丁酸梭菌介導(dǎo)TLRs/NLRs信號通路調(diào)控仔豬腸道損傷分子機制的研究進展

李玉鵬， 李?；?， 尚智援， 竇彩霞， 梁世岳， 席燕燕， 喬家運

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津西青300381；2.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津西青300384；3.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津西青300387；4.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002）

小腸在吸收營養(yǎng)物質(zhì)的同時，也起到屏障的作用，第一線抵御進入體內(nèi)的內(nèi)源性和外源性有害物質(zhì)（Judkins等，2020；Liu等，2012）。然而，許多因素，如生理變化的感染，可導(dǎo)致腸黏膜損傷和功能障礙。斷奶是仔豬繁殖過程很重要的一個過渡階段，與豬的組織學(xué)和生物化學(xué)變化有關(guān)（Qiao等，2015），這些生理應(yīng)激反應(yīng)可增加腸上皮通透性（胡玥和呂賓，2017；Yang等，2015），有助于腸毒素大腸桿菌（ETEC K88）和內(nèi)毒素脂多糖進入黏膜組織或從腸道轉(zhuǎn)移到機體循環(huán)系統(tǒng)，致使機體全身產(chǎn)生炎癥反應(yīng)（Bischoff等，2014），過度的炎癥反應(yīng)會損害腸上皮功能及其完整性（Liu等，2012）。Toll樣受體（TLRs）屬于模式識別受體，TLR2和TLR4是Toll樣受體的2個受體，分布在細胞膜上，參與機體免疫應(yīng)答（李?；ǖ?，2019）。NOD樣受體是先天性免疫中的一大類模式識別受體（PAMPs），其中NLRP3、NLRP6和NLRP12作為腸道炎癥的負反饋因子在小腸中高度表達，且在維持黏膜屏障功能和微生物的共生平衡中發(fā)揮重要的作用（林巧衛(wèi)等，2019；Chen，2014）。

1 丁酸梭菌的特征、營養(yǎng)作用及應(yīng)用

1.1 丁酸梭菌的特征 丁酸梭菌（Clostridium butyricum），又稱宮入菌、酪酸梭菌，細菌學(xué)分類屬于梭菌屬，是一種嚴格厭氧革蘭氏陽性芽孢桿菌（Wu等，2017）。丁酸梭菌是人和動物腸道的正常菌群，廣泛存在于土壤和酸奶中。丁酸梭菌能夠產(chǎn)生芽孢，具有抵抗外界相對惡劣環(huán)境的理化性質(zhì)，耐高溫，90℃熱處理10 min不會失活，在體內(nèi)能耐受胃液、膽汁酸和消化酶的作用，丁酸梭菌只對少量抗生素新生霉素、萬古霉素和四環(huán)素等敏感，對其他抗生素具有很強的耐藥性，已經(jīng)成為新一代芽孢益生菌。

1.2 丁酸梭菌的營養(yǎng)作用 丁酸梭菌產(chǎn)生的氨基酸、B族維生素和維生素K，能促進維生素E的吸收，補充機體必要的營養(yǎng)物質(zhì) （Storari等，2016）。丁酸梭菌還可以分泌一些酶類，如淀粉酶、糖苷酶、纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等，在這些酶的作用下，底物發(fā)酵成葡萄糖、麥芽糖等，有助于機體營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收（Duan等，2017）。此外，丁酸梭菌可以降解益生元產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸，能夠在胃腸道中被機體直接吸收（Shang等，2016）。

1.3 丁酸梭菌在畜禽飼糧中的應(yīng)用 目前在韓國，丁酸梭菌制劑已經(jīng)作為飼料添加劑被應(yīng)用于牛、豬和家禽飼糧中。我國農(nóng)業(yè)部雖然在2009年7月批準(zhǔn)丁酸梭菌制劑可以作為微生物飼料添加劑使用，但是至今其在動物飼料中還未被普遍應(yīng)用。我國市面上銷售的微生態(tài)制劑產(chǎn)品中，以乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌為主，而丁酸梭菌的產(chǎn)量卻較少。飼糧中添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌配伍的復(fù)合益生菌可以提高生長肥育豬的平均日增重、降低料肉比，并提高養(yǎng)分表觀消化率（Lan等，2017）。丁酸梭菌既能單獨作為飼料添加劑使用，也能與乳酸菌、芽孢桿菌和雙歧桿菌等益生菌復(fù)配使用，增強該類產(chǎn)品的功效。一株具有產(chǎn)抗菌肽能力的丁酸梭菌飼喂斷奶仔豬后，能夠替代抗生素、達到高劑量氧化鋅的使用效果（王騰浩，2015）。在肉雞飼糧中添加丁酸梭菌，也可顯著提高其體重和平均日增重（Zhang等，2016）。李玉鵬等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌飼喂仔豬，能夠提高仔豬的平均日增重，但是對料肉比的影響并不顯著。

