五倍子鞣質在豬體內的藥代動力學研究

王慶容　徐曉舒　王林先

摘要：研究中草藥復合飼料中五倍子鞣質在豬體內的藥代動力學特征和殘留規(guī)律，以期進行更加有效的疾病防治和得出明確的禁藥期。采用含有五倍子的中草藥復合飼料1和復合飼料2飼喂豬，分別于0、4、8、12、24、48、96 h后取血液、肝臟、腎臟、胃、小腸、腦等組織，用高效液相色譜檢測各組織中沒食子酸的含量。在豬的血液、肝臟、腎臟、胃、小腸、腦等組織中，4、8、12、24、48 h后均檢測到了沒食子酸，但在96 h后幾乎檢測不到沒食子酸，結果表明，沒食子酸在96 h后已基本代謝完畢。

關鍵詞：沒食子酸;高效液相色譜;藥代動力學

中圖分類號： R285? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0138-05

五倍子是我國傳統(tǒng)的中藥，其有效成分能凝固微生物體內的原生質及多種酶，具有抗菌、抗病毒、清除自由基和抗氧化等作用。五倍子作為傳統(tǒng)中藥，有解毒、止血、斂瘡、澀腸、斂肺、止汗之功效;按其藥理還有抑突變、癌化學預防等作用[1]。五倍子在我國四川、貴州、陜西、云南、湖南、湖北6省產量較高，占全國總產量的90%以上，另外，河南、甘肅、廣東、浙江、安徽、福建、江西、山西等地亦產[2]。

鞣質為五倍子的主要成分，含量可達60%～70%，它是葡萄糖上的羥基與沒食子酸所形成的酯類化合物的混合物[3]。鞣質是一類混合物，在酸性條件下，鞣質可水解成沒食子酸，兩者成正比關系，通過測定其中的沒食子酸含量，可反映鞣質的多少[4]。沒食子酸是白色或微黃色針狀晶體，常溫時（25 ℃）微溶于水，易溶于沸水、乙醚、丙酮等，不溶于三氯甲烷、苯等有機溶劑[5]。沒食子酸具有強還原性，遇空氣中的氧變成褐色，還可與蛋白質、凝膠、重金屬、生物堿等結合。它是植物體中一類次生代謝產物，以游離酸或形成酯類化合物的形式存在于五倍子、茶、沒食子等植物中，屬于低毒物質。經由沒食子酸生成的沒食子酸丙酯、次沒食子酸鉍等多種衍生物，可用于食品、制藥及輕工行業(yè)[6]。

在檢測藥物含量的眾多方法中，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）是有效的方法之一，它具有簡便、快速、靈敏度高、專一性強和重復性好的優(yōu)點，應用非常廣泛。因此，利用高效液相色譜法對豬各組織中不同時段沒食子酸含量進行檢測，觀察其代謝動態(tài)變化過程，可以為養(yǎng)殖業(yè)以及中草藥復合飼料的生產、安全使用和推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將黃連、五倍子、姜、石菖蒲、紫蘇、連翹、黃芩等中草藥按一定比例混合，按1%的質量分數(shù)添加到普通飼料中混合成中草藥復合飼料1（用F1表示），按2%的比例添加到普通飼料中混合成中草藥復合飼料2（用F2表示），于2016年春季在遵義市沙灣鎮(zhèn)尚窩溝養(yǎng)殖場選擇30頭質量約為50 kg的（長白）豬，隨機分為2組，先用普通飼料飼喂15 d。禁食 12 h，不禁水。之后分別飼喂中草藥復合飼料1和中草藥復合飼料2各1次，在此期間禁食不禁水。24 h后全部轉為飼喂普通飼料。從飼喂復合飼料開始，分別于0、4、8、12、24、48、96 h后每組隨機選擇1頭豬屠殺，取血液、肝臟、腎臟、胃、小腸、腦等組織，放入液氮中運回實驗室，保存在-80 ℃的冰箱中備用。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：島津高效液相色譜儀（LC-20A）、恒溫柱箱、自動進樣器、超聲波清洗機（SB-120D，寧波新芝生物科技股份有限公司）、AR2224CN電子分析天平、循環(huán)水真空泵（SH2-ⅢD，上海亞榮生化儀器廠）、旋轉蒸發(fā)儀（RE52CS-1，上海亞榮生化儀器廠）、容量瓶、微量移液器、研缽、0.22 μm 濾膜。主要試劑：甲醇（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）、乙醚、沒食子酸標準品（南通飛宇生物制備，供含量測定用）、純水和超純水（密理博超純水器）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 根據(jù)盛達成等的色譜條件進行改良[7]，將有機相換為甲醇，流動相設為甲醇、水（體積比為80 ∶ 20）。色譜柱為InertSustain C18/phenvlhexvl柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），檢測波長為254 nm，泵A流速為0.20 mL/min，泵B流速為 0.80 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣體積為20 μL。

