超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定小麥粉中硫脲、曲酸、噻苯咪唑、噻二唑、四環(huán)素

王 妍，李志剛，趙文濤，郭文萍，李瑩瑩，王娟強(qiáng)，姜 銳

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

小麥?zhǔn)俏覈筠r(nóng)作物之一，其富含豐富的碳水化合物及蛋白質(zhì)，主要用途為小麥粉的生產(chǎn)原料。國家統(tǒng)計局公布的數(shù)據(jù)顯示，我國小麥產(chǎn)量逐年上升[1]，小麥粉生產(chǎn)和消費快速增長，其安全和質(zhì)量問題一度十分突出。在小麥粉加工、制作過程中，生產(chǎn)者為了滿足小麥粉在感官性狀、筋力、蛋白含量、穩(wěn)定性等方面的要求，通常選擇添加不同品種的優(yōu)質(zhì)小麥進(jìn)行配粉，一些小作坊為了追求利益最大化，通過添加輔料或化學(xué)制劑的方式改善小麥粉的感官性狀，掩蓋原料本身質(zhì)量不過關(guān)的事實；另外，小麥儲存條件如不符合國家標(biāo)準(zhǔn)，在儲藏過程中極易發(fā)生霉變或蟲鼠危害導(dǎo)致小麥粉污染。不法商販通過向小麥粉中添加增白劑、防腐劑和抗生素如硫脲[2-3]、曲酸、噻二唑[4]等非食品原料，使小麥粉達(dá)到出廠標(biāo)準(zhǔn)，這一行為會產(chǎn)生嚴(yán)重的食品安全風(fēng)險，威脅消費者的身體健康[5-6]。為加強(qiáng)對小麥粉的監(jiān)管，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布第132號公告《總局關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告》，其中第四條“嚴(yán)禁生產(chǎn)企業(yè)在小麥粉中添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑、曲酸等非食品原料?！泵鞔_禁止面粉中添加硫脲、曲酸、噻二唑等物質(zhì)[7]。

目前，有關(guān)報道發(fā)現(xiàn)在小麥粉中檢測出噻苯咪唑、四環(huán)素的藥物殘留，這嚴(yán)重影響了小麥粉的食品安全性。噻苯咪唑，是一種高效、低毒性的廣譜殺菌劑，可用于小麥病害防治[8]。噻苯咪唑的長期接觸或食入可能會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，嚴(yán)重威脅消費者健康。美國、日本等國家現(xiàn)已嚴(yán)格控制食品中該物質(zhì)的殘留量，我國也將食品中噻苯咪唑的殘留量列為重要監(jiān)測項目[9]。四環(huán)素是一種廣譜殺菌藥物，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用。對人體部分器官的細(xì)胞有很大的毒性，不僅會引起腸胃疾病，還會造成耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)[10]。

目前，鮮見文獻(xiàn)報道同時測定小麥粉中這5種物質(zhì)的檢測方法。申科敏等[11]用高效液相色譜法同時測定小麥粉中曲酸、噻二唑、硫脲，方法檢出限較高；目前食品中噻苯咪唑的檢測方法主要有氣相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]、液相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]、表面增強(qiáng)拉曼法等[17]；四環(huán)素常見的方法有液相色譜法[18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-20]，檢測限均高于本方法。噻苯咪唑及四環(huán)素兩種物質(zhì)均鮮報道在面粉基質(zhì)中的檢測方法。本研究旨在采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立一種高通量、高靈敏度的快速定量檢測方法，以期能夠同時檢測出小麥粉中硫脲、曲酸、噻二唑、噻苯咪唑、四環(huán)素5種物質(zhì)，全面保障小麥粉的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉 市售。

硫脲（純度≥99.0%）、曲酸（純度≥98.0%）上海安譜科技股份有限公司；噻苯咪唑（純度≥98.9%）、四環(huán)素（純度≥97.15%） 德國Dr.Ehrensorfer公司；噻二唑（純度≥99.5%） 北京振翔科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜級），無水乙醇（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290高效液相色譜儀-6470串聯(lián)四極桿質(zhì)譜、渦旋振蕩儀 美國Agilent公司；S-100渦旋儀 日本Taiyo公司；離心機(jī) 日本Hitachi公司；Milli-Q純水儀美國Millipore公司；HSC-24B水浴氮吹儀 天津恒奧科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取溶液及流動相制備

體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸溶液：移取甲酸1 mL，加水稀釋至1 L，混勻。

體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液：量取無水乙醇400 mL，加水稀釋至500 mL，混勻。

1.3.2 樣品處理

稱2 g樣品，加入5 mL 80%乙醇溶液，渦旋2 min，用乙腈定容至10 mL。將樣品管置于高速渦旋儀，2 000 r/min，渦旋15 min。12 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于刻度管中，40 ℃水浴中氮吹干。加入1 mL 0.1%甲酸溶液，渦旋復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取硫脲標(biāo)準(zhǔn)品10 mg用10 mL水溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃冷藏保存。

曲酸、噻二唑、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取曲酸、噻二唑、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用10 mL甲醇溶解并定容，分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃冷凍保存。