2 丁酸梭菌對仔豬腸道功能的調(diào)節(jié)作用

2.1 丁酸梭菌調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系 黏附是細菌對細胞產(chǎn)生作用的重要步驟，益生菌能夠抑制致病菌的黏附來降低其增殖，限制其對宿主的侵害，發(fā)揮益生菌的抑菌功能（Scalfaro等，2017）。丁酸梭菌通過產(chǎn)生酸性物質(zhì)、抗菌物質(zhì)和致病菌競爭黏附位點等多種作用機制改善腸道菌群（李楊，2018）。脂磷壁酸在細菌黏附過程中發(fā)揮重要作用，研究表明，丁酸梭菌脂磷壁酸成分，能抑制拜氏梭菌和大腸桿菌對人結(jié)腸癌細胞以及腸道細胞的黏附（Gao等，2011）。楊華等 （2019）研究表明，與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）組相比，不同濃度丁酸梭菌干預(yù)后，顯著抑制了ETEC產(chǎn)黏附基因FaeG與腸毒素基因estA、estB的表達。李玉鵬等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌飼喂斷奶仔豬后，可降低空腸和回腸中大腸桿菌的數(shù)量，提高空腸和回腸中乳酸桿菌數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系。

2.2 丁酸梭菌調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白 腸道黏膜直接接觸外界，其屏障功能的正常發(fā)揮直接決定著腸道健康。腸上皮細胞間緊密連接形成的屏障由絨毛與隱窩構(gòu)成，有利于機體營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和防御功能的正常發(fā)揮 （Zhang等，2016）。緊密連接位于腸上皮的頂端，是腸上皮細胞間最重要的連接方式，在維持腸上皮細胞極性和調(diào)節(jié)腸黏膜屏障通透性中發(fā)揮重要作用，是參與控制細胞旁滲透的關(guān)鍵分子。緊密連接由多個蛋白組成，其中閉鎖蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）和閉合小環(huán)蛋白（ZO）是最為重要的緊密連接蛋白（Jin等，2020）。Zhang等（2016）報道，丁酸梭菌飼喂肉雞后，可以增加空腸絨毛高度，降低空腸隱窩深度，降低血清中內(nèi)毒素和二胺氧化酶濃度，提高肉雞腸道屏障功能。深入研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌增加腸上皮微絨毛長度、降低跨膜通透性的功能與miR-200c蛋白有關(guān)（Xiao等，2017）。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌飼喂斷奶仔豬后，增加了仔豬腸道緊密連接蛋白Claudin-1、ZO-2的mRNA表 達 （李 玉 鵬 等，2017），降低了血清中二胺氧化酶活性和D-乳酸濃度，提高了仔豬的腸道屏障功能（李?；ǖ龋?019）。

2.3 丁酸梭菌調(diào)節(jié)腸道模式識別受體Toll樣受體（TLRs）和NOD樣受體（NLRs）廣泛存在于腸黏膜上皮中，能夠識別多種病原體（細菌、病毒、真菌等）和機體危險信號（Elena等，2017；Song-Zhao等，2014；Zambetti等，2014），激活免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過NF-κB和MAPK等信號通路啟動促炎性細胞因子IL-8和TNF-α等的表達（Song-Zhao等，2014；Zambetti等，2014）。模式識別受體如核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域NOD樣受體（NLRs）是腸上皮先天免疫的重要調(diào)節(jié)因子，NLRs家族成員中 的NLRP3、NLRP6和NLRP12等可參與細胞漿內(nèi)炎性體的組裝，通過半胱氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）等信號通路促進白細胞介素1（IL-1）家族細胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的成熟和分泌（Ruiz等，2017）。適量的促炎性細胞因子能夠促進腸組織損傷部位炎性細胞的趨化和浸潤，有利于免疫細胞產(chǎn)生抗炎性細胞因子、一氧化氮和抗菌肽等抗感染物質(zhì)，吞噬和清除病原微生物，促進腸組織再生，保護腸黏膜組織；反之，則可以持續(xù)地損傷腸細胞和組織，促使腸道組織異常重構(gòu)，最終導(dǎo)致腸道通透性增加，腸道屏障功能受損。