1.3.2 樣品的制備 分別稱取各個組織2 mg，加入20 mL甲醇和1 mL乙醚充分研磨后，浸泡2 h，超聲抽提30 min[8]，最后將研磨液于12 000 r/min離心15 min，離心后吸取上清液，即得樣品，將提取好的樣品放入4 ℃冰箱保存，待測。

1.3.3 標準品的制備 標準品的制備參照杜瑞蓮等的方法[4]，稱取沒食子酸標準品4.15 mg于20 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解稀釋并定容，搖勻，配制成濃度為215 μg/mL的沒食子酸母液，放置在4 ℃冰箱中待用。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制備

吸取濃度為215 μg/mL的標準品溶液0.6、1.2、2.4、5.0、7.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋定容，得到濃度分別為12.9、25.8、51.6、107.5、150.5 μg/mL的標準液，用HPLC法進行檢測分析。以峰面積（y）對濃度（x）進行統(tǒng)計回歸，得到回歸方程為y=315 527x-2 923 157，r2=0.999，RSD（相對標準偏差，relative standard deviation）=082%（n=5），沒食子酸在12.0～200.0 μg/mL范圍內線性關系良好，詳見圖1。

2.2 樣品檢測的色譜圖

將制備好的各個樣品溶液，經0.22 μm的微孔濾膜過濾到進樣瓶中，按上述“1.3.1”節(jié)的色譜條件用HPLC法進行檢測分析，得出各組織中沒食子酸的峰分離情況良好，各個組織中五倍子鞣質保留時間均為10～12 min，與沒食子酸標準品曲線的保留時間大致相同，符合定性分析的要求，所以用高效液相色譜法能夠準確地測出豬體內五倍子鞣質的含量。用上述試驗過程對各組織進行處理，重復測定3次，流動相色譜峰的峰形及結果的重現(xiàn)性均很好，RSD值均不超過5%，符合沒食子酸代謝的特點，在不同組織中的代謝色譜結果見圖2。將3次測定的各圖峰面積平均值代入回歸方程中，得到沒食子酸的含量見表1、表2。

2.2.1 沒食子酸在不同組織中的代謝狀況 0 h時，各個組織中都沒有檢測到沒食子酸，說明普通飼料中沒有沒食子酸或含有能分解沒食子酸的物質。在血液中，4～12 h后沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時達到吸收高峰，48 h后血液中沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在肝臟中，4～8 h 后沒食子酸的含量逐漸增多，8 h時達到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在胃中，4～8 h后沒食子酸的含量逐漸增多，8 h時達到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在腎臟中，4～12 h后沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時達到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在小腸中，4～12 h時腸壁中沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時達到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在腦中，4～12 h 時沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時達到吸收高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到（圖3-A）。在96 h后，各組織中幾乎檢測不到沒食子酸，說明此時沒食子酸在豬體內基本代謝完畢。比較圖3-A和3-B，沒食子酸的代謝曲線基本一致，說明豬對沒食子酸的吸收是比較恒定的，與飼料中沒食子酸含量不成正比關系，飼料中過多的沒食子酸可能隨糞便或尿液排出體外，但本研究沒有對糞便或尿液進行沒食子酸含量的檢測。

