達(dá)氏鲌不同地理種群線粒體COⅠ基因遺傳多態(tài)性的研究

謝佳燕　顏淵　楊鈺慧

摘要：采用線粒體COⅠ基因序列對我國長江中下游達(dá)氏鲌?zhí)烊环N群的遺傳變異進(jìn)行研究。結(jié)果表明，達(dá)氏鲌不同自然種群的遺傳變異程度較低，基因多態(tài)性為0.412 3，核苷酸多態(tài)性為0.001 1。各群體間特有單倍型較少，多數(shù)個體分布于共享單倍型中。分子變異分析（AMOVA）表明，達(dá)氏鲌野生群體間具有明顯的遺傳分化，群體間的變異為33.09%，丹江口種群解釋了群體間該遺傳變異組成的71.47%，其余的達(dá)氏鲌群體間無明顯分化，種群間存在一定的基因流動。達(dá)氏鲌自然種群的遺傳組成可能與不同群體所處的地理位置有關(guān)，水系間的相互連通，不同地理種群間存在基因交流，可能減弱了由地理距離產(chǎn)生的種群間的遺傳差異。

關(guān)鍵詞：達(dá)氏鲌（Chanodichthys dabryi）;COⅠ基因;自然種群;遺傳差異

中圖分類號： S917? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0037-03

達(dá)氏鲌（Chanodichthys dabryi）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae），在我國廣泛分布于江河、湖泊、水庫等水系，是我國內(nèi)陸天然水體中重要的經(jīng)濟(jì)魚類[1]。達(dá)氏鲌是長江中下游湖泊魚類群落的優(yōu)勢物種之一，其個體較大、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，富含多種氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[2]。此外，達(dá)氏鲌等鲌屬魚類還具有重要的生態(tài)價(jià)值，可通過捕食水體中的小型魚類，控制它們的種群密度，從而保持水體生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[1]，因而對于提高水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益具有不可忽視的作用。然而，由于過度捕撈和環(huán)境污染，自然水體中鲌屬魚類資源急劇衰退。為彌補(bǔ)天然資源的不足和滿足市場需求，已對該屬魚種的人工繁育進(jìn)行了相應(yīng)的研究[3]。但人工養(yǎng)殖時(shí)近親繁殖概率增高及生態(tài)環(huán)境單一等因素，可導(dǎo)致物種遺傳多樣性降低甚至種質(zhì)退化[4-5]。另外，由于養(yǎng)殖品種的逃逸，還可通過雜交、競爭和污染影響自然水域中的野生種群[6]，最終對該魚種整體遺傳多樣性水平產(chǎn)生影響。水產(chǎn)原種、良種是重要的水產(chǎn)種質(zhì)資源，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和水產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的首要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，對物種天然種群進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性評估，對促進(jìn)魚種的研發(fā)和可持續(xù)利用具有重要的實(shí)踐意義。

長江是我國重要的天然淡水魚類種質(zhì)資源基因庫[7]，達(dá)氏鲌是長江流域中重要的經(jīng)濟(jì)魚類和優(yōu)質(zhì)魚種，其生物學(xué)特性、種群遺傳多樣性等方面已有相應(yīng)的研究[8-9]，但基于 COⅠ 基因序列進(jìn)行不同達(dá)氏鲌自然種群間遺傳組成和鑒定方面的研究較少[8]。因此，本研究對我國長江中下游流域不同達(dá)氏鲌種群進(jìn)行COⅠ基因序列5′端測序，檢測不同水域達(dá)氏鲌種群間的遺傳組成和遺傳關(guān)系，以期為我國經(jīng)濟(jì)魚類種質(zhì)資源的保護(hù)和可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗(yàn)中達(dá)氏鲌樣本于2011年5—12月分別采自于長江中下游流域的湖北省當(dāng)陽市（DY）、湖北省東湖（DH）、湖北省丹江口市（DJ）、江西省宜春市（JX）和安徽省黃山市（AH）。標(biāo)本取肌肉樣于95%乙醇中固定，-20 ℃保存。

