長鏈非編碼RNA編碼肽在腫瘤中的作用機(jī)制

孟一妹，蔣 晶，王禹涵，孟一姊，閆 昱，李佩玲

長鏈非編碼RNA(lncRNA)長度一般超過200個核苷酸，既往學(xué)者認(rèn)為其缺乏開放的讀碼框架，故不具備蛋白質(zhì)編碼功能[1]。lncRNA在多個層面上參與基因的表達(dá)及調(diào)控，在多種腫瘤中呈異常表達(dá)并且與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的短開放閱讀框(sORF)可以編碼功能肽，lncRNA可以有一個或多個sORF，能夠被翻譯成<100個氨基酸長的小肽，只是一般基因注釋流程都默認(rèn)過濾掉100個氨基酸以下的肽，認(rèn)為這些是假陽性的結(jié)果[3]，故一直以來都被忽略。隨著新一代測序技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)的提高，人們才發(fā)現(xiàn)這些非編碼RNA分子其實也是普遍翻譯的，從而打開了lncRNA編碼肽的研究大門[4-5]。lncRNA編碼肽被證實在細(xì)胞分裂、鈣及線粒體代謝和毒素降解中發(fā)揮重要作用，并且在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中有潛在應(yīng)用前景[6-11]。本文就lncRNA編碼肽在腫瘤中的作用機(jī)制作一綜述如下。

1 lncRNA編碼肽與結(jié)腸癌

結(jié)腸癌是常見消化系統(tǒng)腫瘤之一。在美國，結(jié)腸癌是僅次于肺癌的第二大死因[12]。有學(xué)者利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及微陣列數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，HOXB-AS3 RNA在結(jié)腸癌組織中下調(diào)；通過核糖體分析顯示HOXB-AS3 RNA與核糖體結(jié)合具有翻譯可能性，lncRNA HOXB-AS3包含一個159 nt的sORF，該sORF可編碼一個53 aa肽；通過構(gòu)建sORF的標(biāo)簽載體，體內(nèi)外等一系列實驗顯示，HOXB-AS3小肽而不是lncRNA發(fā)揮著功能，HOXB-AS3小肽能夠抑制結(jié)腸癌的進(jìn)展；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與HOXB-AS3小肽相互作用的蛋白與RNA剪切相關(guān)；其進(jìn)一步挑選了剪切抑制因子hnRNPA1作為研究對象，實驗得出在腫瘤細(xì)胞中，HOXB-AS3小肽的表達(dá)缺失使PKM基因的剪切形式為保留10號外顯子，而非9號外顯子，從而介導(dǎo)PKM2剪切體形成，抑制PKM1剪切體形成，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解，促使結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展[13]?？傊?，HOXB-AS3多肽低表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后差密切相關(guān)，可以作為結(jié)腸癌的預(yù)后標(biāo)志物。

隨后上述團(tuán)隊陸續(xù)發(fā)現(xiàn)2個可編碼肽的lncRNA。第1個是lncRNA LOC90024[14]。通過上述實驗方法證實lncRNA LOC90024可編碼一個130 aa的小肽；通過質(zhì)譜檢測及對小肽的進(jìn)一步功能分析證實，該小肽是人體細(xì)胞和組織中自然產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)，且是小肽而不是lncRNA LOC90024本身促使了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移。隨后其通過蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)等證實此小肽主要與mRNA剪切調(diào)控分子相互作用，于是將此小肽命名為剪切分子調(diào)控小蛋白SRSP，SRSP與剪接因子SRSF3相互作用。他們進(jìn)一步實驗證實SRSP增強(qiáng)了SRSF3與轉(zhuǎn)錄因子Sp4 pre-mRNA 外顯子3的結(jié)合，介導(dǎo)外顯子3的包含，從而促使長的Sp4剪切體(L-Sp4)產(chǎn)生，抑制短的Sp4剪切體(S-Sp4)產(chǎn)生。該團(tuán)隊在Sp4-KD型結(jié)腸癌細(xì)胞中恢復(fù)了L-Sp4或S-Sp4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)L-Sp4刺激腫瘤的發(fā)生。綜上所述，lncRNA LOC90024編碼一個小蛋白SRSP，調(diào)控Sp4剪接和結(jié)腸癌的發(fā)生，SRSP可作為一種新的結(jié)腸癌預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。