噻苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取噻苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用100%甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL噻苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃冷凍保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：移取硫脲、曲酸、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1.00 mL，噻苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL，噻二唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 mL配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。其中硫脲、曲酸、四環(huán)素質(zhì)量濃度為10 μg/mL、噻二唑質(zhì)量濃度為100 μg/mL、噻苯咪唑質(zhì)量濃度為100 ng/mL，4 ℃冷藏保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別稱取6 份空白小麥粉樣品，每份2 g，依次移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20、50、100、200、500、1 000 μL添加到樣品中，使樣品充分吸收，參照1.3.2節(jié)前處理過程進(jìn)行處理。標(biāo)準(zhǔn)曲線的最終質(zhì)量濃度分別為（以硫脲為例）100、250、500、1 000、5 000 ng/mL。

1.3.4 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流速0.30 mL/min。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；正模式噴霧電壓3 000 V，負(fù)模式噴霧電壓2 500 V，輔助氣（氮氣）氣化溫度300 ℃，鞘氣（氮氣）流速11 L/min，鞘氣溫度350 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 5種物質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MRM mass spectrometric parameters for five substances

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)資料顯示[21-25]，5種物質(zhì)在反向色譜柱C18柱上均有保留，故實驗選取C18柱。

四環(huán)素容易在反相色譜柱的硅醇基上吸附，產(chǎn)生拖尾峰，需要在流動相中加入有機(jī)酸，才能取得較好分離度和峰形[26]。實驗分別選取0.1%甲酸溶液-甲醇、（0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液）-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈、（1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液）-乙腈4 種組合考察5種物質(zhì)的保留及響應(yīng)情況。結(jié)果表明，流動相含有乙酸銨時，負(fù)離子掃描模式下噻二唑的響應(yīng)值較好，正離子掃描模式下的4 種物質(zhì)的響應(yīng)較低，曲酸和四環(huán)素的峰形較差。選擇0.1%甲酸溶液作為水相，曲酸、硫脲、噻苯咪唑、四環(huán)素的響應(yīng)及峰形較理想，噻二唑響應(yīng)可滿足實驗要求。有機(jī)相為乙腈和甲醇對5種物質(zhì)的峰形和響應(yīng)的影響不明顯，采用乙腈可以有效降低儀器系統(tǒng)內(nèi)的壓力，最終選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相。

如圖1所示，5種物質(zhì)因結(jié)構(gòu)性的差異，與固定相之間產(chǎn)生的吸附力大小、強(qiáng)弱不同可以看出曲酸、硫脲極性較強(qiáng)，因此首先采用高比例的水相進(jìn)行分離，硫脲和曲酸依次出峰。再加大有機(jī)相比例洗脫另外3 種物質(zhì)，實現(xiàn)5種化合物較好的分離。

圖1 5種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulae of five substances

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

硫脲結(jié)構(gòu)中含有氨基，曲酸吡喃環(huán)上連接酚羥基和羥甲基，噻苯咪唑和四環(huán)素的分子結(jié)構(gòu)也較容易得到H+形成[M+H]+型分子離子峰，因此硫脲、曲酸、四環(huán)素、噻苯咪唑均選擇電噴霧離子正離子模式。噻二唑結(jié)構(gòu)中含有一個巰基，易失去H+形成[M-H]-型分子離子峰，故化合物噻二唑選擇電噴霧離子負(fù)離子模式。分別配制1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個化合物在相應(yīng)的模式下進(jìn)行全掃描和單離子掃描得到母離子并優(yōu)化碎裂電壓，使母離子的豐度達(dá)到最優(yōu)。隨后進(jìn)行子離子掃描，找到兩個特征碎片離子，優(yōu)化碰撞電壓，并選取豐度較高的子離子作為定量離子。5種化合物的總離子流圖、定量離子和定性離子圖，見圖2、3。

圖2 5種化合物的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of five compounds

圖3 5種物質(zhì)的定量、定性及離子比例圖Fig.3 Quantitative and qualitative chromatograms and mass spectra of five substances

2.3 前處理過程優(yōu)化

根據(jù)5種物質(zhì)的溶解性和相關(guān)文獻(xiàn)資料的報道，實驗選擇甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、乙二胺四乙酸二鈉-Mcllvsine緩沖液、水、80%乙醇-乙腈（1∶1，V/V）作為提取溶劑進(jìn)行比較。選擇乙二胺四乙酸二鈉-Mcllvsine緩沖液、水提取樣品并離心后，上清液較為渾濁，且僅有四環(huán)素回收率較好，其他化合物回收率均低于70%；甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、80%乙醇-乙腈（1∶1，V/V）沉淀蛋白效果較好，采用氮吹方式除雜和濃縮后回收率可得到較優(yōu)結(jié)果。

