Runx2對骨骼生長發(fā)育的影響*

曹志威，申 杰，張司璽，張春陽

[1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；3.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科疾病研究所(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué))；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心]

Runx2是Runx轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其家族基因還有Runx1和Runx3。Runx2在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和多能間充質(zhì)干細(xì)胞等多種形式的細(xì)胞中都有一定的表達[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺和胸腺中Runx2也有所表達。雖然Runx2不是T細(xì)胞發(fā)育所必需，但它是乳腺發(fā)育所必需[2]。P1和P2兩個啟動子對Runx2基因的轉(zhuǎn)錄起到調(diào)控作用。P1與P2轉(zhuǎn)錄過程中相對應(yīng)的兩種異構(gòu)體，均能夠在成骨細(xì)胞系和軟骨細(xì)胞中表達，但Runx2在這些系中的表達受增強子的調(diào)控，其中大部分仍有待鑒定[3]。

1 Runx2在軟骨細(xì)胞中的功能

Runx2在各時期的軟骨細(xì)胞中都有表達，但在各個階段表達量有所不同，前期增加，中期略有下降，終末期再次增加。Runx2實驗鼠除脛骨、腓骨、尺骨、橈骨外，在其他骨骼中，都未找到肥大軟骨細(xì)胞[4]。Runx3在早期肥大軟骨細(xì)胞中，也有一定表達。Runx3基因敲除實驗鼠軟骨細(xì)胞的成熟在胚胎階段存在相應(yīng)的滯后性。Runx2與Runx3基因敲除實驗鼠的全部骨骼，均未發(fā)現(xiàn)肥大軟骨細(xì)胞。所以，Runx2和Runx3在軟骨細(xì)胞的發(fā)育形成中扮演著重要角色。Runx2發(fā)揮關(guān)鍵功能，而Runx3發(fā)揮輔助性功能。在早期肥大軟骨細(xì)胞中，Runx2影響Ihh的表達，進而加快軟骨細(xì)胞的增殖速度[5]。另外，在一些實驗中還觀察到，Ihh影響甲狀旁腺激素樣激素(Pthlh)的生成，而后者抑制Runx2，從而延緩軟骨細(xì)胞的成熟過程。Runx2-Ihh-Pthlh形成軟骨細(xì)胞發(fā)展過程中的負(fù)反饋環(huán)[6]。

Runx2在軟骨細(xì)胞中的過表達加速了整個軟骨細(xì)胞的成熟，從而損害關(guān)節(jié)的形成。細(xì)胞黏合素(Tenascin)在永久軟骨中表達，但在特異性的Runx2轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炐∈笾?，其軟骨?nèi)并未表達。在特異性陰性的Runx2轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇笾校琓enascin在全部骨骼環(huán)境下均有分布[7]。它對軟骨細(xì)胞變成像生長板樣的軟骨細(xì)胞還是關(guān)節(jié)軟骨樣的永久性軟骨細(xì)胞具有決定性作用。Runx2基因敲除實驗鼠對骨關(guān)節(jié)炎的形成和發(fā)展，有明顯的延緩作用，而軟骨細(xì)胞特異性Runx2的不足推遲OA的變化，三苯氧胺誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨中Runx2表達加速實驗性O(shè)A小鼠的OA進展[8-9]。除Runx2表達外，Runx2調(diào)節(jié)的Ihh、Mmp13和Col10a1表達也增加[10]。導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的一個原因是軟骨細(xì)胞的成熟，而Runx2轉(zhuǎn)錄因子在其中起著關(guān)鍵作用。

2 Runx2在成骨細(xì)胞中的功能

Ihh基因敲除小鼠的實驗中，在軟骨中沒有觀察到成骨細(xì)胞的分布，軟骨膜中出現(xiàn)的基因并未發(fā)現(xiàn)Runx2，說明軟骨內(nèi)骨必須要Ihh才能表達Runx2[11]。Ihh與受體Patched(Ptch)結(jié)合解除Ptch對Smoothened(Smo)的抑制，Smo最終調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Gli[12]。在使用Col2a1-Cre的Smo因素敲除實驗鼠中，Cre在軟骨細(xì)胞和包含成骨細(xì)胞前體的軟骨膜細(xì)胞中都有一定的表達，相比之下Runx2在軟骨膜中并未表達，不過在軟骨膜外的細(xì)胞中，觀察到Runx2的存在[13]。然而，指導(dǎo)成骨前細(xì)胞表達Cre的Sp7Cre缺失Smo并不影響成骨細(xì)胞的分化[14]。所以，Hedgehog信號路徑調(diào)控Runx2表達與成骨細(xì)胞分化的作用，只是出現(xiàn)在軟骨內(nèi)骨發(fā)育的骨祖細(xì)胞階段。