m6A是最普遍的真核RNA修飾。RNA m6A修飾的生物學(xué)重要性依賴于m6A結(jié)合蛋白(即m6A讀卡器)，通過調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性、翻譯、剪接、結(jié)構(gòu)、衰老和亞細(xì)胞定位來控制mRNA的命運(yùn)[15-18]。上述團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)的第2個可編碼肽的lncRNA是LINC00266-1[19]。LINC00266-1編碼一個71個氨基酸的多肽，通過質(zhì)譜分析等發(fā)現(xiàn)此多肽主要與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，故將其命名為RNA結(jié)合調(diào)節(jié)多肽(RBRP)。RBRP為內(nèi)源性產(chǎn)生的多肽，表達(dá)上調(diào)與結(jié)腸癌的惡性表型和臨床預(yù)后差密切相關(guān)。通過組學(xué)分析、免疫共沉淀及功能實驗等發(fā)現(xiàn)RBRP與RNA m6A讀碼器IGF2BP1相互作用。既往研究表明C-Myc是最重要的致癌基因之一[20]，RBRP作為m6A讀碼器的調(diào)節(jié)亞基，通過m6A讀碼器IGF2BP1增強(qiáng)m6A對C-Myc mRNA的識別，增加C-Myc mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。綜上所述，LINC00266-1實際上編碼了一種未標(biāo)記的肽RBRP，該肽在腫瘤發(fā)生過程中具有促進(jìn)作用，這一發(fā)現(xiàn)突出了靶向RBRP治療癌癥的潛力。

2 lncRNA編碼肽與乳腺癌

三陰性乳腺癌不表達(dá)3種最常見乳腺癌標(biāo)志物，是最具侵襲性乳腺癌亞型，預(yù)后較差，總生存期較短[21]。有學(xué)者從TCGA數(shù)據(jù)庫中識別出三陰性乳腺癌特異性lncRNA，并使用GWIPS-viz數(shù)據(jù)集等發(fā)現(xiàn)具有編碼潛力的LINC00908；通過免疫熒光、Western blot和多聚體分析實驗等驗證了LINC00908可編碼一個60個氨基酸名為ASRPS的多肽，且在三陰性乳腺癌細(xì)胞株中ASRPS呈低表達(dá);體外實驗證實LINC00908可通過ASRPS抑制三陰性乳腺癌腫瘤生長;Log-rank檢驗和Kaplan-meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)ASRPS低表達(dá)的三陰性乳腺癌患者總生存期短于ASRPS高表達(dá)的三陰性乳腺癌患者；熒光素酶報告基因、序列缺失和CHIP實驗等發(fā)現(xiàn)ERα直接調(diào)控LINC00908轉(zhuǎn)錄；進(jìn)一步通過COIP、免疫組織化學(xué)及使用CRISPR/cas9介導(dǎo)的同源重組等技術(shù)研究得出ASRPS直接與STAT3結(jié)合，下調(diào)STAT3磷酸化，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)降低；最后在小鼠模型中，再次證實ASRPS高表達(dá)減少血管生成，抑制腫瘤生長[22]?？傊琇INC00908編碼的多肽ASRPS是三陰性乳腺癌特異性治療靶點。

