顱縫早閉的分子機(jī)制及硬腦膜作用的研究進(jìn)展*

張司璽，曹志威，申 杰，張春陽

[1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；3.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科疾病研究所(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué))；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心]

嬰幼兒時期，顱骨成擴(kuò)張性生長的狀態(tài)以容納成長中的腦，這種生長主要發(fā)生在來源于未分化的間充質(zhì)細(xì)胞形成顱骨之間的窄縫，稱為顱縫[2]。在新生兒中，顱縫的存在使嬰兒的頭骨更容易通過產(chǎn)道，并在出生后允許顱骨在大腦發(fā)育過程中進(jìn)行代償性生長。當(dāng)一個或多個顱縫過早閉合時，顱骨形狀的繼發(fā)性變形是由于缺乏垂直于閉合顱縫的生長，以及未閉合顱縫的補(bǔ)償性過度生長所致[3]。研究表明[4]，顱縫早閉的患病率逐年上升，但無明顯原因。環(huán)境因素(如宮內(nèi)胎頭受限、胎位異常、羊水過少、產(chǎn)前暴露于致畸物質(zhì)、母親吸煙、丙戊酸和苯妥英等抗癲癇藥物)和基因(單基因突變、染色體異常和多基因突變)都可能是該病的易感因素。遺傳因素約占所有顱縫早閉的20 %，大多數(shù)與顱縫早閉相關(guān)的基因以常染色體顯性方式存在。

根據(jù)閉合顱縫的不同將顱縫早閉分為矢狀縫早閉(60 %)、冠狀縫早閉(23 %)、額縫早閉(15 %)、人字縫早閉(2 %)以及多條顱縫閉合的復(fù)雜性顱縫早閉[5]。此外，根據(jù)臨床表現(xiàn)顱縫早閉可以分為綜合征性的，例如Apert、Crouzon或Saethre-Chotzen綜合征，以及更常見的非綜合征性的顱縫早閉，例如舟狀頭畸形(矢狀縫早閉)、前部斜頭畸形(冠狀縫早閉)、后部斜頭畸形(單側(cè)人字縫早閉)、三角頭畸形(額縫早閉)、短頭畸形(雙側(cè)冠狀縫早閉)。而綜合征性顱縫早閉除顱骨畸形以外，還有軀體其它部位的畸形如Apert綜合征的并指畸形，Crouzon和Saethre-Chotzen綜合征的特殊面部畸形，甚至還會引起患兒的認(rèn)知功能發(fā)育障礙[2-3]。這些癥狀不僅威脅到患兒腦的正常發(fā)育，還對其身心健康發(fā)展造成長遠(yuǎn)影響。因此通過研究顱縫早閉分子機(jī)制為臨床治療手段提供新的思路，提高治愈率顯得尤為重要。

1 分子機(jī)制

顱縫早閉已被證明是由多種基因突變引起，包括：MSX2，F(xiàn)GFR1、2、3，TWIST1，TGFBR1、TGFBR2，ERF，纖維蛋白-1(FBN1)，EFNB1，EPHRINA4(EFNA4)，RAB23，Notch配體，JAGGED1，RECQL4，MASP1，SH3PXD2B，F(xiàn)REM1，ALX4，和SKI。其中最常見的突變基因是FGFR2，Twist1和EFNB1[6]。

1.1Twist1基因 Twist1主要表達(dá)于胚胎中胚層，在誘導(dǎo)細(xì)胞移動和組織塑形中起重要作用。人類Twist1的雜合突變導(dǎo)致綜合征型顱縫早閉—Saethre-Chotzen綜合征[7]。有研究表明冠狀縫位于神經(jīng)嵴來源的額骨和中胚層來源的頂骨之間，顱縫本身起源于中胚層，而Twist1突變小鼠胚胎顱縫堿性磷酸酶染色顯示，額骨和頂骨的成骨細(xì)胞與冠狀縫的非成骨細(xì)胞之間邊界的完整性喪失[6]。與此同時，在冠狀縫外的一層細(xì)胞中，ephrinA2、ephrinA4和EphA4的表達(dá)減少。Ephrins是與Eph受體相互作用的膜結(jié)合配體，Eph受體是一大類受體酪氨酸激酶。Ephrin-Eph信號調(diào)節(jié)多種發(fā)育過程，包括發(fā)育邊界的建立。因此在細(xì)胞中Twist1的控制下，ePhin信號作用于維持冠狀縫處的成骨-非成骨邊界，失去這一邊界的完整性會導(dǎo)致成骨細(xì)胞進(jìn)入顱縫，導(dǎo)致顱縫具有成骨特性，并最終導(dǎo)致顱縫的骨化。

