代謝組學在畜禽中的研究進展

葛 宇，吾斯曼·吐尼亞孜，陳 余，王 梁，齊曉龍，邢 凱，王相國，肖龍菲，郭 勇，倪和民，盛熙暉*

（1.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2.北京市畜牧總站，北京 100107）

隨著科研技術的不斷發(fā)展，繼基因組學、蛋白質組學之后，代謝組學（Metabonomics）這一新興技術已逐漸成為研究小分子代謝物的有力工具。有記錄表明，古希臘中世紀就有“尿液圖表”的廣泛使用，將尿液的顏色、氣味等情況與醫(yī)療領域相結合，此種方法的本質就是根據代謝物來進行疾病診斷[1]。1997 年，Oliver[2]通過定量分析酵母代謝產物評估基因的遺傳功能，首次將代謝水平和基因水平聯系起來。1999 年，Nicholson等提出代謝組學這一概念，其將生命體看作是一個完整的系統(tǒng)，通過對代謝物定性定量測定，以動態(tài)視角研究機體發(fā)生的生理變化和病理特征[1]。目前，代謝組學是研究生物體系（細胞、組織或生物體）受外部刺激所產生的所有代謝產物變化的一門科學[3]，其主要研究對象包括糖類、脂類、氨基酸和核苷酸等相對分子質量小于1 000 的小分子內源代謝物。

組學之間相互獨立也相互聯系，如果說基因組學告訴可能發(fā)生什么，那么轉錄組學和蛋白質組學將會告訴即將發(fā)生什么，而代謝組學則會告訴正在發(fā)生什么[2]。與其他組學相比，代謝組學具有以下優(yōu)勢：代謝組最接近生物體表型，基因變化引起蛋白質表達改變，最終會在代謝物的水平得到放大；代謝組學研究不需要進行全基因組測序或建立大量表達序列標簽的數據庫；代謝物的種類遠遠小于基因和蛋白質；代謝物的分析技術更為通用，不需要考慮物種上的區(qū)別[4-5]。在畜禽遺傳育種、營養(yǎng)、疾病診療等研究上，轉錄組學、蛋白質組學等可檢測到基因與蛋白質的變化，但很難與生物學功能建立直接聯系，而代謝組學可以將代謝物與生物表型構建直接相關性。本文對代謝組學常用的分析技術進行了總結和比較，概述了代謝組學在畜禽遺傳育種、營養(yǎng)以及動物疾病領域的研究進展，為代謝組學在畜禽動物中的應用提供參考。

1 代謝組學分析技術

代謝組學的主要分析技術是質譜（MS）和核磁共振（NMR）光譜，也有少數研究使用毛細管電泳-質譜技術，這些分析技術各具優(yōu)勢，目前應用最多的是質譜法。

1.1 NMR 技術 NMR 技術是一種原子級的分析方法，利用高磁場中原子核對射頻輻射的吸收光譜來對化合物進行鑒定。常用的有氫譜（1H NMR）、碳譜（13C NMR）和磷譜（31P NMR）3 種。NMR 技術在代謝組學的領域中有許多優(yōu)勢，它不需要復雜的樣品制備分離過程就可以進行檢測，減少對樣品的破壞性，能夠嚴格定量生物流體、細胞提取物和組織中豐富的化合物。靈敏度和分辨率是NMR 所面臨的主要挑戰(zhàn)[6]。針對這一弊端，研究人員做了許多改進工作，如使用同位素標記策略、微線圈核磁共振等。Le 等[7]應用NMR 技術分析雞的組織和生物流體，在胸肌中僅發(fā)現了23 種代謝物；而Xiao 等[8]應用1H NMR 技術對5 個不同日齡的武定雞肉質進行研究，檢測到57 種代謝物。

1.2 色譜-質譜聯用技術 代謝物的種類復雜多樣，分析技術的高分辨率和高靈敏度是代謝組學研究的有力保障。質譜與氣相色譜（GC）或液相色譜（LC）的結合可以分析檢測出多種代謝物，是試驗檢測的強大工具。