隨后該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)一個可編碼肽的lncRNA[23]。LINC00665可編碼一個55個氨基酸的內(nèi)源性表達(dá)小肽，并命名為CIP2A-BP。通過檢測兩個獨立臨床中心的三陰性乳腺癌樣本后，發(fā)現(xiàn)由LINC00665編碼的小肽與三陰性乳腺癌的預(yù)后不良有關(guān)。體外敲除和過表達(dá)研究證實是CIP2A-BP抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而不是LINC00665。經(jīng)免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定等方法發(fā)現(xiàn)了該小肽可以與腫瘤致癌基因CIP2A結(jié)合，取代PP2A的B56γ亞基，從而釋放PP2A活性，進(jìn)而可以抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路的激活，影響下游基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和Snail等基因的表達(dá)，以此參與了三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。最后該團(tuán)隊在小鼠模型中引入CIP2A-BP基因或直接注射CIP2A-BP發(fā)現(xiàn)可減少肺轉(zhuǎn)移并提高總體生存率。總之，該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌中，轉(zhuǎn)化生長因子β經(jīng)下調(diào)CIP2A-BP的翻譯，通過CIP2A/PP2A和PI3K/AKT/NF-κB信號通路誘導(dǎo)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，CIP2A-BP可作為一種抗腫瘤肽在未來治療中發(fā)揮作用。

3 lncRNA編碼肽與肝癌

Pang等[24]利用抗核糖體蛋白S6(RPS6)抗體對4種癌細(xì)胞系進(jìn)行RNA免疫沉淀并測序，并對最顯著富集的lncRNA進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測和編碼潛力評估，通過公共數(shù)據(jù)庫分析所選lncRNA在肝癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LINC00998上調(diào)顯著，且其表達(dá)水平與肝癌患者的生存率顯著相關(guān)。隨后其利用Uniprot基于同源性預(yù)測LINC00998可能編碼一個含有59個氨基酸的肽，并命名為SMIM30。通過構(gòu)建載體、質(zhì)譜分析、Western blot實驗及熒光成像等實驗證實了SMIM30的內(nèi)源性表達(dá)，并且是SMIM30，而不是LINC00998本身，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移來促進(jìn)肝癌的發(fā)生。SRC/YES1是一種酪氨酸激酶，該團(tuán)隊通過實驗證實SMIM30是SRC/YES1膜錨定和激活狀態(tài)的重要適配子。通過轉(zhuǎn)錄組測序手段等驗證SMIM30激活下游MAPK通路，利用生物信息學(xué)手段測SMIM30啟動子區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子C-Myc的結(jié)合位點。進(jìn)一步實驗證實了C-Myc轉(zhuǎn)錄調(diào)控肝細(xì)胞癌細(xì)胞中SMIM30的表達(dá)，SMIM30激活MAPK信號通路促進(jìn)了肝細(xì)胞癌進(jìn)展?？傊?，LINC00998編碼的SMIM30可能是肝癌新的預(yù)后指標(biāo)，并可能為肝癌治療提供一個特異性靶點。

乙型肝炎病毒慢性感染與肝癌發(fā)生密切相關(guān)[25]。Jia等[26]采用抑制消減雜交法從肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2中篩選到一個新基因，即lncRNA HBVPTPAP，用于研究HBV DNA聚合酶的反調(diào)節(jié)。據(jù)其全長序列的結(jié)構(gòu)特點，將其歸類為lncRNA。該團(tuán)隊為了進(jìn)一步識別lncRNA HBVPTPAP的編碼潛力，使用CNCI、CPAT、CPC2和PhyloCSF等在線工具分析其編碼潛力，構(gòu)建了pcDNA-ORF和pcDNA-ORF-gfp，并將其轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中，驗證編碼肽的存在。進(jìn)一步對HBVPTPAP基因過表達(dá)或敲低研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)HBVPTPAP基因過表達(dá)時，凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，說明HBVPTPAP基因可顯著促進(jìn)凋亡；當(dāng)HBVPTPAP基因過表達(dá)時，細(xì)胞色素C表達(dá)增加，pSTAT3相對表達(dá)降低，Bax/Bcl-2值降低。上述結(jié)果表明，在線粒體參與下，HBVPTPAP可能通過抑制pSTAT3活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