2.3.1 Toll樣受體（TLRs）TLRs相關(guān)的信號通路根據(jù)髓樣分化蛋白88（MyD88）分為MyD88依賴性和非依賴性兩種，這兩種通路最終都會激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）蛋白的表達。TLR-4及其信號傳導(dǎo)途徑上的相關(guān)分子髓樣分化蛋白-2（MD-2）、MyD88和NF-κB是細菌脂多糖（LPS）刺激傳導(dǎo)的一種跨膜信號傳導(dǎo)通路，在介導(dǎo)革蘭氏陰性菌感染的宿主反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用（Haghjooy-Javanmard等，2018）。體外試驗表明，丁酸梭菌脂磷壁酸能夠識別并激活腸上皮細胞中的TLR2，通過髓樣分化因子88的非依賴途徑，促進適量IL-6和TNF-α的分泌（Gao等，2012）。單核巨噬細胞 （MMs）、樹突細胞（DCs）等可以通過其膜表面表達的TLRs感受入侵病原體的PAMPs刺激后，通過胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，最終由進入胞核內(nèi)的NF-κB啟動核內(nèi)相關(guān)基因表達，產(chǎn)生相應(yīng)的mRNA，從而合成細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α及IFN-γ，最終釋放到胞外（Yang等，2015），引起粒細胞、巨噬細胞趨化聚集，毛細血管通透性的增加，淋巴細胞浸潤等炎癥反應(yīng)，發(fā)揮早期免疫應(yīng)答的效應(yīng)。丁酸梭菌可以借助細胞壁及裂解后的菌體成分與相應(yīng)的受體結(jié)合，引起固有免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌磷壁酸可引起HT-29細胞的炎癥反應(yīng)，但同時也增加了炎癥抑制因子的分泌，從而避免由炎性因子的過度表達引起的細胞損傷（Wang等，2016）。在小鼠結(jié)腸炎相關(guān)癌癥模型中，丁酸梭菌miR-200c蛋白調(diào)節(jié)促炎性細胞因子TNF-α和IL-12的表達（Xiao等，2017）。用丁酸梭菌飼喂太平洋白蝦后，能夠提高其腸道中Toll樣受體、熱休克蛋白70和一氧化氮的表達（Duan等，2017）。王柳懿等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌提高了斷奶仔豬腸黏膜中TLR2、TLR4和TLR5的表達水平，促進了IL-10、IL-8和TNF-α的分泌，激活了仔豬腸道黏膜免疫反應(yīng)。這些研究目前還僅停留在模式識別受體和細胞因子的變化方面，而有關(guān)丁酸梭菌對仔豬TLRs信號通路影響的研究尚不系統(tǒng)，仍然需要深入研究。

2.3.2 NOD樣受體（NLRs）NLRs是仔 豬先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，充當(dāng)細胞內(nèi)受體，檢測病原體和組織損傷引起的內(nèi)因性分子加工，其中的NLRP3、NLRP6和NLRP12作為腸道炎癥的負反饋因子在小腸中高度表達，且在維持黏膜屏障功能、炎癥穩(wěn)態(tài)和微生物的共生平衡中發(fā)揮重要的作用（林巧衛(wèi)等，2019；李玉鵬等，2017；Chen等，2014）。Li等（2018）研究表明，在致病性大腸桿菌攻毒的試驗仔豬飼糧中補充丁酸梭菌，能保護腸道的完整性，且通過抑制非鱗狀細胞獨立性，降低腸道NLRP3信號通路中相關(guān)促炎性細胞因子的表達。NLRP6缺陷小鼠與野生型小鼠相比，致病菌可以穿透小鼠更深的上皮隱窩，加重腸上皮損傷 （Wlodarska等，2014）。NLRP12缺陷型小鼠感染減毒疫苗株鼠疫菌后，血清中IL-1β和IL-18減少，脾臟細菌載量增加，小鼠死亡率也增加 （Vladimer等，2012）。由此可見，NLRPs在維持腸道菌群平衡、促進腸黏膜修復(fù)、提高腸道屏障和黏膜免疫功能中發(fā)揮著重要作用。目前，關(guān)于益生菌調(diào)節(jié)仔豬腸道NLRPs方面研究的報道非常少。Wu等（2016）用鼠李糖乳桿菌處理原代牛乳腺上皮細胞后，發(fā)現(xiàn)該菌能夠致弱致病性大腸桿菌誘導(dǎo)的NLRP3炎性體的活化，降低IL-1β和IL-18的mRNA表達，減輕了細胞損傷。Li等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，用丁酸梭菌飼喂斷奶仔豬能夠提高腸黏膜NLRP3和NLRP6的mRNA表達水平，同時抑制ETEC K88誘導(dǎo)的NLRP3及其下游信號通路Caspase-1等相關(guān)基因的表達。由此表明，這些分子在維持宿主-病原體相互作用和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。但是，有關(guān)丁酸梭菌對NLRPs信號通路影響的研究還鮮見更深入、更系統(tǒng)的報道，仍然需要繼續(xù)深入研究。

3 存在的問題

盡管目前在丁酸梭菌的特征、營養(yǎng)作用及畜禽飼糧中的應(yīng)用效果等方面已經(jīng)開展過較深入的研究，但是仍存在一些問題有待解決：（1）丁酸梭菌調(diào)節(jié)腸道屏障方面的研究仍較少；（2）丁酸梭菌調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫通路方面的研究尚不系統(tǒng)；（3）對丁酸梭菌調(diào)節(jié)致病性大腸桿菌等有害菌感染仔豬腸道損傷的分子機制認識不透徹等。