高效液相色譜法測定食品中可能摻雜的16 種工業(yè)染料

鐘麗琪，曹 進(jìn)，錢 和，丁 宏，郭亞輝

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動下的食品摻假是目前食品真實性檢驗的重要研究方向。工業(yè)染料具有良好的穩(wěn)定性，且獲得方便價格便宜，在食品生產(chǎn)過程中，常被添加到其中改善外觀和色澤。按照《食品安全法》和相關(guān)添加劑使用規(guī)定[1]，該類添加劑是食品安全重要隱患，同時會給消費者帶來健康安全風(fēng)險。例如蘇丹紅為致癌物，全球禁止將其用作食品著色劑[2]。在利益的驅(qū)使下，工業(yè)染料依舊出現(xiàn)于食品中，英國曾在350多種食品中發(fā)現(xiàn)蘇丹紅；歐盟在檢測到從印度、巴基斯坦等國調(diào)味品中的蘇丹染料后，要求出口到歐盟的食品都必須經(jīng)過認(rèn)證，不含工業(yè)染料[3-4]。中國也有不法商販用羅丹明B在海蝦中染色，用酸性橙等在豆制品中染色[5]。因此，為了有效地控制工業(yè)染料在食品中的濫用，建立一種快速測定和篩查食品中非法添加工業(yè)染料的檢測方法非常必要。

目前，檢測工業(yè)染料的方法有薄層色譜法[6]、免疫法[7]、電化學(xué)分析法[8]、高效液相色譜法[9-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]等，其中最常用的是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖靈敏度高、分辨率好，但存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，對前處理要求高，且檢測成本大。因此本實驗選用高效液相色譜-二極管陣列檢測器對16 種工業(yè)染料進(jìn)行測定，以期得到一種可用于日?？焖贆z驗的方法。

糖果、巧克力、番茄醬與番茄沙司是人們常食用的食品，都具有較突出的色澤特性，而蘇丹紅、分散紅、分散橙、分散黃類染料具有鮮明的染色特性，與上述食品對色澤的追求多有吻合之處，存在非法使用的可能。文獻(xiàn)顯示，近幾年食品中違禁工業(yè)染料的測定多集中在肉制品、豆制品等基質(zhì)[15-17]，有關(guān)糖果、巧克力類基質(zhì)的文獻(xiàn)相對較少。而糖果、巧克力基質(zhì)的測定多集中在水溶性色素、國家允許使用的合成色素（檸檬黃、亮藍(lán)、胭脂紅等）方面[18-19]。所以未來工業(yè)染料檢測的很大可能會趨向于糖果、巧克力等甜品基質(zhì)的檢測。如今國標(biāo)中已有同時測定11 種允許添加的合成色素的高效液相色譜檢測方法，但還未有同時測定多種工業(yè)染料的高效液相色譜檢測方法。為此，本研究建立一種高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測和定量糖果、巧克力、番茄醬與番茄沙司中16 種工業(yè)染料的快速分析方法，可為后續(xù)制定國標(biāo)方法提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖果、巧克力、番茄醬、番茄沙司 市購。

乙腈（色譜純） 美國Thermo Fisher公司；16 種工業(yè)染料標(biāo)準(zhǔn)品（分散紅11（CAS：2872-48-2）、分散黃9（CAS：6373-73-5）、分散橙3（CAS：730-40-5）、分散橙11（CAS：82-28-0）、分散紅1（CAS：2872-52-8）、分散紅9（CAS：82-38-0）、分散黃54（CAS：7576-65-0）、分散橙37（CAS：13301-61-6）、分散橙61（CAS：12270-45-0）、蘇丹紅1（CAS：842-07-9）、分散黃7（CAS：6300-37-4）、分散橙149（CAS：85136-74-9）、蘇丹紅2（CAS：3118-97-6）、蘇丹紅3（CAS：85-86-9）、蘇丹紅7B（CAS：6368-72-5）、蘇丹紅4（CAS：85-83-6）） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate3000高效液相色譜儀 美國賽默飛公司；ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）美國Agilent公司；U-3900V紫外檢測器、CR21GIII型高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；XP205分析天平瑞士Mettler公司；VORTEX-5型渦旋混合器 其林貝爾儀器制造有限公司；N-D30S氮氣濃縮裝置 上海潤榕科學(xué)器材有限公司；0.22 μm PTFE濾膜 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