2.2.2 沒食子酸在不同時段的代謝狀況 沒食子酸在豬體內不同時段的代謝狀況如下：在4～12 h時，在肝臟中的含量最高，在血液中的含量最低;在24 h時，F(xiàn)1在肝臟中的含量最高，F(xiàn)2在腎臟中的含量最高，血液中的含量最低;在48 h時，在腎臟中的含量最高，血液中的含量最低（圖4-A和4-B）。

3 討論

3.1 沒食子酸在不同組織中的代謝狀況

在血液、腎臟、腸壁、腦中，4～12 h后沒食子酸的含量逐漸增多，在12 h時達到吸收的高峰，48 h后血液中沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到;在肝臟和胃中，4～8 h沒食子酸的含量逐漸增多，8 h時達到高峰，48 h后沒食子酸的含量變得很低，96 h后未檢測到，詳見圖3-A和3-B。在96 h時，幾乎檢測不到沒食子酸，說明此時沒食子酸在豬體內基本代謝完畢。

3.2 沒食子酸在不同時段中的代謝狀況

在4、8、12 h時，沒食子酸在肝臟中的含量最高，在血液中的含量最低。在24 h時，F(xiàn)1在肝臟中的含量最高，在血液中的含量最低;F2在腎臟中的含量最高，在血液中的含量最低。在48 h時，沒食子酸在腎臟中的含量最高，在血液中的含量最低，此時沒食子酸在腎臟中的含量最高是因為沒有代謝完的沒食子酸要通過腎臟排出體外，詳見圖4-A和4-B。

綜上所述，豬在飼喂F1和F2飼料后，沒食子酸在血液中的含量最少，可能是因為沒食子酸微溶于水，難于被吸收進入血液中。金石等分析大鼠血漿中兒茶素主要代謝產物沒食子酸含量，認為茶多酚中兒茶素在血漿中僅有少量的代謝產物沒食子酸，可能由于兒茶素極性極強，水溶性高，難于被吸收進入血液，因此代謝產物也比較少[9]，本研究結果與之相似。

4 結論

中草藥具有天然、高效、毒副作用少、資源豐富等優(yōu)點，含有與動物免疫功能密切相關的生物堿、多糖、皂苷、蒽醌類、揮發(fā)油和有機酸等[10]。五倍子是具有很高的實用價值和經濟價值的林產品，它是產生單寧酸、沒食子酸、焦性沒食子酸、藥用鞣質等一系列化工產品的主要原料。這些化工原料用在醫(yī)藥工業(yè)中， 能夠生產多種藥物。鞣質具有與抗菌素相等的抑制細菌的作用，同蛋白質絡合能制成鞣酸蛋白，治療腸道急性病癥[11]。在飼喂中草藥復合飼料4、8、12、24、48 h時，都檢測到了五倍子鞣質;在96 h時，幾乎檢測不到沒食子酸，說明此時沒食子酸在豬的體內已經代謝完畢，試驗結果表明，禁藥期是96 h。

通過飼喂中草藥復合飼料后，在豬的各個器官中都檢測到了沒食子酸，其中肝臟中含量最高。肝臟除了分泌膽汁、儲存動物淀粉、調節(jié)蛋白、脂肪和碳水化合物的新陳代謝以外，還有解毒、造血和凝血的作用，肝臟還是最大的解毒器官，而五倍子也有解毒、止血的功效，這就增大了肝臟解毒功效，使豬的抵抗力提高，從而有效防止疾病的發(fā)生。而在我國五倍子分布較廣，原料豐富，容易獲得，這無疑為養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的便利。

影響五倍子鞣質被豬體內組織吸收的因素還有很多，如能吃多少飼料、豬的體質及其代謝速率情況、水的pH值、操作過程和藥品、試驗儀器誤差等皆是影響本試驗結果的因素，給本試驗帶來極大的困難，進一步的成分系統(tǒng)分析鑒定和比較有待深入進行。

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