1.2.1 氣相色譜-質譜技術（GC-MS） GC-MS 是將氣相色譜與質譜的優(yōu)點相結合，即高效分離能力和豐富結構信息融合，適用于分析揮發(fā)性或半揮發(fā)性的小分子化合物。GC-MS 分析較為穩(wěn)定，靈敏度高，使用數據庫和軟件可方便快速地檢測代謝物。根據其氣質檢測的原理，要求被檢測的物質具有一定的熱穩(wěn)定性，才可以進行后續(xù)的物質氣化分離檢測。相對核磁共振技術，此種方法在樣品制備較為費時費力且難以進行新的化合物鑒定。曾茂茂[9]用GC-MS 檢測健康人的血液樣本，分析出血漿中氨基酸、糖、脂肪等內源代謝物。劉艷麗等[10]在雞的原代肝細胞中添加葉酸培養(yǎng)，采用GC-MS 檢測到31 個代謝物含量發(fā)生顯著變化，并發(fā)現葉酸可促進雞原代肝細胞的脂類分解，也可參與糖、脂類及氨基酸的代謝通路。

1.2.2 液相色譜-質譜技術（LC-MS） LC-MS 具有更高的靈敏度，更廣泛的代謝物檢測范圍和多樣化的方法，對于物質的性質要求較少，大多數能被離子化的物質都可以使用液質的平臺進行分析檢測。在近5 年的代謝組學研究中，LC-MS 分析技術的應用已經超過所有檢測技術的總和，占到65% 左右[11]。Kim 等[12]應用LC-MS 技術評估酮康唑（KCZ）在小鼠和人類中的代謝譜，共鑒定出28 種代謝物，并首次新發(fā)現了咪唑環(huán)、哌嗪環(huán)和N-乙?；?1 種代謝物。該研究豐富了對于KCZ 代謝途徑的理解，并在藥物代謝和藥物誘導的毒性之間建立聯系。

除此之外，超高性能液相色譜（UPLC）和高分辨率質譜技術在分離度、通量和靈敏性方面更為強大[13]，可以獲得1 000 種代謝物的數據。以上幾種方法得到的數據會存在一定差異，需要結合樣本具體類型和所選模型中重點代謝物的特點選擇最理想的檢測方法，才能達到理想的試驗效果。

2 代謝組學在畜禽中的研究進展

明確解析動物體內的代謝機制，保證畜禽健康與高效生產，是研究者們始終追求的目標。闡明生物體的代謝機制是一個十分復雜的過程，常常因為技術落后而難以達到理想的效果。代謝組學的蓬勃發(fā)展不僅緩解了當前技術上的瓶頸，也進一步證實其在畜禽育種、營養(yǎng)、疾病等領域具有巨大的潛力[14]。

2.1 代謝組技術在畜禽育種方面的應用 代謝組技術可以對動物機體的代謝物進行動態(tài)的跟蹤分析，幫助解析表型與遺傳、環(huán)境等因素的關系，為經濟性狀的改良和育種提供表型數據[15]。

目前，研究人員主要應用代謝組技術篩選與畜禽經濟性狀相關的重要標志物和代謝途徑。例如，Wu 等[16]通過測定血清代謝組鑒定與乳蛋白產量相關的關鍵代謝物，共鑒定出36 個差異代謝物，其中馬尿酸、煙酰胺和壬酸是乳蛋白產量的關鍵代謝物，可作為評測乳蛋白產量的潛在標志物。D'Alessandro 等[17]結合代謝組與蛋白質組方法研究牛肉嫩度的標志代謝物，發(fā)現糖酵解酶ENO1、伴侶蛋白HSPA8、和抗氧化酶SOD 的蛋白水平和代謝水平對牛肉嫩度具有較好的預測作用。公牛的繁殖力對生產至關重要，生育能力與精子內的代謝特征關系密切。Menezes 等[18]試驗預測γ-氨基丁酸、氨基甲酸酯、苯甲酸、乳酸和棕櫚酸可作為公牛生育力的潛在生物標志物；Evans 等[19]在冷凍公牛精子的研究中發(fā)現花生四烯酸和油酸與氧化保護過程有關，二者揭示了脂肪酸對精子質量的影響作用，為預測種公牛受精潛力提供基礎。Welzenbach 等[20]利用多組學數據解析豬肉滴水損失的功能通路，共注釋了126 個代謝物和35 個蛋白質，富集到10 條代謝途徑，其中鞘脂代謝和糖酵解作用對豬肉滴水損失具有顯著作用。D'Alessandro 等[21]研究卡塞塔納和大白豬2 個品種的pH、系水力和肉色等肉質參數，發(fā)現糖酵解酶水平和乳酸積累與卡瑟塔納豬的pH 緩慢下降有關，大白豬中丙酮酸激酶1 和原肌凝蛋白的水平與屠宰后24 h 的系水力和肉色有關，甘油3-磷酸和肌酸激酶M 與卡瑟塔納豬的脂肪形成加重和糖酵解速度減慢有關。

