞 分 為 幼 稚 型（na?ve T cells，TNa?ve；CD45RA+CD27+）、中 央 記 憶 型（central memory T cells，TCM；CD45RA-CD27+）、效應(yīng)記憶型（effector memory T cells，TEM；CD45RA-CD27-）及終末分化型（effector memory T cells expressing CD45RA，TEMRA；CD45RA+CD27-）［20］。以上4個(gè)細(xì)胞亞群在NC組的比例分別為（17.23±11.36）%、（57.39±18.17）%、（13.50±9.73）%和 （11.88±9.16）%；在PV組 中 分 別 為（35.49±13.59）%、（34.58±19.38）%、（7.04±5.59）% 和 （22.89±13.66）%；在PK組 中 分 別 為（23.43±16.11）%、（44.23±17.02）%、（10.17±10.39）%和（22.17±18.83）%。與NC相比，PV組的TCM和TEM的比例出現(xiàn)顯著下降（t=-4.932，P<0.0001和t=-3.303，P=0.001 8），TEMRA比 例 則 顯 著 升 高（t=3.849，P=0.000 3）；PK組中也出現(xiàn)TCM比例明顯下降（t=-2.572，P=0.013 1）和TEMRA比例相應(yīng)升高（t=2.236，P=0.035 3），TEM的比例與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）。

討 論

γδT細(xì)胞是一種非傳統(tǒng)的固有樣T細(xì)胞，由前體T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育而來，可在機(jī)體發(fā)育早期轉(zhuǎn)移到皮膚和黏膜中成為組織駐留細(xì)胞，參與抵御病原體的感染和炎癥反應(yīng)［21-22］。γδT細(xì)胞的表面表達(dá)特異性的T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR），與傳統(tǒng)的αβT細(xì)胞不同，γδT細(xì)胞無主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制性，可直接識別細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性或細(xì)菌病毒等病原體產(chǎn)生的外源性小分子磷酸化抗原，快速產(chǎn)生IFN-γ、IL-17等細(xì)胞因子，在固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的橋梁作用［23］。外周血γδT細(xì)胞約占CD3+T細(xì)胞的5%，以Vγ9Vδ2亞型最常見。本研究結(jié)果支持Laggner等［24］的發(fā)現(xiàn)，即PV患者外周血中Vγ9Vδ2 T細(xì)胞和皮膚趨化表型CLA+Vγ9V 2 T細(xì)胞的比例均明顯減少。此外，Laggner等［24］還發(fā)現(xiàn)PV皮損處Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的比例增多，對于成功獲治的PV患者，其外周血Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的比例可恢復(fù)至正常范圍。劉鈞天等［25］采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對銀屑病皮損處γδT細(xì)胞TCR進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與NC組相比，PV組皮損Vγ9的表達(dá)明顯升高，PV組外周血PBMC中Vγ9的表達(dá)降低。由此可見，外周血的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞在PV發(fā)作時(shí)可能遷移至皮損，參與皮膚的免疫應(yīng)答。

依據(jù)表面分子CD27和CD45RA的不同，Vγ 9Vδ2 T細(xì)胞可分成4個(gè)具有不同功能的亞群。幼稚型TNa?ve細(xì)胞經(jīng)小分子磷酸化抗原的激活，可分化為中央記憶型TCM細(xì)胞，部分TCM與TNa?ve細(xì)胞可歸巢至次級淋巴器官儲(chǔ)備，不參與免疫應(yīng)答；另一部分TCM細(xì)胞則繼續(xù)分化為效應(yīng)記憶型TEM和終末分化型TEMRA細(xì)胞，主要遷移至外周組織，參與免疫應(yīng)答。其中，以TEMRA的促炎和細(xì)胞毒性能力最強(qiáng)［20，26］。與NC組相比較，我們發(fā)現(xiàn)PV組Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的分化表型中記憶型TCM和TEM的比例顯著減少，終末分化型TEMRA細(xì)胞顯著增多。Vγ9Vδ2 T細(xì)胞可能受到內(nèi)源性和外源性磷酸化抗原的反復(fù)刺激，從記憶型TCM和TEM分化為TEMRA細(xì)胞。這些終末分化型TEMRA細(xì)胞通過分泌促炎因子來發(fā)揮炎癥效應(yīng)，也是結(jié)核、手足口病和細(xì)菌性腦膜炎等感染性疾病患者外周血Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的主要表型［27-29］。

De Simone等［12］報(bào)道1例PV患者在接受光療后，多數(shù)皮疹已消退，但是其腰部的環(huán)形斑塊卻持久不退，經(jīng)皮膚病理最終診斷為PV伴發(fā)斑塊型PK，表明這兩種疾病在臨床和發(fā)病機(jī)制上可能存在相關(guān)性。本研究PK組中有1名56歲男性患者，伴有PV病史40年。他在17歲時(shí)頭皮先出現(xiàn)紅斑和鱗屑，2年后，其雙下肢出現(xiàn)鱗屑性丘疹和斑塊，當(dāng)時(shí)臨床診斷為PV，曾口服中藥和外用藥物（具體不詳），接受紫外光療等。40歲時(shí)，他曾間歇肌肉注射曲炎舒松注射液近1年，停藥后皮疹反復(fù)；41歲時(shí)，其面部、軀干和四肢陸續(xù)出現(xiàn)深褐色環(huán)形斑疹，結(jié)合皮膚病理和臨床表現(xiàn)，診斷為淺表播散型PK。患者主訴其95歲母親有類似PK皮疹，伴PV病史30年。與NC組相比較，PK組外周血中Vγ9Vδ2 T細(xì)胞和皮膚趨化表型CLA+Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的比例，以及表型分化的趨勢與PV組基本保持一致。記憶型TCM向炎癥效應(yīng)型TEMRA過度分化，是固有免疫亢進(jìn)的表現(xiàn)，該細(xì)胞可能遷移至皮膚，參與皮膚的自身炎癥應(yīng)答。

本研究發(fā)現(xiàn)PV和PK患者的外周血Vγ9Vδ2 T細(xì)胞比例和表型具有相似性，為將來干預(yù)γδT細(xì)胞來調(diào)控皮膚自身炎癥的研究提供了依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)聲明周嘉青，陶璐 采集樣本，流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，論文撰寫和修訂。顏克香，欒菁，張喬安，潘潔雯 采集樣本，數(shù)據(jù)分析和解釋。張正華，沈蕾 研究設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析指導(dǎo)，論文撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。