4 lncRNA編碼肽與頭頸癌

大多數(shù)頭頸癌起源于口腔、咽、喉的黏膜上皮，統(tǒng)稱為頭頸鱗狀細(xì)胞癌。目前，臨床上頭頸鱗狀細(xì)胞癌的治療方法包括手術(shù)和放療、化療等[27]。Li等[28]利用生物信息學(xué)手段篩選出差異表達(dá)的lncRNA RP11-469H8.6，發(fā)現(xiàn)其存在一個潛在的sORF，可能編碼一個含有51種氨基酸的未報道微肽。通過免疫熒光、CRISPR/cas9介導(dǎo)的同源重組、質(zhì)譜及Western blot技術(shù)證實該微肽為內(nèi)源性表達(dá)，其在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)可抑制腫瘤進(jìn)展。又進(jìn)一步利用免疫沉淀鑒定了水通道蛋白2(AQP2)、整合素β4(ITGβ4)和Septin 2(SEPT2)可能與該微肽相關(guān)。后通過酵母雙雜交實驗和qPCR等發(fā)現(xiàn)該微肽與AQP2存在直接相互作用，且該微肽的抑制作用可能與AQP2調(diào)控ITGB4和SEPT2有關(guān)。有文獻(xiàn)報道ITGB4和SEPT2與細(xì)胞運(yùn)動和肌動蛋白細(xì)胞骨架有關(guān)[29]，將上述微肽命名為MIAC。該研究通過激光共聚焦光譜學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MIAC或分別敲除AQP2、ITGB4、SEPT2可導(dǎo)致絲狀肌動蛋白應(yīng)力纖維顯著減少。此外，分別敲除AQP2、ITGB4和SEPT2對頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移有抑制作用。綜上所述，MIAC是一種與頭頸鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展密切相關(guān)的新型肽。

5 lncRNA編碼肽與食管癌

食管鱗狀細(xì)胞癌男性發(fā)病率較高，男女發(fā)病率和病死率有2～3倍的差異，且吸煙和性激素與食管鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后相關(guān)[30]。近期一項研究發(fā)現(xiàn)，Y染色體上的一個腫瘤抑制基因與男性乳腺癌有關(guān)[31]。表明Y染色體編碼的遺傳物質(zhì)可能與男性主導(dǎo)腫瘤有關(guān)。然而，目前還沒有關(guān)于Y染色體相關(guān)的lncRNA參與食管鱗狀細(xì)胞癌的研究報道。Wu等[32]通過查找數(shù)據(jù)庫和qRT-PCR等尋找與Y染色體相關(guān)的在食管鱗狀細(xì)胞癌中差異表達(dá)的lncRNA，利用Log-rank檢驗和Kaplan-meier生存曲線分析,得出只有LINC00278在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中顯著下調(diào)，LINC00278低表達(dá)的食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存期明顯短于LINC00278高表達(dá)的食管鱗狀細(xì)胞癌患者。通過多變量分析，證實了吸煙及LINC00278低表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存期較短有關(guān)。通過免疫熒光和Western blot等多種實驗證明LINC00278可編碼一個在男性食管鱗狀細(xì)胞癌中內(nèi)源性表達(dá)和下調(diào)的小肽。通過對該小肽進(jìn)行功能實驗等發(fā)現(xiàn)，該小肽抑制了轉(zhuǎn)錄因子YY1與雄激素受體的相互作用，故將其命名為YY1BM。隨后該團(tuán)隊通過實驗證實YY1BM通過AR信號通路降低了eEF2K的表達(dá)，并且YY1BM下調(diào)顯著上調(diào)了eEF2K的表達(dá)，抑制了細(xì)胞凋亡，從而使食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞更適應(yīng)營養(yǎng)剝奪，并且吸煙減少了LINC00278的m6A修飾和YY1BM翻譯。綜上所述，LINC00278和YY1BM可以作為男性食管鱗狀細(xì)胞癌潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。

總之，現(xiàn)lncRNA編碼肽在腫瘤中的研究處于探索階段，其在不同腫瘤中的具體作用機(jī)制有待更進(jìn)一步研究。相信在不遠(yuǎn)的將來，lncRNA編碼的功能肽可在癌癥診療和預(yù)后研究方面發(fā)揮重要作用。