1.2 樣本DNA的提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)及測序

采用標(biāo)準(zhǔn)的酚/三氯甲烷法提取達(dá)氏鲌基因組DNA[10]，利用引物FishF1/FishR2擴(kuò)增COⅠ基因序列[11]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min; 94 ℃ 50 s，52 ℃ 1.0 min，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10.0 min。采用Qiagen的QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收純化，在ABI 377 DNA測序儀上利用擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX1.83[12]和Seaview[13]軟件進(jìn)行COⅠ基因片段核苷酸組成和序列分析。從GenBank下載翹嘴鲌（Chanodichthys alburnus，序列號AP012109、GU190362、KF039719、KM044500、KX244761、KX244762、KX829025-KX829028），蒙古鲌（C. mongolicus，序列號KF826087、NC_008683、KC701385、AP009060）、海南鲌（C. recurviceps，序列號KJ609181、NC_024277），擬尖頭鲌（C. oxycephaloides，序列號KY404014），以及鯉屬鯉（Cyprinus carpio，序列號KJ511883）和東方高原鰍（Triplophysa orientalis，序列號KJ631323）的線粒體DNA全序列，與其他鲌屬魚類的DNA序列進(jìn)行比對，識別COⅠ序列并進(jìn)行不同魚種的比較分析。以Kimura雙參數(shù)法（Kimura-2-parameter）為替代模型，采用MEGA 6.0軟件[14]中的NJ法（neighbour-joining）構(gòu)建不同物種間的聚類樹，分支的置信度采用自引導(dǎo)法（bootstrap analysis）重復(fù)檢測1 000次。用Arlequin 3.5[15]進(jìn)行遺傳多樣性、群體的分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）、遺傳分化指數(shù)（Fst）和基因流（Nm）值的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 達(dá)氏鲌COⅠ基因片段核苷酸組成特點(diǎn)及單倍型組成

對不同種群達(dá)氏鲌的線粒體COⅠ序列進(jìn)行排列和比對，獲得COⅠ基因5′端長度為648 bp的同源序列，無插入或堿基缺失。該序列中相對堿基頻率分別為A=0.259 3，T=0.284 2，G=0.182 3，C=0.274 1，堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性，但堿基組成在達(dá)氏鲌不同種群間無明顯差異。在達(dá)氏鲌COⅠ基因序列的所有位點(diǎn)中，共發(fā)現(xiàn)4個堿基變異位點(diǎn)，其中，3個位點(diǎn)發(fā)生了堿基轉(zhuǎn)換，1個位點(diǎn)發(fā)生顛換，但翻譯后所有氨基酸組成均相同，表明COⅠ基因編碼在達(dá)氏鲌魚類中的保守性。這些變異共組成了5種單倍型，各單倍型在達(dá)氏鲌種群間的分布見表1。除單倍型1和3在超過2個種群間共享外，其余單倍型均為單個種群所特有。

2.2 不同達(dá)氏鲌種群的遺傳多態(tài)性

對達(dá)氏鲌不同地理種群的遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測，由表2可知，所有達(dá)氏鲌個體的基因多態(tài)性（H）為0.412 3，核苷酸多態(tài)性（π）為0.001 1。不同種群間遺傳多態(tài)性存在一定差異，種群間的基因多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性最高為東湖種群（DH），而丹江口（DJ）和宜春（JX）種群僅有一種單倍型，遺傳多樣性指數(shù)值均為0。

2.3 達(dá)氏鲌種群的遺傳結(jié)構(gòu)與分化

對達(dá)氏鲌兩兩種群之間的FST值和基因流Nm值進(jìn)行檢測，由表3可知，成對FST值大小變化在-0.074 5～1.000 0之間，其基因流大小變化于0～4.282 4之間。統(tǒng)計(jì)分析表明，除DJ群體與其他群體間的FST值存在顯著差異外（P<005），其余的群體間無明顯差異，種群間存在一定的基因流動。

對達(dá)氏鲌不同種群進(jìn)行了分子變異分析，結(jié)果表明，遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)為66.91%，而不同種群間為 33.09%，不同種群間存在明顯的分化。根據(jù)FST的結(jié)果，將所有種群分為兩組（DJ種群及其余的所有種群）進(jìn)行AMOVA分析。結(jié)果表明，DJ種群解釋了2組類群間遺傳變異組成的71.47%。

基于Kimura雙參數(shù)法，從NCBI下載鲌屬其他4種魚類的COⅠ序列進(jìn)行比對，計(jì)算鲌屬不同魚類的種內(nèi)和種間遺傳距離。結(jié)果表明，鲌屬不同魚類種內(nèi)平均遺傳距離為 0.002 8，種間遺傳距離平均值為0.038 8，種間遺傳距離>10倍的種內(nèi)遺傳距離。以鯉屬鯉（Cyprinus carpio，序列號KJ511883）和東方高原鰍（Triplophysa orientalis，序列號KJ631323）的線粒體COⅠ序列作為外群，構(gòu)建NJ聚類樹（圖1）。結(jié)果表明，鲌屬魚類聚成獨(dú)立的一支，之后又形成分屬于鲌屬不同魚種的分支，分支間的節(jié)點(diǎn)支持率較高。其中，達(dá)氏鲌的所有單倍型聚成獨(dú)立的一支，但并未形成以地理類群進(jìn)行聚類的分支。