在使用Twist2Cre的條件性Ctnnb1基因敲除實驗鼠中，未觀察到成骨細(xì)胞的分布，但Runx2在軟骨膜內(nèi)表達[15]。所以，Wnt信號路徑的功能實現(xiàn)，對成骨細(xì)胞分化過程十分關(guān)鍵，不過對Runx2在相應(yīng)前體細(xì)胞中的表達，并非是不可或缺的。Sp7是成骨細(xì)胞分化所必需的另一種轉(zhuǎn)錄因子。Sp7基因敲除小鼠缺乏成骨細(xì)胞，但Runx2在骨祖細(xì)胞中表達[16]。Sp7在成骨前細(xì)胞和成骨細(xì)胞中都有表達，Runx2誘導(dǎo)Sp7表達[17]。因此，Runx2是Sp7的上游轉(zhuǎn)錄因子。在敲除Ctnnb1基因與SP7基因敲除的實驗鼠中，骨祖細(xì)胞能夠分化成軟骨細(xì)胞。所以，表達Runx2的成骨細(xì)胞一直具有朝軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的性能，Wnt信號和Sp7影響骨祖細(xì)胞的分化，同時抑制其向軟骨細(xì)胞的分化。

骨祖細(xì)胞和成骨前細(xì)胞弱表達I型膠原，這是一種異三聚體蛋白，由Col1a1和Col1a2分別編碼的兩條cyp1(I)鏈和一條cyp2(I)鏈組成。未成熟的成骨細(xì)胞上調(diào)Col1a1和Col1a2的表達，表達Spp1和Ibsp，成熟的成骨細(xì)胞表達有Bglap2和Bgap編碼的骨鈣素[18]。體外研究表明，Runx2上調(diào)這些基因的表達[19]。在Runx2基因敲除小鼠中缺乏成骨細(xì)胞系細(xì)胞表達這些基因。在丟失Runx2基因P1啟動子和外顯子I的Ⅱ型Runx2缺陷小鼠骨骼中，Spp1和Bglap2表達減少，但Col1a1表達增加[20]。成骨細(xì)胞中欠缺結(jié)構(gòu)域丟失情況下，并不會造成骨骼表型的缺失，外顯子8的不足將會形成隱藏的Runx2蛋白，后者保留DNA結(jié)合能力，而轉(zhuǎn)錄激活性能不足，造成骨骼質(zhì)量變差[21]。由于隱蔽的Runx2蛋白可能干擾Runx3的結(jié)合，而Runx3也參與骨形成[22]。所以Runx2是怎樣在機體內(nèi)部調(diào)控相關(guān)蛋白基因的表達，后續(xù)還需要深入研究。

3 Runx2對成骨細(xì)胞系細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)功能

使用Prrx1啟動子過表達Runx2導(dǎo)致顱縫早閉和肢體缺損[23]。肢體缺損的具體狀態(tài)和轉(zhuǎn)基因的表達情況相關(guān)。肢體經(jīng)過成纖維細(xì)胞生長因子(Fgfs)與相應(yīng)受體形成的上皮-間充質(zhì)相互作用環(huán)發(fā)育[24]。間充質(zhì)中表達的Fgf10通過對和Fgf10具有高親和力的Fgfr2b誘導(dǎo)上皮中Fgf4和Fgf8的表達。Fgf4和Fgf8通過與Fgf4和Fgf8具有高親和力的Fgfr1c和Fgfr2c誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞增殖。在Runx2過表達的小鼠中，F(xiàn)gf4和Fgf8在上皮中的表達受損，頂端外胚層嵴(AER)的形成中斷。這些表型是由間充質(zhì)中與Fgf10有高親和力的Fgfrs表達上調(diào)引起。Runx2通過直接調(diào)節(jié)Fgfr1、Fgfr2和Fgfr3的啟動子來誘導(dǎo)它們的表達[25]。