同時，代謝組技術可用于數量性狀的遺傳參數估計。例如，Nogi 等[22]分析日本黑牛的脂肪酸組成，并與胴體性狀進行相關分析，發(fā)現油酸、單不飽和脂肪酸與牛肉的大理石花紋呈正相關，表明脂肪品質和胴體性狀可以同時進行遺傳改良。Lopez 等[23]發(fā)現單個脂肪酸濃度的遺傳度估計值在0.14～0.45，脂肪、蛋白質和乳糖的遺傳力較高，遺傳力估計值在0.17～0.41，表明在可以通過選擇性育種來滿足市場需求。

代謝組技術也可用于動物品種鑒定。Bovo 等[24]靶向檢測180 種代謝物，發(fā)現多種代謝物在意大利大白豬和意大利杜洛克2 個品種間存在差異，例如乙酰鳥氨酸和鞘磷脂，為研究兩個品種豬之間的生物學差異提供了重要的生物標志物。同時，科研人員發(fā)現雞[25]、豬[24,26]、牛[27-28]等動物中不同品種間亦存在著差異代謝物，這些代謝物或可作為品種鑒定的生物標記物。

2.2 代謝組技術在動物營養(yǎng)方面的應用 代謝組技術可以探索營養(yǎng)與代謝的復雜關系，調整最適的營養(yǎng)供給，使動物達到最佳健康狀態(tài)和生產性能。

代謝組技術在雞的營養(yǎng)研究中已有若干應用。Beauclercq 等[29]應用代謝組學技術分析雞血清代謝組，篩選消化效率的代謝標志物，發(fā)現脯氨酸、富馬酸鹽、葡萄糖與氮校正表觀代謝能（AMEn）關聯最強。姬舒云[30]對艾拔益加肉雞進行不同水平的蘇氨酸飼喂，結果表明NRC 標準的125% 添加組與標準推薦量添加組之間差異最為顯著，代謝組分析發(fā)現兩組間存在6 個差異顯著的代謝產物。有研究表明，母雞飼喂發(fā)酵飼料與混合飼料后，赤蘚糖醇、蘇糖醇和尿素這3 種蛋黃代謝物與12 種血清代謝物含量顯著改變，證明飼料會影響卵黃及血清的代謝物，通過控制家禽營養(yǎng)水平或許可以特定改變蛋中的成分[31]。

研究人員應用代謝組技術在牛的營養(yǎng)方面也開展了大量研究。Carrillo[32]團隊通過代謝組譜和轉錄組數據證實，在不同飼喂系統(tǒng)下養(yǎng)殖的肉牛，其生化指標及營養(yǎng)水平均會產生較大差異。Novais 等[33]應用代謝組技術分析牛的血清代謝組，發(fā)現視黃醇代謝途徑與肉牛飼料轉化率存在關聯性，表明肉牛飼料轉化率與血清代謝組之間可以建立聯系，今后可將標志代謝物用于反芻動物飼料轉化率的評估。

在豬的營養(yǎng)研究方面，Huntley 等[34]利用代謝組技術研究木糖在豬體的代謝情況，證實D-蘇糖醇是木糖的主要尿代謝產物，豬可以代謝木糖，但代謝效率低于與葡萄糖。朱坤等[35]基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜的代謝組學技術，探討豬采食發(fā)酵飼料后代謝產物的變化，發(fā)現試驗組育肥豬血清黃嘌呤、丁子香酚、丙烯酰胺和對香豆酸的含量顯著升高，L-焦谷氨酸含量顯著降低，表明以上物質對于改善應激作用、減輕自由基對機體的損傷有重要作用。

