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    牛源性大腸桿菌O26熱休克-酸應(yīng)激響應(yīng)

    2021-12-03 09:25:24宓曉雨王思亓趙王晨禹金龍林思棋王龍鳳
    食品科學(xué) 2021年22期
    關(guān)鍵詞:菌數(shù)耐受力菌液

    宓曉雨,張 蘇,王思亓,趙王晨,禹金龍,林思棋,王龍鳳,江 蕓

    (南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)

    大腸桿菌O157:H7是重要的食源性致病菌,然而近年來非O157大腸桿菌,尤其是“Big six”血清型(O26、O45、O103、O121、O111、O145)所引發(fā)的食品安全事件越來越受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注,其中O26是威脅人類健康的最重要的非O157大腸桿菌,居“Big six”之首[1-3]。反芻動物,尤其是牛,是致病大腸桿菌的主要宿主。本課題組前期從牛糞、牛肉中對非O157大腸桿菌進(jìn)行了分離鑒定,也發(fā)現(xiàn)O26是最主要的血清型[4]。與大腸桿菌O157:H7相似,O26也可導(dǎo)致人體腹瀉,以及出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥等嚴(yán)重并發(fā)癥[1,5]。

    食品加工貯藏過程中各種措施可對腐敗菌和致病菌產(chǎn)生應(yīng)激脅迫,導(dǎo)致有害菌損傷或死亡,有效延長貨架期。一般認(rèn)為多種措施聯(lián)合應(yīng)用時(shí),可發(fā)揮柵欄效應(yīng),增強(qiáng)抑菌效果[6-7]。然而,有研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌在多重應(yīng)激條件下有可能產(chǎn)生交叉保護(hù)現(xiàn)象,增強(qiáng)有害菌的抗性,從而提高存活能力,加大食品安全的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。酸化是食品加工中常見措施,其中酸性洗液或發(fā)酵食品中存在的乳酸可有效抑制有害菌的生長繁殖。加熱也是食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。早期有研究發(fā)現(xiàn),熱休克處理可增強(qiáng)大腸桿菌O157:H7的耐酸能力,提高存活率[10-11]。目前,熱休克-酸應(yīng)激對非O157大腸桿菌的存活,尤其是對應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響鮮有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)以前期分離的牛源性大腸桿菌O26為研究對象[4],首先比較22 株牛源性O(shè)26酸耐受能力,再選取代表菌株研究熱休克-酸應(yīng)激對其存活及應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響。旨在為非O157大腸桿菌的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估提供理論基礎(chǔ),為實(shí)際生產(chǎn)加工中非O157大腸桿菌的有效控制提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    22 株大腸桿菌O26,由本實(shí)驗(yàn)室前期分離自牛糞和牛肉,其中攜帶毒力基因的有3 株,包括G13Z1(stx1+、hly+)、G10Z1(hly+)、133Z(hly+)。

    胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar,TSA)、酵母浸粉(yeast extract,YE) 北京陸橋公司;乳酸、鹽酸、pH值校正緩沖溶液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS) 南京化學(xué)試劑有限公司;細(xì)菌RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)試劑盒 大連寶生物工程有限公司;實(shí)驗(yàn)用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 儀器與設(shè)備

    IS128C pH計(jì) 上海儀邁儀器科技有限公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技公司;SG403A生物安全柜 美國Baker公司;7500 real-time PCR儀美國Applied Biosystems公司;Nanodrop-2000核酸蛋白分析儀 美國Thermo公司;2-16KL高速冷凍離心機(jī)美國Sigma公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌種培養(yǎng)

    將22 株O26凍存菌液分別經(jīng)TSA劃線培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落分別接種于3 mL TSB中,220 r/min、37 ℃ 振蕩培養(yǎng)18 h,再轉(zhuǎn)接至100 mL TSB中,220 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h,約至9(lg(CFU/mL))。

    1.3.2 酸耐受實(shí)驗(yàn)

    吸取1.3.1節(jié)菌液10 mL,8 000×g、4 ℃離心10 min,沉淀用PBS(pH 7.2)洗滌2 次,分別重懸于等體積的鹽酸酸化TSB(pH 2.0)、乳酸酸化TSB(pH 3.5)中,37 ℃應(yīng)激處理2 h,離心,沉淀用PBS洗滌重懸終止應(yīng)激反應(yīng)。TSA-YE平板37 ℃培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)。進(jìn)一步計(jì)算應(yīng)激后相對于應(yīng)激前菌數(shù)的存活率。

    1.3.3 熱休克-酸應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)乳酸耐受情況,選取代表菌株混合菌液進(jìn)行熱休克-酸應(yīng)激存活實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步根據(jù)存活情況,選取代表菌株進(jìn)行應(yīng)激基因表達(dá)分析。