單一標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：每個標(biāo)準(zhǔn)溶液單獨配制，質(zhì)量濃度為1 mg/mL。蘇丹紅3、蘇丹紅4用二氯甲烷配制，其余標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈配制，可于-20 ℃貯存3 個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：每種單一標(biāo)準(zhǔn)溶液取相同量混合后用乙腈稀釋至50 μg/mL，可于4 ℃貯存1 個月。

1.3.2 樣品的預(yù)處理

取約10 g糖果研磨成均勻粉末后裝入50 mL聚四氟乙烯離心管中備用，取約10 g巧克力裝入50 mL離心管中，在40 ℃水浴加熱至融化并用玻璃棒攪拌3 min后，室溫冷卻至凝固備用。番茄醬、番茄沙司取約10 g裝入50 mL離心管中用玻璃棒攪拌3 min后備用，所有樣品均在4 ℃條件下貯存。

1.3.3 染料的結(jié)構(gòu)分析

工業(yè)染料可分為偶氮型染料（圖1A）、蒽醌型染料（圖1B）、雜環(huán)型染料（圖1C）。偶氮型染料含有偶氮基團(tuán)，蒽醌型染料含有苯醌基團(tuán)或多環(huán)酮，雜環(huán)型染料含有不同的雜環(huán)。雖然16 種工業(yè)染料的結(jié)構(gòu)存在一定的差異，但都為脂溶性工業(yè)染料，能溶于有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水。張艷俠等[20]使用乙腈提取偶氮染料，錢疆等[21]使用乙腈-丙酮-氨水提取堿性及蘇丹染料。路勇等[22]用乙腈提取，再用正己烷輔助提取偶氮染料和蒽醌染料。本實驗參考相關(guān)文獻(xiàn)的提取溶劑后，根據(jù)這16 種工業(yè)染料的結(jié)構(gòu)特點，最終選擇乙腈作為提取溶劑，并且達(dá)到了非常滿意的效果。

圖1 工業(yè)染料Fig.1 Chemical structures of three types of industrial dyes

1.3.4 樣品的提取

取1 g經(jīng)預(yù)處理的樣品于15 mL聚四氟乙烯離心管中，精密加入2 mL乙腈，渦旋1 min，室溫下超聲提取30 min后，在10 ℃、8 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移樣品的上清液至新15 mL離心管內(nèi)。在殘渣中再加入2 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并上清液，最后在殘渣中加入1 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并上清液并混勻。取1 mL上清液過0.22 μm的PTFE濾膜裝入進(jìn)樣小瓶，備用。

1.3.5 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；進(jìn)樣量20 μL；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min。紫外檢測器檢測波長分別為370、440、470 nm和520 nm。流動相A為水，流動相B為乙腈。采用梯度洗脫，見表1。

表1 流動相洗脫梯度Table 1 Mobile phase composition for elution gradient

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的選擇

先用紫外檢測器對16 種工業(yè)染料進(jìn)行全掃描（200～800 nm）確定每種染料的最大吸收波長。結(jié)果如表2所示，最終選擇370、440、470 nm和520 nm進(jìn)行檢測。

表2 16 種工業(yè)染料的最大吸收波長與檢測波長Table 2 Maximum absorption wavelengths and detection wavelengths for 16 industrial dyes

2.2 液相色譜分離條件的優(yōu)化

本方法比較乙腈-水、甲醇-水、乙酸鹽等緩沖鹽體系進(jìn)行分離優(yōu)化，分離效果并未有很大差別。同時因為在流動相中加入緩沖鹽，對色譜柱以及管路系統(tǒng)造成一定的損傷。因此在充分評價分離效果，并以分離度、拖尾因子、色譜峰純度等為綜合指標(biāo)進(jìn)行分析，本方法使用乙腈-水已能完全滿足分離要求，因此確定以乙腈-水作為流動相。樣品檢測結(jié)果見圖2。