2.3 代謝組技術在動物疾病方面的應用 在畜禽生產中，疾病會嚴重影響動物的生長發(fā)育，進而降低經濟收益。代謝組技術可以捕捉到動物發(fā)病前后代謝物含量的變化，在疾病的預防及診療方面提供新的方法。目前，代謝組技術主要應用于雞、牛、豬等經濟動物的疾病領域。

Boerboom 等[36]使用非靶向代謝組技術鑒定與肉雞白條紋肌肉形成有關的生物學途徑，發(fā)現脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)、精氨酸代謝和牛磺酸代謝等代謝途徑紊亂導致了肌肉組織缺氧，繼而引發(fā)肌肉缺陷。Shi 等[37]對肉雞腹水綜合征進行了多組學的研究，發(fā)現早期肉雞腹水綜合征主要由甘油磷脂類代謝物氧化引起，二羥基丙酮或可作為低溫腹水綜合征的潛在標志物，深度解析了肉雞腹水綜合征的發(fā)病機理。Liu 等[38]應用代謝組學與蛋白質組學結合的方法研究葉酸對雞肝臟的影響，鑒定出43 種差異代謝物和63 種差異蛋白，發(fā)現添加葉酸后雞原代肝細胞的抗氧化功能、碳水化合物和氨基酸代謝受到顯著影響，初步闡明了葉酸對雞肝臟的影響機理。

奶牛酮病是生產中的高發(fā)病之一，該疾病會嚴重影響奶牛產奶量及牛場的盈利能力。Zhang 等[39]利用代謝組技術發(fā)現奶牛正常健康組、亞臨床酮癥組及臨床酮癥組的血漿代謝物存在差異，發(fā)現的酮癥生物標志物在臨床診斷、預后和預防酮癥方面具有新的應用和意義。Shahzad 等[40]應用代謝組氣相色譜-質譜聯用技術和全轉錄組微陣列研究產前奶牛肝臟代謝組和轉錄組與奶牛產后酮癥的關聯，通過差異代謝物和差異基因的挖掘，為奶牛產后酮癥的發(fā)病機制提供新的思路與方法。Lu等[41]利用非靶向代謝組學和蛋白質組學技術對不同能量平衡狀態(tài)的泌乳期奶牛乳汁進行檢測，發(fā)現處于重度負能量平衡的奶牛乳汁中急性期反應蛋白、不飽和脂肪酸和半乳糖含量較高，正常狀態(tài)的奶牛乳中膽固醇及相關蛋白、胃抑素濃度較高，為評估負能量平衡指標奠定了理論基礎。Getty 等[42]將代謝組技術應用于仔豬代謝紊亂研究中，發(fā)現精氨酸飼喂改變了仔豬的整體血液代謝物譜，主要涉及與能量、氨基酸、核苷酸和脂質通路相關的代謝物，同時具有對糖代謝等異常代謝的糾正作用。

3 結語與展望

代謝組學自提出至今經歷了二十多年的完善與豐富，已經可以應用于植物、疾病診斷、藥物設計、食品質檢等領域。然而，代謝組學仍存在一些問題亟待解決，如目前的代謝物提取及分析技術無法涵蓋所有代謝物，需要針對樣品選擇最合適的分析及檢測平臺；其次，代謝組學的數據分析是研究重點，需要利用生物信息學、多元統(tǒng)計學等方法進行挖掘，但目前相關的研究方法不夠成熟，仍有待進一步的完善；另外，數據庫的局限性也是限制代謝組學發(fā)展的主要因素，需要及時完善、更新代謝庫的檢索功能。

目前代謝組技術在動物上的應用較少，但是隨著其技術的日趨臻熟，將會成為畜禽營養(yǎng)、育種和疫病等研究的有力工具。代謝組學的進步也將會推動多組學聯合分析的發(fā)展，研究方法將從表觀整體水平到不同層級的整合分析，對試驗對象展開全面研究，從而闡名生物體復雜的調控機制。