    1.3.3.1 應(yīng)激處理

    熱休克處理:將1.3.1節(jié)代表菌株的菌液等量混合,吸取10 mL,8 000×g、4 ℃離心10 min,沉淀用PBS(pH 7.2)洗滌2 次,重懸于10 mL TSB中,48 ℃水浴15 min,冰水浴3 min終止[12-14]。

    分別取熱休克菌液和未熱休克菌液0.1 mL接種于乳酸酸化的9.9 mL TSB(pH 3.5),37 ℃應(yīng)激處理2、4、6、8 h,前者為熱休克-酸應(yīng)激組,后者為酸應(yīng)激組。同時(shí)未熱休克菌液0.1 mL接種于9.9 mL正常TSB作為對照組。TSA-YE培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

    1.3.3.2 應(yīng)激基因表達(dá)分析

    應(yīng)激處理2、4 h樣品,離心、PBS洗滌重懸、再離心,菌體沉淀按試劑盒說明書提取總RNA,進(jìn)一步檢測總RNA的濃度和純度,當(dāng)A260nm/A280nm在1.8~2.0時(shí)表明純度較好。

    cDNA合成:首先用RNase-free DNase I去除基因組DNA以保證反轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL,其中PrimeScrept RT Master Mix 6 μL,total RNA終質(zhì)量濃度50 ng/μL,RNase Free dH2O補(bǔ)足體積。反轉(zhuǎn)錄條件為:37 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min;85 ℃反轉(zhuǎn)錄失活反應(yīng)5 s;4 ℃,∞。cDNA于-20 ℃凍存。

    real-time PCR:引物序列如表1所示[15-19],用于擴(kuò)增大腸桿菌O26的一般應(yīng)激基因rpoS、酸應(yīng)激相關(guān)基因(asr、ycfR、gadA)及熱應(yīng)激相關(guān)基因(rpoH、dnaK、clpB、groEL),內(nèi)參基因?yàn)閞rsA[15]。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)為SYBR Premix ExTaq(2×)10 μL,ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL,cDNA模板1.0 μL,上下游引物各0.4 μL,RNase Free水補(bǔ)足。PCR程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火和延伸30 s(40 個循環(huán));60~95 ℃,熔點(diǎn)分析。

    表1 應(yīng)激相關(guān)基因real-time PCR引物Table 1 Real-time PCR primer sequences for stress response genes

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大腸桿菌O26菌株酸耐受比較

    鹽酸耐受實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),鹽酸處理2 h后22 株菌存活菌數(shù)均顯著下降(P<0.05),但耐受情況存在菌株差異,其中菌株133Z(hly+)存活率最高(92.92%),而菌株G13Z1(stx1+、hly+)下降最明顯,存活率為57.98%(圖1A)。乳酸耐受實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),乳酸處理2 h后22 株菌存活菌數(shù)均顯著下降(P<0.05),耐受情況亦存在菌株差異,菌株43SZ、77Z2、1Z2、G13Z1(stx1+、hly+)乳酸耐受較強(qiáng),存活率達(dá)84%以上,其中菌株43SZ存活率最高(91.08%);菌株G10Z1(hly+)(65.46%)、83Z2(63.43%)、83Z3(62.54%)存活率較低(圖1B)。

    圖1 22 株大腸桿菌O26鹽酸(A)和乳酸(B)耐受結(jié)果Fig.1 Hydrochloric acid (A) and lactic acid (B) tolerance of 22 E.coli O26 isolates

    綜合兩種酸的耐受情況,22 株菌對鹽酸和乳酸的耐受存在不同,菌株43SZ、123Z1對鹽酸和乳酸均較耐受,G13Z1(stx1+、hly+)不耐鹽酸,對乳酸則有較高耐受能力,而G10Z1(hly+)不耐乳酸,對鹽酸則有較高耐受能力。另外,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3 株毒力基因陽性的O26菌株G13Z1(stx1+、hly+)、G10Z1(hly+)、133Z(hly+)并沒有呈現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受能力。