實驗結(jié)果表明，添加100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.3.1.2節(jié)），相當(dāng)于硫脲、曲酸、四環(huán)素添加量為250 μg/kg，噻苯咪唑為2.5 μg/kg，噻二唑為2.5mg/kg時，采用80%乙醇溶液-乙腈（1∶1，V/V）混合體系為提取溶劑時，5 種物質(zhì)的回收率可達(dá)到80%以上。綜上，本研究最終選擇80%乙醇溶液-乙腈（1∶1，V/V）作為提取溶劑，并采用氮吹方式除雜和濃縮。不同提取溶劑對回收率的影響見圖4。

圖4 提取溶劑對回收率的影響Fig.4 Effect of different extraction solvents on recoveries of five analytes

本實驗還考察不同復(fù)溶溶液對5 種物質(zhì)回收率的影響。向空白樣品基質(zhì)溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后吹干，分別用1 mL 0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸溶液-乙腈（1∶1，V/V）、乙腈定容，渦旋混合后過0.22 μm濾膜上機(jī)測定。添加100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.3.3節(jié)），相當(dāng)于硫脲、曲酸、四環(huán)素添加量為250 μg/kg，噻苯咪唑為2.5 μg/kg，噻二唑為2.5mg/kg時，結(jié)果見圖5。0.1%甲酸溶液復(fù)溶樣品，5 種物質(zhì)回收率較好，干擾小，峰形、響應(yīng)均較為理想，故本實驗選取0.1%甲酸溶液作為復(fù)溶溶劑。

圖5 復(fù)溶溶液對5 種物質(zhì)回收率的影響Fig.5 Effect of different redissolution solvents on recoveries of five analytes

2.4 方法學(xué)結(jié)果

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

樣品經(jīng)前處理后依然保留在待測液中的糖類、可溶性蛋白或肽類等有機(jī)化合物、無機(jī)鹽等雜質(zhì)與目標(biāo)化合物共流出，進(jìn)入電離源，影響目標(biāo)化合物的離子化效率，即基質(zhì)效應(yīng)[27]。引起目標(biāo)化合物響應(yīng)降低稱為基質(zhì)抑制效應(yīng)，響應(yīng)升高為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[28]。本研究通過提取后添加法評價5 種待測物在小麥粉中的基質(zhì)效應(yīng)[29]。將空白樣品按前處理步驟提取凈化后，向提取液中添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。另外制作一條用流動相配制的相同質(zhì)量濃度梯度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液[30-31]。分別測定并根據(jù)質(zhì)量濃度與峰面積繪制曲線得到兩條曲線斜率，根據(jù)下式計算基質(zhì)效應(yīng)[32]：

式中：A為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

實驗結(jié)果顯示，小麥粉基質(zhì)對噻苯咪唑產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，對噻二唑、四環(huán)素、曲酸、硫脲的測定存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，見表3。有研究指出，處理生物樣品時不采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液法，而應(yīng)采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)前加標(biāo)法消除或補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)[34]。故本研究采用空白基質(zhì)前加標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，有效消除基質(zhì)效應(yīng)，降低硫脲、曲酸回收率低對結(jié)果準(zhǔn)確性的影響[35]。

表3 小麥粉中5 種物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)評價Table 3 Matrix effect evaluation of five analytes in flour

2.4.2 線性、檢出限與定量限

稱取6 份空白小麥粉樣品，每份2 g，依次移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20、50、100、200、500、1 000 μL添加到樣品中，按1.3.2節(jié)樣品處理過程操作，制作基質(zhì)加標(biāo)曲線。分別繪制線性方程，硫脲、曲酸、四環(huán)素線性范圍為100～5 000 ng/mL，噻苯咪唑線性范圍為1～50 ng/mL，噻二唑線性范圍為1～50 μg/mL，相關(guān)系數(shù)在0.999以上，線性關(guān)系良好，見表4。硫脲、曲酸、四環(huán)素檢出限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg。噻苯咪唑檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1 μg/kg。噻二唑檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1 mg/kg。檢出限滿足RSN≥3，定量限滿足RSN≥10。

表4 小麥粉中5 種物質(zhì)的線性關(guān)系Table 4 Calibration curve equations of five analytes in flour

2.4.3 回收率與精密度實驗

選取空白小麥粉樣品，每份2 g，分別添加低、中、高水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平做6 次平行實驗，結(jié)果見表5。結(jié)果表明3 個不同添加水平的回收率在88.6%～102.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～5.6%之間，均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》中要求。

表5 小麥粉基質(zhì)中5 種化合物不同添加水平回收率結(jié)果Table 5 Recoveries of five analytes in flour matrix at different spiked levels

2.5 實際樣品的測定

按照本方法對市售25 批次小麥粉進(jìn)行分析，其中1 批次檢測出噻苯咪唑殘留。本方法可用于實際樣品的快速定量檢測。

3 結(jié) 論

本實驗建立了一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定小麥粉中硫脲、曲酸、噻苯咪唑、噻二唑、四環(huán)素物質(zhì)的檢測方法，其中硫脲、曲酸、四環(huán)素檢出限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg；噻苯咪唑檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1 μg/kg；噻二唑檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1 mg/kg。方法靈敏度、回收率高、重復(fù)性好、前處理操作簡便快速，在實際檢測中具有較強(qiáng)的可操作性，可以作為小麥粉中非法添加物的定量檢測方法。