Ctnnb1基因敲除小鼠和SP7基因敲除小鼠都缺乏成骨細(xì)胞，但在假定的骨區(qū)域有豐富的骨祖細(xì)胞。雖然Runx2基因敲除實驗鼠同樣缺乏成骨細(xì)胞，不過骨祖細(xì)胞只在特定的范圍中有分布。在Sp7基因敲除小鼠體內(nèi)的骨祖細(xì)胞表達Runx2并活躍增殖。Sp7基因敲除小鼠的脛骨和腓骨，因為內(nèi)部骨祖細(xì)胞的充分積聚而彎曲，表明Runx2在骨祖細(xì)胞擴增中是必需的。事實上，Runx2誘導(dǎo)來源于野生型和SP7基因敲除小鼠的骨祖細(xì)胞的增殖，并增加Fgf2誘導(dǎo)的增殖。Fgfr2和Fgfr3參與增殖，F(xiàn)gfr2在顱骨中的表達水平遠(yuǎn)高于Fgfr3，因此Fgfr2起主要作用。Sp7基因敲除Runx2基因敲除小鼠的骨祖細(xì)胞數(shù)量和增殖頻率只有SP7基因敲除小鼠的一半，提示骨祖細(xì)胞的增殖依賴于Runx2的基因劑量。因此，骨祖細(xì)胞增殖需要Runx2，是通過直接調(diào)節(jié)Fgfr2和Fgfr3誘導(dǎo)的[26]。

一些報道表明，Runx2在體外能夠抑制向成骨細(xì)胞系或間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[26]。Runx2基因敲除顱骨細(xì)胞體外增殖快于野生型顱骨細(xì)胞。有研究顯示，在Runx2基因敲除小鼠的培養(yǎng)中，細(xì)胞周期相關(guān)基因在顱骨組織和顱骨來源的細(xì)胞之間表達不同[25]。雖然Runx2基因敲除顱骨細(xì)胞在體外獲得高增殖活性的原因尚不清楚，但Runx2在體內(nèi)和體外都能促進成骨前體細(xì)胞的增殖。

4 Runx2在間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中的作用

經(jīng)過創(chuàng)建顱骨發(fā)育模型，可以較為理想地闡述間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化過程和內(nèi)在原理。Runx2基因敲除小鼠沒有顱骨，只有一層薄薄的間充質(zhì)細(xì)胞[27]。Runx2基因敲除小鼠出現(xiàn)顱骨發(fā)育，但過程延遲且縫合線未閉合。在實驗鼠額后縫中，間充質(zhì)在P7附近出現(xiàn)凝聚，間充質(zhì)細(xì)胞逐漸完成分化，軟骨細(xì)胞成熟，軟骨由軟骨內(nèi)成骨替代[28]。

在Runx2基因敲除小鼠中，額后縫未見軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，并且所有縫線中的細(xì)胞密度都較低。在野生型和Runx2基因敲除小鼠中，縫合細(xì)胞同時表達Sox9和Runx2。Sox9在野生型和Runx2基因敲除小鼠中的表達水平相似。但是，Runx2基因敲除小鼠縫合細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的Runx2-mRNA水平僅為野生型小鼠相應(yīng)水平的一半。而在顱骨縫合細(xì)胞中Runx2-mRNA的表達水平只有成骨細(xì)胞的1/3～1/2。與野生型小鼠相比，Runx2基因敲除小鼠的縫合細(xì)胞增殖降低并且Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信號通路基因的表達降低。而且這些基因的表達直接受Runx2的調(diào)控。然而，與野生型小鼠相比，這些基因以及Sp7、Col1a1和Bglap2在Runx2基因敲除小鼠顱骨組織中的表達卻沒有降低。說明縫線間充質(zhì)細(xì)胞的增殖及其向成骨細(xì)胞系細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，以及對hedgehog、Wnt、Fgf和Phhlh信號通路基因的誘導(dǎo)需要半數(shù)以上的Runx2劑量。然而，半劑量的Runx2足以使成骨細(xì)胞誘導(dǎo)這些信號通路基因Sp7和骨基質(zhì)基因的表達。Hedgehog激動劑、Wnt3a、Fgf2和Pthlh(1-34)可促進顱骨形成，拮抗劑能夠抑制骨形成以及縫合間充質(zhì)細(xì)胞的生長。因此Runx2通過增加Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信號通路基因的表達來誘導(dǎo)縫合間充質(zhì)細(xì)胞增殖并將其轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞系細(xì)胞。在這些信號通路中，F(xiàn)gf信號通路可能在間充質(zhì)細(xì)胞、骨祖細(xì)胞和成骨前細(xì)胞的增殖中起著最重要的作用[25，28]。

Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信號通路能夠誘導(dǎo)Runx2表達或激活Runx2。成骨細(xì)胞系細(xì)胞的生長與分化受Runx2和這些信號通路的影響，雖然Runx2蛋白的激活等機制已取得較為豐富的成果，但Runx2基因在軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞系細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控仍有待研究。對Runx2、Sp7和Hedgehog、Wnt、Fgf、Pthlh信號通路之間相互作用的研究將進一步揭示骨骼發(fā)育的整個過程。