1.2EFNB1基因 Ephin-B1由EFNB1基因編碼，屬于Eph受體(受體酪氨酸激酶)配體的B亞類。Eph/ephrin信號對胚胎的發(fā)育過程起到重要作用，包括骨骼和面顱的發(fā)育。X染色體連鎖的EFNB1基因雜合突變會導(dǎo)致一種特定的綜合征顱縫早閉-Craniofrontonasal syndrome(CFNS)[8]。有實(shí)驗(yàn)通過檢測小鼠Efnb1在胚胎期(E)9.5 d和10.5 d(額頂邊界建立的時間)的RNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)最頂端的Efnb1表達(dá)區(qū)域與神經(jīng)嵴起源的、未來的額骨區(qū)域和潛在的端腦小泡神經(jīng)上皮相對應(yīng)，但在形成頂骨的間充質(zhì)中缺失[9]。小鼠Efnb1在神經(jīng)嵴表達(dá)，但不在頭部中胚層表達(dá)。因此，在這些組織交界處形成的冠狀縫位于Efnb1表達(dá)的邊界。研究表明Eph受體和ephrins的表達(dá)是相互的，通過界面上的排斥性相互作用，組織細(xì)胞的定位和/或移動，包括限制遷移神經(jīng)嵴細(xì)胞(NCC)到胚胎的特定區(qū)域[10]。而通過對基因敲除(KO)Efnb1小鼠的分析發(fā)現(xiàn)不表達(dá)ePhin-B1的細(xì)胞出現(xiàn)同型細(xì)胞分類，形成異位組織邊界。綜上所述，EFNB1通過對特定細(xì)胞的分選對建立和維持顱縫邊界發(fā)揮作用，若該基因缺失會出現(xiàn)組織細(xì)胞混亂從而形成異常邊界導(dǎo)致顱縫早閉。

2 硬腦膜與顱縫早閉

大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床證據(jù)表明，硬腦膜影響上覆縫線復(fù)合體的生物學(xué)功能[11]。在動物模型中觀察到硬腦膜的骨誘導(dǎo)特性，其中顱蓋骨移植物的礦化和額后縫閉合取決于與完整硬腦膜的接觸。在臨床領(lǐng)域，顱縫早閉的患者僅拆除縫線往往會導(dǎo)致縫線的再骨化。目前，手術(shù)包括切除受影響的縫線和復(fù)雜的顱骨重塑過程，仍然是標(biāo)準(zhǔn)的治療方法[12]。然而，這些手術(shù)對嬰兒患者來說是生理上的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，而且切除的縫線極易復(fù)發(fā)。未來顱縫早閉微創(chuàng)療法的發(fā)展有賴于對顱縫生物學(xué)調(diào)控機(jī)制的透徹理解。因此了解硬腦膜對顱縫發(fā)育的影響機(jī)制對解決顱縫早閉這一難題尤為重要。

硬腦膜是硬腦膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的富含膠原骨架的纖維組織。胎兒和新生動物的未成熟硬腦膜似乎也含有成骨細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞亞群可以分化為成骨細(xì)胞，也可以通過旁分泌信號促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞分化。許多研究表明硬腦膜通過轉(zhuǎn)錄因子、激素和生長因子調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化來引導(dǎo)顱骨和顱縫的發(fā)育。其他研究也證明未成熟的硬腦膜細(xì)胞具有分化為成骨細(xì)胞的能力，從而產(chǎn)生骨基質(zhì)蛋白[13]。