圖2 番茄沙司中16 種工業(yè)染料的高效液相色譜圖（470 nm, 20 mg/kg）Fig.2 HPLC chromatogram of 16 industrial dyes in tomato sauce(20 mg/kg) detected at 470 nm

在洗脫過程中，李蘭等[23]用75%水相與25%的有機(jī)相開始洗脫，因為工業(yè)染料溶于有機(jī)溶劑，一般在有機(jī)相比例較高時被洗脫下來。本研究在使用75%水相洗脫時發(fā)現(xiàn)，由于水相比例過高導(dǎo)致前7 min并未有工業(yè)染料被洗脫出來。但若水相比例過低，出峰時間提早，分析物也會受到雜質(zhì)的干擾，最后確定以60%的水相和40%的有機(jī)相起始洗脫。

2.3 樣品提取劑的確定

在樣品提取凈化過程中，常用的凈化方式有凝膠色譜法、固相萃取法。凝膠色譜法適用于非極性的染料，對于極性較強(qiáng)的分散染料并不適用。使用固相萃取柱去除雜質(zhì)時發(fā)現(xiàn)，由于蘇丹紅7B沒有酚羥基，在固相萃取柱上的保留性較差，當(dāng)用己烷淋洗去除雜質(zhì)時也會被洗脫下來；相反地極性染料卻不容易被洗脫下來。馮月超等[24]使用中性氧化鋁固相萃取柱除雜質(zhì)后，大部分染料的回收率在70%左右。Zhao Shan等[25]用冷凍法過濾樣品中的雜質(zhì)，但冷凍法要花費2 h以上，前處理時間過長，不適合用在快速篩選的檢測項目。固相萃取柱的使用雖然可以起到對雜質(zhì)的清除效果，但是針對本研究檢測的基質(zhì)依然具有一定的局限，曾嘗試?yán)梅聪蛱盍?、弱酸堿性填料進(jìn)行凈化，并不能獲得較好的回收效果。Tsai等[26]直接用乙腈提取得到了較好的回收率，但樣品需求量過大，不適用于快速篩選的檢測項目；Tamim等[27]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接提取存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)和干擾，導(dǎo)致某些染料的回收率只有54%。綜合分析，考慮到所檢測的16 種工業(yè)染料在較寬的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能完全溶于乙腈，同時所檢測基質(zhì)采用有機(jī)溶劑提取已經(jīng)可以滿足相應(yīng)的雜質(zhì)清除，并且可達(dá)到較好的回收率，故選擇乙腈作為提取溶劑。

2.4 濾膜的選擇

選擇常用的尼龍、PTFE和PVDF濾膜進(jìn)行對比，實驗發(fā)現(xiàn)尼龍濾膜會對紅色染料產(chǎn)生吸附，能在濾膜上看見明顯的殘留。PTFE、PVDF對紅色染料都沒有明顯的吸附，綜合考慮選用PTFE濾膜。

2.5 方法驗證的結(jié)果

2.5.1 線性方程、檢出限與定量限結(jié)果

如表3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線是利用5 個校準(zhǔn)點（0.5、1、2、4、5 μg/mL）對分析物峰積分的峰面積值與分析物質(zhì)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸得到的。標(biāo)準(zhǔn)曲線上所有點的值均為3 次進(jìn)樣的平均值。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均大于0.999 6。按照以RSN為3計算檢出限（limit of detection，LOD）、以RSN為10計算定量限（limit of quantitation，LOQ），如表4所示，LOD為0.26～0.88 mg/kg，LOQ為0.82～2.52 mg/kg，實際稀釋后測定也得到相似的結(jié)果。據(jù)歐洲調(diào)味品協(xié)會專家委員會的資料顯示，工業(yè)染料的檢出量為3～3 500 mg/kg[28]，本方法測得的LOQ與LOQ完全滿足常規(guī)檢測。

表3 16 種工業(yè)染料的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及保留時間Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and retention times for 16 industrial dyes