3 討論

鲌屬魚類是東亞特有鯉科魚類中較為重要的類群[1]，其經(jīng)歷了相同的短時(shí)間物種暴發(fā)，作為一群快速分化的物種，其基因序列的變異度相對較小[16]。因此，對該經(jīng)濟(jì)魚類的有效鑒定，對長江流域天然淡水魚類種質(zhì)資源基因庫的保護(hù)具有重要的實(shí)踐意義。許多研究已表明，COⅠ基因片段可作為動物條形碼識別外形相似種和檢測種群遺傳多樣性[17-19]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，鲌屬魚類COⅠ基因片段的種間遺傳距離與種內(nèi)距離相差10倍以上，NJ聚類樹也表明鲌屬魚類聚成獨(dú)立的一支，聚類分支間鲌屬不同物種的分類與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果基本一致，從而揭示COⅠ基因序列適于物種鑒定的內(nèi)在特征[17，20]，這與利用COⅠ基因中更長的序列片段對鲌屬魚類進(jìn)行有效區(qū)分的結(jié)論一致[8]。

遺傳多樣性是種群極為重要的特征之一，它是物種適應(yīng)未來環(huán)境的變化所必需[21]。對不同達(dá)氏鲌地理種群的研究表明，其野外種群的遺傳變異程度較低，各群體間特有單倍型較少，多數(shù)個體分布于共享單倍型中。這與采用COⅡ基因序列分析鲌屬翹嘴鲌野生群體的結(jié)果類似[22]。這可能與近年來長江流域環(huán)境污染日益嚴(yán)重，梯級水利設(shè)施的大規(guī)模構(gòu)建和過度捕撈等因素有關(guān)，從而導(dǎo)致自然水體中的魚類資源急劇衰退，天然種群的遺傳多樣性水平降低。由于人工繁殖所用親本首要來源于部分的野生群體，而經(jīng)過人工繁育后，群體的遺傳多樣性會出現(xiàn)一定程度的下降[4]。因此，在實(shí)際育種工作中，為確保育種對象的遺傳多樣性維持在一定水平，以順利實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)，應(yīng)適當(dāng)增加育種群體的親本數(shù)量，引進(jìn)更多的地理群體。

根據(jù)化石記錄地質(zhì)年代和地理分布，鯉科魚類可劃分為5個類群，鲌亞科魚類分屬東亞類群[1]。一些研究認(rèn)為，東亞類群是青藏高原急劇隆升后， 在東亞季風(fēng)氣候條件下鯉科魚

類在江湖復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)中的大量分化[16]。對達(dá)氏鲌野生群體的研究表明，所有群體顯示出群體間明顯的遺傳分化。但群體間兩兩比較FST值和AMOVA分析后表明，除丹江口群體外，其余的群體間無明顯分化，種群間存在一定的基因流，不同群體間具有共享單倍型。地理隔離、棲息地差異、遷移、人類活動等因素均可能導(dǎo)致群體間出現(xiàn)較大的遺傳分化[23]，因而下游魚類的群落和豐富度對上游及支流魚類的分布和遷徙起到重要的作用[24]。達(dá)氏鲌自然種群的遺傳組成可能與不同群體間的地理位置有關(guān)。除丹江口群體外的其他達(dá)氏鲌群體依次分布在長江中下游水系，水系間相互連通，可促進(jìn)不同種群間的基因交流，群體間單倍型共享，可能削弱了地理距離產(chǎn)生的種群間的遺傳差異。而丹江口群體位于長江支流的漢江水系上游，該群體可能受到水利工程、水質(zhì)污染的影響而阻礙了支流上游群體向長江干流中下游的遷移，從而阻礙了其與中下游其他群體間的基因交流。丹江口大壩建成40年后對漢江中下游經(jīng)濟(jì)魚類早期資源進(jìn)行調(diào)查，也發(fā)現(xiàn)了漢江中下游經(jīng)濟(jì)魚類卵苗徑流量明顯下降，產(chǎn)卵場數(shù)量減少[25-26]，但對于丹江口群體的遺傳差異仍需要進(jìn)一步深入研究。

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