2.1FGFR2基因 成纖維細(xì)胞生長因子受體2(FGFR2)是一種表達(dá)于縫隙間充質(zhì)﹑成骨前緣和硬腦膜的跨膜受體，在細(xì)胞遷移、血管生成、上皮間充質(zhì)相互作用以及骨的發(fā)育和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，已被證明在體內(nèi)和體外以旁分泌或自分泌的方式促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和骨形成。其突變與顱縫早閉的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。FGFR2中C278F或P253R突變分別導(dǎo)致Crouzon綜合征和Apert綜合征[14]。目前有實(shí)驗(yàn)通過將突變型FGFR2(C278F和P253R)構(gòu)建體亞克隆入腺病毒載體中，獲得重組腺病毒FGFR2，并將這些腺病毒轉(zhuǎn)染到硬腦膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞中[15]。發(fā)現(xiàn)直接轉(zhuǎn)染Crouzon(C278F-FGFR2)突變的成骨細(xì)胞顯示細(xì)胞增殖增加。直接轉(zhuǎn)染Apert(P253R-FGFR2)突變的成骨細(xì)胞顯示堿性磷酸酶活性增加。在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，與Crouzon轉(zhuǎn)染的硬腦膜細(xì)胞共培養(yǎng)的成骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖，而與Apert轉(zhuǎn)染的硬腦膜細(xì)胞共同培養(yǎng)的成骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的堿性磷酸酶活性。此外，成骨基因(堿性磷酸酶、骨橋蛋白和Runx2)的表達(dá)在成骨細(xì)胞與表達(dá)Apert的硬膜細(xì)胞共培養(yǎng)中上調(diào)。Crouzon(C278F-FGFR2)突變可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示硬腦膜可能通過增加縫隙間充質(zhì)中的成骨細(xì)胞數(shù)量來促進(jìn)Crouzon綜合征的縫線融合。而硬腦膜細(xì)胞中的Apert(P253R-FGFR2)突變增加了共培養(yǎng)中成骨細(xì)胞的成骨分化。綜上所述，硬腦膜細(xì)胞中的P253R-FGFR2和C278F-FGFR2突變都改變了正常的硬腦膜信號。這提示FGFR2突變可能部分通過結(jié)構(gòu)性突變誘導(dǎo)硬腦膜FGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強(qiáng)硬腦膜介導(dǎo)的成骨作用，從而誘導(dǎo)顱縫早閉。

2.2不同硬腦膜區(qū)域作用的差異性 顱縫包括額縫、矢狀縫、冠狀縫、人字縫和鱗狀縫。出生后額縫首先閉合，其次是人字縫，矢狀縫最晚閉合。因此猜測不同硬腦膜區(qū)域在促進(jìn)顱縫發(fā)育時具有時間和空間上的差異性。有實(shí)驗(yàn)通過在SD大鼠身上進(jìn)行自體移植手術(shù)，將額后縫和冠狀縫重新定位在非縫線、額后縫或冠狀縫相關(guān)的硬腦膜區(qū)域上：(1)原位(對照組)，(2)旋轉(zhuǎn)45°，(3)旋轉(zhuǎn)90°。手術(shù)在大鼠出生后第8 d，即大鼠額后縫閉合之前進(jìn)行[11]。術(shù)后1個月檢查不同的硬腦膜區(qū)域?qū)︻~后縫和冠狀縫通暢率、閉合率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組所有標(biāo)本都顯示正常縫線形態(tài)，額后縫閉合，冠狀縫保持通暢。額后縫的閉合遵循正常順序，從前到后，從顱內(nèi)到外顱的方向進(jìn)行。45°組覆蓋在非縫線硬腦膜上的額后縫顯示完全融合，但均薄于對照組，且獨(dú)特的顱骨內(nèi)脊也明顯變鈍。旋轉(zhuǎn)的冠狀縫仍然開放。90°旋轉(zhuǎn)組覆蓋在冠狀縫相關(guān)硬腦膜上的額后縫均閉合，但其形態(tài)明顯比對照組薄。旋轉(zhuǎn)的左冠狀縫線覆蓋在與額后縫相關(guān)的硬腦膜上，均被發(fā)現(xiàn)是開放的，然而這些冠狀縫采用了額后縫的形態(tài)。同時有證據(jù)證明與移植的成人硬腦膜相比，移植的未成熟硬腦膜可以誘導(dǎo)顱骨缺損的骨再生?？p線下局部硬腦膜的操作被證明可以誘導(dǎo)或阻止顱縫融合[16]。這些研究表明，來自硬腦膜不同區(qū)域的細(xì)胞行為不同，其中一個區(qū)域可能促進(jìn)成骨和顱縫融合，而另一個區(qū)域則維持顱縫通暢。此外，硬腦膜的同一區(qū)域可能會隨著時間的推移而改變，在發(fā)育早期保持縫線通暢，并在面顱骨成熟時允許縫線閉合。因此，硬腦膜細(xì)胞可能包含具有促成骨能力的細(xì)胞和被編程為抑制成骨和顱縫閉合的細(xì)胞。