表416 種工業(yè)染料在4 種食品基質(zhì)中的LOD和LOQTable 4 LODs and LOQs of 16 industrial dyes in four food matrices mg/kg

2.5.2 準(zhǔn)確度、回收率與精密度結(jié)果

在線性范圍內(nèi)選擇3 種不同加標(biāo)量（2.5、10、20 mg/kg）的標(biāo)準(zhǔn)品加到空白樣品中，對方法的回收率和精密度進(jìn)行評估，其中低水平為線性范圍的最低點。

準(zhǔn)確度用加標(biāo)水平的回收率評價。精密度以加標(biāo)水平相互獨立測定結(jié)果的重復(fù)性進(jìn)行評價，每個加標(biāo)水平進(jìn)行6 次平行實驗，以測出量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法重復(fù)性。由表5可知，番茄醬、番茄沙司、糖果、巧克力中16 種工業(yè)染料的回收率分別為83.0%～101.4%、81.0%～98.7%、94.7%～110.3%、85.4%～109.7%；RSD分別為0.3%～4.1%、0.3%～7.4%、0.4%～7.5%、0.6%～3.6%。日間精密度是在0、4、8、12、24 h和48 h重復(fù)測定同一樣品6 次，發(fā)現(xiàn)RSD均小于15%。結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度和精密度均基本滿足定量分析的要求。

表5 16 種工業(yè)染料在4 種食品基質(zhì)中的回收率與RSDTable 5 Spiked recoveries and RSDs of 16 industrial dyes in four food matrices

需要說明的是，本方法并未根據(jù)每種工業(yè)染料確定不同的線性范圍和加標(biāo)量以獲得最佳的回收率與檢出限，雖然根據(jù)單個工業(yè)染料在單個體系下優(yōu)化設(shè)計的線性范圍與加標(biāo)量能達(dá)到最優(yōu)的結(jié)果，但同時也會失去快速篩查這一優(yōu)勢，故采用同一線性范圍及加標(biāo)量。

2.5.3 方法穩(wěn)定性

通過檢測加標(biāo)量為10 mg/kg的樣品在0、24 h和48 h的含量后，以峰面積計算16 種工業(yè)染料的RSD，結(jié)果如表6所示。16 種工業(yè)染料的RSD均小于15%，表明此方法的穩(wěn)定性滿足定量分析的要求。

表6 加標(biāo)量為10 mg/kg樣品在0、24 h和48 h的含量及RSDTable 6 Average contents and RSD of the dyes in samples spiked at 10 mg/kg determined at 0, 24 and 48 h after addition

2.6 實際樣品測定

在實際樣品的檢測中，楊立新等[29]在辣椒制品中發(fā)現(xiàn)了堿性橙21的陽性樣。邵國建等[30]未在13 批膨化食品中發(fā)現(xiàn)蘇丹類及堿性染料的陽性樣。宋鑫等[31]未在100 批肉制品中發(fā)現(xiàn)蘇丹類染料。本實驗應(yīng)用此方法對市售20 批樣品（每種基質(zhì)各5 批）進(jìn)行測定，16 種禁用染料均未檢出，其未檢出可能是大型超市來源的商品大多來自正規(guī)廠商，同時也存在采樣量不足的原因。

3 結(jié) 論

本研究采用了簡單的一步萃取法，建立高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定糖果、巧克力、番茄醬、番茄沙司中的16 種工業(yè)染料的快速篩查方法，對樣品前處理條件、線性關(guān)系、檢出限和精密度等參數(shù)進(jìn)行了方法學(xué)優(yōu)化與驗證。本方法的目標(biāo)分析物涵蓋了目前市場上較容易取得的食品中禁用的紅橙黃色工業(yè)染料，方法穩(wěn)定性好，可操作性強(qiáng)，提高了工作效率，降低了檢測成本。這項研究的實質(zhì)是創(chuàng)建一種分析食品中非法添加工業(yè)染料的實用方法，該方法可為打擊食品非法添加劑行為的大規(guī)模監(jiān)督檢驗計劃項目提高工作效率。