    2.2 熱休克-酸應(yīng)激對大腸桿菌O26存活的影響

    根據(jù)酸耐受情況,選取以下5 株菌進(jìn)行熱休克-乳酸應(yīng)激:43SZ(鹽酸和乳酸耐受力均較強(qiáng))、G13Z1(鹽酸耐受力最弱、乳酸耐受力較強(qiáng))、49Z3(鹽酸耐受力較弱、乳酸耐受力中等)、G10Z1(鹽酸耐受力較強(qiáng)、乳酸耐受力較弱)、83Z3(鹽酸耐受力中等、乳酸耐受力較弱)。如圖2所示,混菌初始菌數(shù)約7.0(lg(CFU/mL)),在對照組中菌數(shù)逐漸增加,8 h后達(dá)到9.0(lg(CFU/mL))以上。酸應(yīng)激組,應(yīng)激2 h存活菌數(shù)即顯著下降(P<0.05),隨著應(yīng)激時(shí)間的延長存活菌數(shù)繼續(xù)下降,至8 h時(shí)已檢測不出。熱休克-酸應(yīng)激組,應(yīng)激后存活菌數(shù)亦逐漸下降,但應(yīng)激4 h及以后存活菌數(shù)均顯著高于酸應(yīng)激組(P<0.05),表明熱休克處理提高了酸應(yīng)激菌體的存活。

    圖2 大腸桿菌O26熱休克-酸應(yīng)激存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Survival of E.coli O26 under heat shock-acid stress

    2.3 熱休克-酸應(yīng)激對大腸桿菌O26應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

    選取菌株G10Z1(hly+,分離自牛肉)進(jìn)一步分析熱休克-酸應(yīng)激2、4 h時(shí)其應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)差異。rpoS基因表達(dá)情況與對照組相比,酸應(yīng)激2、4 h均顯著下調(diào)(P<0.05)、熱休克-酸應(yīng)激組均顯著上調(diào)(P<0.05);與酸應(yīng)激組相比,熱休克-酸應(yīng)激組均顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3)。

    圖3 熱休克-酸應(yīng)激時(shí)大腸桿菌O26 rpoS基因表達(dá)Fig.3 Expression of rpoS in E.coli O26 under heat shock-acid stress

    酸應(yīng)激相關(guān)基因asr、ycfR、gadA表達(dá)情況見圖4。其中asr基因酸應(yīng)激2、4 h均顯著下調(diào),熱休克-酸應(yīng)激組與酸應(yīng)激組相比顯著上調(diào)(P<0.05)。ycfR基因酸應(yīng)激2 h顯著下調(diào),4 h顯著上調(diào),而熱休克-酸應(yīng)激組2、4 h均顯著上調(diào)。gadA基因應(yīng)激后均顯著下調(diào)(P<0.05),且熱休克-酸應(yīng)激組下調(diào)更明顯。

    圖4 熱休克-酸應(yīng)激時(shí)大腸桿菌O26酸應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)Fig.4 Expression of acid stress response genes in E.coli O26 under heat shock-acid stress

    熱應(yīng)激相關(guān)基因rpoH、clpB、dnaK、groEL表達(dá)見圖5。酸應(yīng)激2、4 h,4 種基因均顯著下調(diào);熱休克-酸應(yīng)激組4 種基因除clpB、groEL2 h下調(diào),其他均顯著上調(diào)(P<0.05)。

    圖5 熱休克-酸應(yīng)激時(shí)大腸桿菌O26熱應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)Fig.5 Expression of heat stress response genes in E.coli O26 under heat shock-acid stress

    綜上,與對照組相比,菌株O26酸應(yīng)激2、4 h基因表達(dá)水平顯著下調(diào)(除ycfR4 h組);與酸應(yīng)激組相比,熱休克-酸應(yīng)激2、4 h基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(除gadA基因)。

    3 討 論

    乳酸在食品生產(chǎn)加工中廣泛存在,對食源性致病菌具有良好的抑制和殺滅效應(yīng)[21]。由于菌株差異,其應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制的不同,導(dǎo)致對乳酸應(yīng)激呈現(xiàn)不同的應(yīng)激存活反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)對22 株牛源性大腸桿菌O26進(jìn)行耐酸性比較,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O26對乳酸耐受存在明顯菌株差異。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)同一菌株對乳酸、鹽酸的耐受性不同,這與細(xì)菌對有機(jī)酸和無機(jī)酸的應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制不同有關(guān)[22-23]。