3 總結(jié)

顱縫早閉，尤其是綜合征型，通常與認(rèn)知發(fā)育受損的較高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。這是由于大腦生長受限，以及過度生長的縫線和增加的顱內(nèi)壓導(dǎo)致腦組織繼發(fā)變形所致。因此了解該疾病的患病機(jī)制對提高患兒治愈率及降低致畸致殘率具有重要意義。顱縫早閉的致病原因中，基因突變大約占20 %。例如：(1)FGFR2突變增強(qiáng)顱縫間充質(zhì)細(xì)胞的成骨活性，從而使顱縫過早閉合；(2)Twist1和EFNB1突變破壞顱縫與周圍組織的成骨-非成骨邊界的完整性或形成異常的成骨-非成骨邊界，導(dǎo)致成骨細(xì)胞進(jìn)入顱縫內(nèi)并激活其內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞的成骨活性，最終導(dǎo)致顱縫骨化。此外硬腦膜通過分泌一些可溶性因子來控制顱縫的生長發(fā)育。目前治療手段多是手術(shù)切除早閉的顱縫并人造縫線，但其中一部分患者會復(fù)發(fā)，給患者和家庭帶來嚴(yán)重的痛苦和負(fù)擔(dān)。因此可以考慮在手術(shù)中補(bǔ)充一些外源性因子或利用細(xì)胞工程，在縫線處調(diào)控顱縫的閉合進(jìn)程，進(jìn)而防止顱骨畸形的產(chǎn)生。

顱縫早閉綜合征的特征相互重疊，即使在同一綜合征中也存在表型異質(zhì)性，尤其是在Muenke綜合征的情況下，臨床評估不足會導(dǎo)致誤診，而分子檢測有助診斷。在有FGFR2、Twist1和EFNB1基因突變的兒童中，67 %的兒童需要重復(fù)面顱外科手術(shù)，而在染色體異?；驔]有基因診斷的患者中，只有6.25 %的患者接受或計(jì)劃再次手術(shù)。僅靠臨床表現(xiàn)來診斷顱縫早閉往往會出現(xiàn)誤診，例如最初診斷為Pfeiffer綜合征的患者，通過基因診斷實(shí)為Twist1基因突變導(dǎo)致的Saethre-Chotzen綜合征；最初診斷為Apert綜合征的患者，通過基因檢測后糾正為EFNB1基因突變導(dǎo)致的CFNS綜合征[17]。因此通過分子檢測建立完善的基因型-表型相關(guān)性分析，對不同類型顱縫早閉的鑒別診斷具有重要意義,達(dá)到早診斷早治療的目的。

鑒于顱縫早閉是一種由多因素相互作用導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病，其診斷﹑評估﹑治療及康復(fù)是一漫長而艱難的過程。因此對顱縫早閉患者的臨床評估和描述應(yīng)由包括分子遺傳學(xué)家在內(nèi)的專門醫(yī)療團(tuán)隊(duì)進(jìn)行，徹底的臨床評估可以指導(dǎo)分子檢測，從而全方位的提高患者的生存質(zhì)量。