    食品生產(chǎn)加工中柵欄技術(shù)的使用,不同柵欄因子聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮協(xié)同殺菌效應(yīng),顯著增強(qiáng)抑菌效果[6-7];另一方面,交叉保護(hù)效應(yīng)的存在[8-9]也越來越引起研究者的重視。加熱是重要的生產(chǎn)加工手段,可有效控制有害菌,而加熱不充分、溫?zé)崽幚硪灿锌赡芴岣邿嵝菘司w對致死性應(yīng)激的耐受能力,產(chǎn)生交叉保護(hù)。Wiegand等[10]發(fā)現(xiàn)熱休克處理(48.3 ℃或49.4 ℃,5 min)提高了碎牛肉中大腸桿菌O157:H7經(jīng)54.4 ℃處理后的存活菌數(shù)。熱休克處理(47 ℃,15 min)提高了阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)對低溫和冷凍、干燥、高滲透、酸、乙醇、抗感染劑等多種應(yīng)激的耐受[12,24]。Tetteh等[13]發(fā)現(xiàn)熱休克處理(48 ℃,15 min)增強(qiáng)了福氏志賀菌(Shigella flexneri)對醋酸、乳酸、丙酸的耐受能力。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)熱休克處理(48 ℃,10 min)增強(qiáng)了大腸桿菌O157:H7對鹽酸的耐受能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱休克處理(48 ℃,15 min)增強(qiáng)了大腸桿菌O26的乳酸耐受能力,存活菌數(shù)顯著提高,表明熱休克對酸應(yīng)激菌體產(chǎn)生了交叉保護(hù),這將增加食品安全風(fēng)險(xiǎn),需引起重視。

    應(yīng)激過程中相關(guān)基因參與細(xì)菌的應(yīng)激響應(yīng)。大腸桿菌于非致死性酸性條件下可誘導(dǎo)多種耐酸系統(tǒng)和相關(guān)基因表達(dá)[25]。rpoS基因是調(diào)節(jié)一般應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,可保護(hù)細(xì)菌免受有害環(huán)境條件的傷害[26]。Lee等[27]研究報(bào)道酸性條件(pH 4.4)誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌rpoS蛋白表達(dá)上調(diào)。然而,Yang Yishan等[28]研究發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌長期暴露于乳酸條件并未上調(diào)rpoS表達(dá),King等[29]也發(fā)現(xiàn)大腸桿菌酸性pH值時(shí)rpoS水平較中性pH值低,本實(shí)驗(yàn)乳酸(pH 3.0)應(yīng)激后大腸桿菌O26rpoS基因表達(dá)也下調(diào)。上述報(bào)道不完全一致的原因可能與菌種、菌株、酸濃度、應(yīng)激時(shí)間等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中熱休克-酸應(yīng)激O26菌株rpoS基因表達(dá)上調(diào),表明熱休克產(chǎn)生的交叉保護(hù)與rpoS基因的表達(dá)有關(guān)。

    asr基因在酸應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[17]。谷氨酸依賴型耐酸系統(tǒng)是大腸桿菌最有效的耐酸系統(tǒng),gadA、gadB、gadC是主要的關(guān)鍵基因[25]。本實(shí)驗(yàn)乳酸應(yīng)激后酸應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)基本下調(diào),可能是該酸性條件對菌株G10Z1來說應(yīng)激程度強(qiáng)烈,達(dá)到致死性水平。進(jìn)一步熱休克處理導(dǎo)致上述基因表達(dá)上調(diào),表明熱休克的交叉保護(hù)與這些酸應(yīng)激基因的表達(dá)有關(guān)。Carruthers等[30]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7熱休克處理(50 ℃,15 min)導(dǎo)致82 個基因上調(diào),包括rpoH、dnaK、groEL等。本實(shí)驗(yàn)乳酸應(yīng)激后O26的rpoH、dnaK、groEL、clpB基因表達(dá)均顯著下調(diào),但熱休克-酸應(yīng)激處理基本上調(diào),表明熱休克的交叉保護(hù)與這些熱應(yīng)激基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

    4 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)選取牛源性O(shè)26菌株乳酸耐受性能不同的菌株混合進(jìn)行熱休克-酸應(yīng)激存活實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)O26酸耐受程度呈現(xiàn)菌株差異,且同一菌株對乳酸、鹽酸的耐受情況有差異。熱休克-酸應(yīng)激存活實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),應(yīng)激導(dǎo)致存活菌數(shù)顯著下降,而熱休克可發(fā)揮交叉保護(hù)效應(yīng),增強(qiáng)了O26抗酸能力。酸應(yīng)激導(dǎo)致應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)基本下調(diào),而熱休克-酸應(yīng)激與酸應(yīng)激菌體相比上述基因表達(dá)基本上調(diào),表明熱休克可能通過增加應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮交叉保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,當(dāng)非致死性熱處理與酸化聯(lián)合使用時(shí)應(yīng)注意交叉保護(hù)可能導(dǎo)致的O26食品風(fēng)險(xiǎn)增加的現(xiàn)象。在食品實(shí)際生產(chǎn)加工中,當(dāng)多種措施聯(lián)合應(yīng)用時(shí)食源性致病菌的風(fēng)險(xiǎn)評估及如何科學(xué)有效控制值得加強(qiáng)重視。

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